High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Técnicas de mineração de genomas e metagenomas se desenvolveram rapidamente nos últimos anos, assim como estratégias de médio e alto rendimento para clonagem e expressão de enzimas recombinantes. Além disso, os recursos de bioinformática e depósitos associados, como o (CAZy)^1,2, expandiram-se muito. No entanto, existem desafios consideráveis inerentes à exploração da diversidade enzimática microbiana para fins industriais e a determinação empírica das atividades enzimáticas tornou-se um sério gargalo. Por exemplo, estima-se que, usando os métodos atuais, podemos prever com segurança as atividades de não mais do que 4% das proteínas dentro do banco de dados CAZy. Embora existam vários métodos disponíveis para monitorar as atividades enzimáticas, todos eles têm algumas limitações. Técnicas bem estabelecidas baseadas em cromatografia combinada com espectrometria de massas estão disponíveis para avaliar as atividades dos fragmentos oligoméricos da glicosil hidrolase (GH)^3,4. No entanto, essas abordagens são trabalhosas e geralmente de baixo rendimento. Métodos baseados na medição de açúcares redutores, como os ensaios de ácido dinitrosalicílico⁵ e Nelson-Somogyi⁶, são amplamente utilizados para avaliar as atividades do GH. No entanto, esses ensaios têm rendimento limitado e podem ser propensos a reações colaterais. Substratos polissacarídeos cromogênicos individuais, como a reticulação da azurina (AZCL), são amplamente utilizados para determinação das atividades enzimáticas, mas a compra de todos os substratos separadamente e a distribuição manual dos pós do substrato dentro da placa de ensaio pode ser complicado e caro⁷.

Desenvolvemos uma nova geração de substratos de hidrogel de polímero cromogênico (CPH) baseados em corantes de clorotriazina que, quando usados em conjunto com uma placa de filtro de 96 poços, formam um sistema de ensaio de alto rendimento. Foram desenvolvidos substratos adicionais de Biomassa Cromogênica Insolúvel (ICB) que fornecem informações sobre a disponibilidade de substrato em misturas poliméricas complexas, como as existentes na biomassa lignocelulósica. Cada substrato pode ser produzido em uma das quatro cores, e substratos de cores diferentes podem ser combinados em um único poço. Neste protocolo é mostrado que esta metodologia pode ser aplicada a uma ampla variedade de polissacarídeos e proteínas e o potencial para triagem de GHs, polissacarídeos líticos monooxigenases (LPMOs) e proteases. Protocolos específicos são fornecidos para o uso de placas de 96 poços e resultados representativos ilustram a alta eficiência dos kits de substrato CPH e ICB como ferramentas para triagem enzimática.

Uma vantagem significativa dos kits de ensaio descritos, independentemente do substrato, é que os kits estão prontos para uso em 15 minutos, após a etapa de ativação. Isso elimina a necessidade de montagem demorada do ensaio a partir de materiais de substrato brutos, como é o caso de alguns outros métodos⁷. Os substratos CPH e ICB têm excelente armazenamento (pelo menos um ano à temperatura ambiente), pH e estabilidade de temperatura ⁸ e não requerem equipamento especializado ou treinamento. Os ensaios CPH ou ICB são baseados em uma placa filtrante de 96 poços dentro da qual a reação com a enzima é conduzida. Se a enzima estiver ativa com um determinado substrato, oligômeros corados solúveis são gerados, produzindo um sobrenadante colorido que pode então ser filtrado em uma placa regular de 96 poços transparentes usando um coletor de vácuo ou uma centrífuga ⁸.

Os substratos são tingidos com corantes de clorotriazina que absorvem na faixa do espectro visível (VIS) e cores individuais (vermelho, azul, amarelo e verde) podem ser resolvidas usando regressão linear se diferentes substratos CPH de cores diferentes forem misturados em um único poço, e a enzima atua em mais de um substrato. A placa resultante com os sobrenadantes pode ser medida usando um leitor de placa de microtitulação padrão capaz de medir a absorbância na faixa VIS. A mistura de diferentes substratos com cores diferentes em um poço aumenta o rendimento do sistema de ensaio, para um total de 384 experimentos em uma placa de 96 poços (4 substratos diferentes de cores diferentes por poço).

CPH fornecem uma ferramenta valiosa para avaliar a atividade específica de uma enzima, enquanto os substratos ICB são usados para avaliar a capacidade de uma enzima de digerir um componente no contexto de misturas complexas de substratos que as enzimas geralmente encontram na biomassa. Embora os substratos ICB não forneçam informações sobre as especificidades enzimáticas individuais, eles são, no entanto, ferramentas úteis para avaliar o desempenho comercial de enzimas, coquetéis ou caldos.

1. Cromogênico Ensaio com CPH Substratos num formato de placa de 96 poços

1. A activação do kit de ensaio de placa
   1. Activa o filtro de 96 poços (contendo azul CPH-xilano) placa kit de ensaio (Lista de Materiais) por adição de uma solução de 200 ul de activação (obtido com o kit) para cada poço, seguido de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente sem agitação.
   2. Aplicar vácuo utilizando um colector de vácuo (com o bloco espaçador no interior e qualquer padrão, transparente placa de 96 bem como uma placa de recolha) para remover a solução de activação existente. É também possível usar um centrifugar a 2700 xg durante 10 min para este passo, em vez de o colector de vácuo.
   3. Lavar os substratos CPH pela adição de 100 ul de água estéril e aplicar vácuo (ou a força centrífuga) para remover o estabilizador. Repita este passo mais duas vezes e as placas estão agora prontos para uso.
2. reacção enzimática
   NOTA: Sempre inclua tampãosozinho como um controlo negativo e, se possível, enzimas anteriormente caracterizadas como controlos positivos. Utilize um número estatisticamente apropriado de repetições. Os substratos CPH são estáveis ​​entre pH 3,0-10,0 e o volume total de solução de enzima a extremidade do tampão em cada poço não deve exceder 180 ul. extracto de planta ou caldo de cultura também pode ser usado em vez de solução de enzima purificada.
   1. Adicionar 150 ul de 100 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,5 e 5 ul de solução -cellulase endo (para uma concentração final de 1 U / ml) a cada poço da placa de kit de ensaio.
   2. Coloque a placa produto (uma placa clara-bem compatível com o leitor de microtitulação de placa) por baixo da placa kit de ensaio para recolher qualquer vazamento potencial da placa de reacção durante a agitação.
   3. Incubar a placa kit de ensaio a 25 ° C durante 30 minutos num agitador horizontal a 150 rpm.
      NOTA: a reacção de mistura na placa kit de ensaio durante a incubação é crucial para a obtenção de uma consistente e Reproresultado ducible. substratos CPH são estáveis ​​até 90 ° C. O tempo de incubação deve ser aumentada até 24 horas ao testar caldos de cultura contendo concentrações desconhecidas de enzima com os substratos CPH. Note-se que os tempos de incubação apropriados dependem da actividade da enzima (s), mas em geral, se não houver qualquer actividade detectável dentro de 24 horas, é provável que a enzima não degrada o substrato testado. Uma enzima activa é degradar os polissacáridos insolúveis cromogénicos do substrato CPH em oligossacáridos cromogénicos solúveis, que são visíveis na forma de sobrenadante de cor.
   4. Coloque a placa produto limpo no interior do tubo de vácuo com o bloco espaçador dentro.
   5. Colocar a placa de kit de ensaio no topo e aplicar vácuo (pressão negativa máxima de -60 kPa). É também possível usar um centrifugar a 2700 xg durante 10 min.
      NOTA: O filtrado contendo os oligossacarideos coloridas como produto de reacção é agora na placa produto para análise posterior ⁸
3. Detecção e quantificação
   1. Verificar que o volume de líquido em cada poço da placa de produto é aproximadamente o mesmo através de inspecção visual.
   2. Ler a absorbância da placa de coleta em 595 nm para o azul CPH-xilano usando um leitor de placas.
   3. Ao fazer a análise dos dados, subtraia o buffer de somente valores de controlo negativo a partir dos valores dos poços em que foi adicionada uma enzima. Calcular o valor médio e o erro padrão das médias (SEM) das cavidades replicadas ^8.

2. Cromogênico Ensaio com ICB Substratos em um formato de 96 poços

1. reacção enzimática
   1. Adicionar a 100 mM de tampão de acetato de sódio 150 ul, pH 4,5 e 5 ul de 31 U / ml de endo -xylanase solução para cada poço da placa de kit de ensaio contendo palha de trigo ICB-vermelho (concentração final de enzima no poço: 1 U / ml) .
      NOTA: As placas de kit de ensaio (filtro de 96 poços plates contendo substratos ICB) são fabricados conforme descrito na literatura (veja Lista de Materiais). Os substratos de ICB são estáveis ​​em soluções tampão com uma gama de pH entre pH 3,0 a 10,0. Sempre incluem tampão por si só como controlo negativo, as enzimas comerciais como um controlo positivo e usar um número estatisticamente apropriado de réplicas.
      1. Não activar os substratos ICB como a placa de substrato CPH, mas remover o estabilizador por lavagem três vezes com 100 ul de água seguido por filtração a vácuo ou centrifugação.
   2. Coloque a placa produto por baixo da placa de substrato para recolher qualquer vazamento potencial da placa de substrato durante a agitação.
   3. Incubar a reacção a 25 ° C com agitação a 150 rpm durante 2 h.
      NOTA: Uma enzima ativa é degradar os polissacarídeos cromogénicos insolúveis no substrato ICB em oligossacarídeos solúveis, que são visíveis na forma de sobrenadante colorido. ICB substratos são estáveis ​​até 90 ° C. A incubação time deve ser aumentada até 24 horas, se enzimas não purificadas tais como caldos de cultura são utilizados.
   4. Colocar a placa de produto no interior do colector de vácuo com o bloco espaçador no interior.
   5. Colocar a placa de kit de ensaio no topo e aplicar vácuo (pressão negativa máxima de -60 kPa), ou utilizar uma centrífuga para filtrar o produto a partir do kit de ensaio de placa para o poço da placa de produto.
      NOTA: O filtrado contendo os oligossacarídeos coloridas como produto de reacção está agora no prato de coleta para análise posterior ^8.
2. Detecção e quantificação
   1. Verificar que o volume de líquido em cada poço da placa de recolha é aproximadamente o mesmo através de inspecção visual.
   2. Ler a absorbância da placa de coleta em 517 nm para a palha de trigo ICB-vermelho usando um leitor de placas.
   3. Ao fazer a análise de dados - subtrair o tampão - apenas valores de controlo negativo a partir dos valores dos poços, onde uma enzimafoi adicionado. Calcular o valor médio e o erro padrão das médias (SEM) das cavidades replicadas ^8.
      NOTA: Em caso de triagem de enzimas desconhecidos, sugerimos fazer uma série de diluição de modo a obter dados mais detalhados sobre a faixa dinâmica da actividade da enzima.

O alto rendimento e capacidade de multiplexagem deste ensaio é baseado no polímero insolúvel cromogénico (ou proteína) de hidrogel (CPH) substratos dispostos em placas de filtro de 96 poços. Enzimas, bem como controlos negativos são adicionados à placa de kit de ensaio (Figura 1A) e as enzimas degradam o substrato correspondente produzir um sobrenadante de cor (Figura 1B). Depois da reacção estar concluída, o sobrenadante é transferido para uma placa de produto clara cavidades e a absorvância pode ser medido directamente utilizando um espectrofotómetro adequado para placas de 96 poços (Figura 1C).

Um exemplo de uma resposta de dose de CPH-arabinoxilano de xilanase em diferentes concentrações de enzima (0,00-0,75 U / ml) é mostrado na Figura 1D, onde a concentração de enzima diminuição pode ser observada visualmente. A quant espectrofotometria mais detalhadaificação pode ser usada para representar graficamente a absorvância em função da concentração de enzima (Figura 1E). A intensidade de sinal corresponde à actividade da enzima. A reprodutibilidade do ensaio é mostrado pelas barras de erro (erro padrão da média, SEM, de três réplicas). Experimentos mais detalhados sobre a reprodutibilidade deste ensaio são publicados em outros lugares 8.

Figura 1. tratamento com xilanase de CPH-arabinoxilano. A) Um esquema da placa de ensaio com o kit de substrato de CPH (por exemplo, CPH-arabinoxilano) carregado em poços da placa de filtro de 96 cavidades pouco antes da adição de enzimas 1 e 2 e o tampão controle -apenas (enzima 1 tiveram atividade -xylanase endo); B) Degradação de CPH-arabinoxilano pela enzima 1 produziu um sobrenadante colorida; C) Após filtrat vácuo-assistidaião dos sobrenadantes em placa para o produto, a absorvância é medida espectrofotometricamente; D) placa produto contendo os produtos da reacção após o tratamento de CPH-arabinoxilano em 4 cores diferentes, com diferentes concentrações de endo-1,4--β xilanase em 100 mM tampão acetato de sódio, pH 4,5 durante 60 minutos à temperatura ambiente;. E) a quantificação dos produtos da reacção de D usando espectrofotometria por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Existem diferentes opções para usar este ensaio na triagem enzima. Uma opção é usar uma placa de 96 cavidades contendo diferentes polissacáridos para o rastreio, por exemplo, um pequeno número de (purificada) endo -enzimas com actividade desconhecida. Neste caso, o resultado será que mostram polissacarídeos são DEGRADcapaz pela enzima alvo. Para demonstrar este princípio, um -cellulase endo foi testado contra diferentes substratos CPH a 25 ° C. Três concentrações diferentes de enzima (0,5 U / ml, 1,0 U / ml e 5 U / ml) foram incubadas durante 30 min. O resultado é claramente visível na placa produto (Figura 2A). A folha de produto para esta endo -cellulase fornecidas pelo fornecedor especifica lado de actividade xiloglucano (tamarindo), cevada β-glucana, glucomannan, xilano de bétula e baixa lado de actividade galactomanano. Coerente com isso, a atividade adicional para celulase foi encontrado contra-CPH-β glucana (cevada), CPH-xiloglucano (tamarindo), CPH-xilano (madeira de faia) e baixa atividade contra CPH-galactomanano (Figura 2B). Glucomannan não foi testado. Os mesmos substratos CPH foram digeridos com enzimas comerciais disponíveis (três diferentes concentrações de enzima: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml e 1,0 U / ml) foram utilizados como controlos positivos nas mesmas condições do que o anteriorexperimentar. Todos os substratos foram degradadas pela enzima de controlo positivo e o aumento da intensidade de sinal correspondente a uma maior concentração de enzima (Figura 2C).

Figura 2. Oito diferentes substratos CPH foram incubadas sob agitação a 25 ° C durante 30 min. A) A placa produto de diferentes substratos CPH digeridos com uma endo -cellulase, em diferentes concentrações. B) Quantificação da actividade actividade e vários lado de endo -cellulase. As barras de erro representam o erro padrão da média de três réplicas C) Actividade de diferentes enzimas comerciais para o substrato correspondente CPH (endo-celulase e 2-HE-celulose;. E-LAMSE e CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucana (cevada); e-XYAN4 e CPH-xilano, e-XEGP e CPH-xiloglucano, E-BLAAM e CPH-amilose, E-BMACJ e CPH-galactomanano; todas as enzimas de Megazyme). As barras de erro representam o erro padrão da média de duas réplicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os substratos insolúveis biomassa cromogénico (ICB) são uma adição útil ao repertório substrato cromogénico, porque eles mantêm, em parte, a disposição natural de polissacarídeos nas paredes celulares das plantas que são o principal constituinte da biomassa. Substratos CPH e CPI são usados ​​no nosso exemplo, para analisar as enzimas segregadas de Phanerochaete chrysosporium, quando cultivada em meio líquido. A configuração da placa da placa de kit de ensaio é mostrado na Figura 3A, com 19 CPH substratos e 5 substratos ICB (4 poços para cada substrato, Figura 3B). P. chrysosporium foi cultivated durante três dias e, em seguida, o sobrenadante de cultura analisado. Portanto, 125 ul de tampão 200 mM foi transferido para cada poço de cultura sobrenadante e 25 ul adicionados. Três condições de pH diferentes foram testados utilizando tampão de acetato de sódio pH 4,0, tampão de fosfato de sódio a pH 6,0 ou pH 8,0 (Figura 3C). A placa foi incubada com agitação (150 rpm) a 25 ° C durante 2 h.

Os produtos da reacção foram transferidos para a placa do produto (Figura 3D) e analisadas. P. chrysosporium enzimas para a degradação de vários glucanos e xilanos, amido (Figura 3E) produzido. sinais de baixa poderia ser detectada para o arabinano hemiceluloses (beterraba sacarina) e galactano péctico, bem como para a GPI (soja). As enzimas produzidas eram mais activos em condições ácidas (pH 4,0) do que em condições neutras ou ligeiramente básicas (pH 8,0). Menor atividade no sentido de substratos ICB (Figura 3F)demonstra que quando os polissacarídeos são, num contexto mais natural, a eficiência da enzima não é o mesmo que com um polissacarídeo puro e por isso substratos ICB demonstrar uma visão mais realista sobre a eficiência da enzima, se for aplicada ao cru ou pré material vegetal tratado.

Figura 3. Triagem de um sobrenadante de cultura de uma cultura líquida de idade de 3 dias de Phanerochaete chrysosporium utilizando uma placa de multi substrato contendo 19 CPH e 5 substratos ICB. A) um esquema da configuração da placa com 4 poços para cada substrato indivíduo (fundo cinza = substratos CPH, fundo laranja = substratos ICB). B) Imagem da placa de ensaio contendo o substrato. C) Esquema mostrando as condições de tampão utilizadas nesse experimento (200 mM de acetato de sódio pH 4,0, fosfato de sódio pH 6,0 e fosfato de sódio pH 8,0). D) imagem da placa de produto após 2 h a 25 ° C. E) As absorvências foram detectados a 517 nm e representada para cada substrato CPH indivíduo e F ) resulta de substrato ICB para as respectivas enzimas. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os substratos cromogénicos pode também ser usado para estudar os efeitos sinérgicos, utilizando uma mistura de diferentes substratos coloridos CPH num poço e analisando-se o sobrenadante da reacção após o tratamento utilizando enzimas individuais ou enzima cocktails.

No exemplo a seguir mostrada na Figura 4, vermelho CPH-celulose e substratos amarelo CPH-xilano foram misturados em conjunto a uma aproximadamente equrazão Al em poços de placas de filtro de 96 poços. A Figura 4A mostra os produtos de reacção de cor depois do tratamento de 1 hora à temperatura ambiente com nenhuma enzima (controlo), CEL celulose (2 U / ml), xil xilanase (1 U / ml) e um mistura de ambas as enzimas (3 repetições de cada abordagem) em 100 mM de acetato de sódio tampão pH 4,5. Para análise, o produto da reacção foi quantificada espectrofotometricamente por digitalizar o espectro de absorvância de 350 nm a 700 nm (Figura 4B). Muitas vezes, uma inspecção visual por si só pode dar uma indicação de que a enzima actue por um ou vários substratos, no entanto registada a absorvância espectros que resultam de diferentes corantes também podem ser resolvidos por meio de regressão linear simples 8 para dar uma indicação mais precisa do grau de degradação de cada substrato a partir da mistura.

Usando substratos de CPH como misturas substancialmente contribui para um rendimento do ensaio, permitindo SCReening contra até 4 substratos diferentes em uma experiência (um poço). No exemplo mostrado quatro diferentes substratos utilizados: CPH-β glucana azul (cevada), CPH-xilano amarelo (madeira de faia), CPH-amilose verde e galactan CPH-pectic vermelho (tremoço). A disposição da placa de substrato é mostrado na Figura 4C e uma imagem da placa de ensaio na Figura 4D. A reacção foi realizada em 100 mM de acetato de sódio tampão pH 4,5 durante 30 min a 25 ° C e 150 rpm. Primeira enzimas individuais com o aumento da concentração de enzima foram testados com o substrato correspondente CPH (Figura 4E) e o sobrenadante corado foi recebido como esperado na placa produto (Figura 4F, linha 1A - 12D). Fileira E continha os dois substratos diferentes CPH amarelo CPH-xilano e azul-CPH-β glucano, os quais foram degradados com diferentes proporções de enzimas correspondentes endo endo e -xylanase -glucanase. Após a reacção, o resultado é visible na placa produto: a cor do produto de reacção era mais escura verde-azul, quando mais endo -glucanase estava presente (Figura 4F, 4E-6E) e se transformou em um isqueiro verde-amarelo, quando o endo -xylanase concentração aumentada ( A Figura 4F, 10-12E). O mesmo é visto na linha F, em que os dois substratos galactano CPH-péctico vermelho e amarelo CPH-xilano foram degradados com endo endo e -galactanase -xylanase. Todos os quatro CPH substrato colorido diferente estavam presentes (Figura 4F, 1G-12F) e enzimas individuais degradou o substrato CPH apropriado e por adição de enzimas adicionais uma combinação dos produtos de reacção de cor foi recebido.

Figura 4. Uma combinação de dois substratos de CPH diferentes, vermelho CPH-celulose e amarelo CPH-xilano, tratados com diferentes enzimas. UMA) Sobrenadantes de reacção após o tratamento de substratos com dois endo -cellulase (cel) ou endo -xylanase (Xil) ou ambas as enzimas. B) os espectros de absorvância dos sobrenadantes de reacção. Uma combinação de quatro substratos CPH diferentes tratados com diferentes enzimas C) Esquema da placa de substrato contendo os substratos CPH:. Azul CPH-β-glucano (cevada), CPH-xilano amarelo (madeira de faia), verde CPH-amilose e CPH- vermelho galactano péctico (tremoço) D) Imagem da placa de ensaio contendo as diferentes substratos CPH E) Esquema da placa de produto que mostra a relação entre as enzimas adicionadas (as concentrações nominais (NC):.. glu = 1 U / ml de endo -glucanase, Xil = 1 U / ml de endo -xylanase, Amy = 5 U / ml de endo-amilase e Gl = 0,5 U / ml de endo -galactanase). F) Imagem da placa de produto após 30 minutos de incubação a 25 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Lista de disponíveis Cromogênico polímero de hidrogel (CPH) e substratos Insolúvel Cromogênico Biomassa (ICB).

Há dois pedidos de patente depositados envolvendo o ensaio de substrato placa CPH de 96 poços e o ensaio de 96 poços substrato ICB (WO2015036000 e Dinamarca PA 2015 70311).