Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Resumo

Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.

Resumo

rastreamento clonal único e análise ao nível de todo o coração pode determinar o comportamento de células progenitoras cardíacas e diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco e permitir o estudo das bases celulares e moleculares da morfogênese cardíaca normal e anormal. tecnologias emergentes recentes de análises clonais individuais retrospectivos tornar o estudo da morfogênese cardíaca em resolução única célula viável. No entanto, a opacidade dos tecidos e espalhamento de luz do coração como a profundidade da imagem é aumentada dificultar imagem de todo o coração a uma resolução de uma única célula. Para superar esses obstáculos, um sistema de compensação de todo o embrião, que pode tornar o coração altamente transparentes para iluminação e detecção deve ser desenvolvida. Felizmente, nos últimos anos, muitas metodologias para sistemas de compensação de todo o organismo, tais como clareza, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, BABB e PACT foram relatados. Este laboratório está interessado nos mecanismos celulares e moleculares de cartãomorfogênese iac. Recentemente, estabelecemos única linhagem de células de rastreamento via ROSA26-Cre ^ERT2; sistema ROSA26-Confetti às células rótulo escassamente durante o desenvolvimento cardíaco. Nós adaptada várias metodologias de remoção de embriões inteiros, incluindo Sca le e cúbicos (, coquetéis de imagem cerebral claras desobstruídas e análise computacional) para limpar o embrião em combinação com toda a coloração de montagem a imagem clones individuais dentro do coração. O coração foi fotografada com sucesso na resolução de uma única célula. Descobrimos que Sca le pode limpar o coração embrionário, mas não podem efectivamente limpar o coração pós-natal, enquanto cúbico pode limpar o coração pós-natal, mas danifica o coração embrionário por dissolução do tecido. Os métodos descritos aqui irão permitir o estudo da função dos genes em um único clone de resolução durante a morfogénese cardíaca, o que, por sua vez, pode revelar a base molecular e celular de defeitos cardíacos.

Introdução

Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a ^1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos ^3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) ^4. O estudo da morfogênese cardíaca requer uma compreensão de detalhes inerentes estruturais em três dimensões (3D) e linhagem de células progenitoras cardíacas simples marcado com traçado durante o desenvolvimento cardíaco irá promover o entendimento da morfogênese cardíaca. Um número de métodos de tomografia secção base de alta resolução foram desenvolvidos no the passado poucas décadas a imagem Estrutura de órgãos ^5,6; No entanto, estes métodos requerem, instrumentos especializados caros, mão de obra extensa, e carecem de organização estrutural detalhada em resolução de uma única célula na volumétrica final, reconstruído imagem ^7,8.

Imagiologia volumétrica 3D ao nível da célula individual fornece um meio para estudar diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular in vivo ^7. No entanto, espalhamento de luz tecido permanece o principal obstáculo para imagiologia células e estruturas em 3D profundamente dentro do coração intacto. Lipídios são uma importante fonte de dispersão de luz, ea remoção de lípidos e / ou ajuste da diferença do índice de refração entre lipídios e seus arredores são abordagens potenciais para aumentar a transparência do tecido ^8. Nos últimos anos, um número de métodos de limpeza de tecido foram desenvolvidos, que reduzir a opacidade do tecido e dispersão de luz, como BABB (álcool de benzilo e benzilo benzoate mistura) e DBE (tetra-hidrofurano e dibenzylether); mas nestes métodos, extinção de fluorescência permanece um problema ^8-10. O solvente baseado métodos hidrofílicos, tais como SeeDB (frutose / tioglicerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar sinais fluorescentes, mas não tornem todo o órgão transparente ^7,8,11. Em comparação, o método tecido desobstrução-Clareza torna o órgão transparente, mas exige um dispositivo de electroforese especializada para remover os lípidos ^8,12, assim como Pact (técnica passiva clareza), que também requer a incorporação de hidrogel ^7,13. Para informações detalhadas sobre todos os métodos de remoção de tecidos disponíveis, consulte a Tabela 1 em Richardson e Lichtman, et al. ^7.

Em 2011, Hama et al. Serendipitously descobriu uma mistura hidrofílica 'Sca le' (uréia, glicerol e Triton mistura X-100), que torna o cérebro do rato e transpar embriãoent completamente, preservando sinais fluorescentes a partir de clones marcados ^14. Isto permite a formação de imagens do cérebro intacto a uma profundidade de vários milímetros e reconstrução em grande escala de populações neuronais e as projecções com uma resolução subcelular. Susaki et ai. melhorada Sca le adicionando aminoálcoois e desenvolveu o (e desobstruídas cocktails claras de imagem cerebral e análise computacional) 'CÚBICAS "método de compensação do tecido, o que aumentou a solubilização fosfolipídios, reduziu o tempo de compensação, e permitiu multicolor fluorescente imaging ^8. No presente estudo, aproveitando a Sca le e técnicas de limpeza cúbica de tecido e alta resolução seccionamento óptico 3D, clones individuais dentro do coração durante cardiogenesis foram rastreados usando Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ^17, cTnT-Cre ^18, NFATc1-Cre ^19, e Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ linhas de rato. A combinação do método de coloração de montagem inteira (WMS) desenvolvido anteriormente ^21,22 com métodos de compensação de tecido mais permitidos para a coloração de outras proteínas em clones marcados e para o estudo do seu comportamento em um contexto volumétrica 3D. A combinação de tecido e de compensação WMS permite uma melhor compreensão dos papéis dos diferentes genes e proteínas durante o desenvolvimento cardíaco, e a etiologia de defeitos cardíacos. Este protocolo pode ser aplicado para estudar diferenciação de células progenitoras outro, o comportamento celular, e morfogénese eventos órgão durante o desenvolvimento.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC), em Albany Medical College e realizada de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparações Solução

NOTA: O Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, αMHC-Cre ^17, e Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ linhas de rato foram adquiridos comercialmente cTnT-Cre ¹⁸ foi um presente do Dr. Jiao na Universidade do Alabama NFATc1-Cre.. foi um presente do Dr. Bin Zhou no Albert Einstein College of Medicine ^19. Os ratinhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono em uma câmara fechada durante pelo menos 60 segundos, seguido por meios físicos de verificação morte por toracotomia bilateral, decapitação ou deslocamento cervical.

1. Prepare Tamoxifeno. Dissolve-se 10 mg de Tamoxifeno em 10 ml de semente de girassol oieu. Uma vez que esteja completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 ° C.
2. Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS). Dissolve-se Na ₂ HPO ₄ (1,41960 g), KH ₂ PO ₄ (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20129 g) em 1 L de água destilada e ajustar o pH para 7,4.
3. Prepare PBST: 0,1% de Tween-20 em PBS solução por dissolução de 100 ul de Tween-20 em 100 ml de PBS.
4. Preparar tampão de bloqueio. Adicione 3% de albumina de soro bovino a solução de bloqueio (BSA) por dissolução de 3 g de BSA em 100 mL de PBST contendo 0,2% de Tween-20.
5. Prepare CUBIC-1 (reagente 1). Misturar 25% em peso de ureia, 25% em peso de N, N, N ', N'-tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 15% em peso de Triton X-100 em _dH2O
6. Prepare CUBIC-2 (reagente 2). Misturar 50% em peso de sacarose, 25% em peso de ureia, 10% em peso de 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol e 0,1% (v / v) de Triton X-100 em _dH2O
7. Prepare Sca le A2: 4 M de ureia, 10% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH ₂ O. Ajustar o pH para 7,7.
8. Prepare Sca le B4: ureia 8M e 0,1% w / v de Triton X-100 em _dH2O Ajustar o pH para 8,7.
9. Prepare Sca le 70: 4 M ureia, 70% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em _dH2O

2. O tamoxifeno indução, isolamento de embriões e Fixação

1. Tamoxifeno Indução e isolamento de embriões
   1. Usando um protocolo tubo de alimentação curva aprovado (ACUP 13-12007), sonda as fêmeas ratos R26Cre ^ERT2 Confetti (conectado por camundongos machos R26Cre ^ERT2) com 10 ug / g de Tamoxifen em embrionária dia de desenvolvimento E7.75 ^33. No dia embrionário 9,5 (E9.5) ou E10.5, eutanásia os ratos do sexo feminino com CO ₂ e deslocamento cervical.
   2. Após a verificação da morte do rato (ver secção 1 Nota), abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura e dissecar o corno uterino, remover as camadas de tubo uterino com a ajuda de tesouras e pinças, e relocar os embriões do ^23,24 tuba uterina.
      1. Transferir os embriões para uma placa de Petri contendo PBS (pH 7,4). Sob o microscópio de dissecação, remover as camadas não-embrionárias (córion, saco vitelino e âmnio) com a ajuda da pinça.
   3. Com uma pinça e tesouras, recolher as amostras de mulheres do rato e da cauda do embrião para genotipagem conforme relatado anteriormente ^22. Usando uma pipeta de plástico, transferir cada embrião para um poço de uma placa de 48 contendo 1 ml de PBS 1x.
   4. Sob um microscópio de fluorescência, identificar os embriões / RFP / PCP positivas GFP por meio de um microscópio invertido com uma câmara. Descascar o pericárdio, usando uma pinça e gire o coração / embrião com a ajuda de pinças curvas para determinar o número de clones fluorescentes em ambos os lados do coração com os filtros GFP / RFP / CFP. Sem cortes são necessários.
2. Depois de identificar GFP / RFP / embriões PCP positivos, lavar rapidamente os embriões duas vezes (2 min cada) com 1x PBS em the 48 bem-placa num agitador de placas à temperatura ambiente (TA). Isto irá remover o excesso de sangue.
3. Corrigir o coração do embrião / embrionário usando 4% de paraformaldeído (PFA) a TA. O tempo de fixação depende da idade e tamanho do tecido embrionário. Para corrigir o embrião E9.5 durante 2 h à TA. Os embriões estágio embrionário final exigem mais tempo de fixação, que pode até mesmo ser prolongada até 24 horas para o coração pós-natal.
   CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, evitar o contacto com a pele, olhos e mucosas.
4. Após a fixação, lavar o embrião / coração no poço de placa 48 por duas vezes (10 minutos cada) com PBS 1x num agitador de placas à TA. Isto remove o excesso de PFA a partir do embrião / coração. Os embriões são então processadas para toda coloração montagem e desobstrução dos tecidos.

3. Whole Mount Coloração

NOTA: Depois de PFA fixação do embrião / coração é submetido a toda a coloração de montagem como segue.

1. Permeabilizar o embrião / coração em um bem-placa de 48 usando 1 ml de PBST 0,1% durante 2 horas num agitador de placas à TA.
2. Seguindo permeabilização, mergulhe o embrião / coração em 1 ml de tampão de bloqueio, por 2 horas ou durante a noite num agitador de placas a 4 ºC.
3. Mergulha-se o embrião / coração ao endotelial PECAM anticorpo específico da célula (CD31), diluído (1: 100) em 0,3 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC.
4. Lave o embrião / coração utilizando PBST 5 vezes, 30 minutos cada à temperatura ambiente num agitador de placas. Isto remove o excesso de anticorpo primário não ligado específico do tecido.
5. Mergulha-se o embrião / coração em anticorpo secundário anti-rato de cabra Alexa Fluor 647, diluído (1: 1000) em 1 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC.
6. Repetir o passo 3.4 para lavar o anticorpo secundário.
7. Pós-fixar o embrião / coração com 4% de PFA durante 1 h à TA num agitador de placas e lava-se duas vezes com PBS, 5 minutos cada.
8. Coloração do embrião / coração com o corante nuclear 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluído em PBST a uma concentração de 0,01 mg / mL) durante 10 min num agitador de placas à TA. Siga com duas lavagens com PBS de 5 minutos cada.

4. Embrião / Clearing coração com Sca l e ou Método CUBIC

NOTA: Depois de toda coloração montagem, o embrião / coração é submetido tanto ao Sca le ou método de compensação cúbica de tecido. A escolha do método depende do tamanho e idade do tecido embrionário. Para E11.5 ou embriões idade mais precoce, o uso Sca l e método de limpeza de tecidos, enquanto que para embriões mais velhos ou corações pós-natal é preferido o método de compensação cúbica de tecido.

1. Escala de tecidos Método Clearing
   1. Incubar o embrião / coração com 1 ml de Sca l solução de e A2 em um frasco de cintilação (embrulhadas em papel de alumínio) com ocasionais agitação suave (à mão) durante 48 horas a 4 ° C.
   2. Após a incubação Sca l e A2, incubar o embrião / coração com 1 mL de Sca l solução de e B4 a 4 ° C no mesmo frasco com agitação suave ocasional para anot-lhe 48 h.
   3. Incubar o embrião / coração durante mais 48 h com 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C com agitação suave ocasional. Mount embrião usando 90% de glicerol (ver secção 5.1).
2. Cúbica de tecido Método Clearing
   1. Para toda embrião / coração compensação cúbicos, mergulhe cada embrião / coração em 1 ml de CUBIC-1 com ocasional agitação suave durante 48 horas a 37 ºC ^7. Após 48 horas, substitui a solução com o mesmo volume de reagente fresco CUBIC 1, e incuba-se a amostra para uma 48 horas adicionais a 37 ° C com agitação ocasional com a mão.
   2. Lavar a cúbica-1 tratados coração / embrião com 1x PBS várias vezes à temperatura ambiente com agitação suave com a mão. Isso remove o excesso de solução CUBIC-1.
   3. Depois de lavar a CUBIC-1 com PBS, mergulhar os embriões / corações em CUBIC-2 solução (1 g por embrião / coração) por 48 horas a 37 ºC com agitação ocasional gentil com a mão. Isto segue de montagem usando glicerol embrião / coração (ver secção 50,2).

5. Montagem Sample and Imaging

NOTA: Os embriões desmatadas ou órgãos em Sca l e 70 ou cúbica-2 solução pode ser trabalhada diretamente com Escala 70 e cúbicas-2 solução como o meio de imagem, respectivamente. No entanto, considerando a vulnerabilidade das amostras embrionárias para reagentes de compensação, se as amostras não são imediatamente ser trabalhada, mas armazenada a longo prazo, armazenar as amostras em glicerol a 90%, seguindo o protocolo abaixo.

1. Diretamente mergulhe o Sca le apuradas amostra em 1 ml de 90% de glicerol e armazenar a 4 ° C até imagiologia.
2. Lava-se a amostra tratada cúbicos com 1x PBS, duas vezes, 5 min cada e sequencialmente incubar a amostra com 1 ml de 30%, 50%, 70% e solução de glicerol a 90% durante 30 min cada.
3. Para imagiologia, transferir a amostra para uma placa de Petri de vidro de fundo com uma quantidade mínima de 90% de glicerol e imagem clones com um microscópio confocal equipado com duas capacidades de fotões.
4. Imagem do coração ou embrião no glicerol com um / 0.3 NA 10X, um 25X / 0.8 NA imersão, ou uma lente objetiva de corretiva 40X / 1.2 NA água. Imagem DAPI usando 2-fótons de excitação de um titânio coerente: a laser camaleão safira. A escolha do microscópio e a lente objectiva dependerá da finalidade das experiências, por exemplo, para super-resolução, um microscópio de fluorescência folha de luz poderia ser utilizado.

Resultados

Imaging o coração embrionário apuradas

Formação do coração dos vertebrados é um processo morphogenic espaço-temporalmente regulados e depende da organização e diferenciação de células progenitoras de quatro fontes diferentes ^1. As células a partir do primeiro campo do coração do crescente cardíaca irá dobrar para a linha mediana ventral, para formar um tubo cardíaco linear. As células a partir do segundo campo do co...

Discussão

O isolamento de embriões é um passo muito crítica. embriões E9.5 são muito frágeis e pequeno em tamanho, por isso o cuidado extra deve ser tomado para não danificar as estruturas do embrião / coração durante o isolamento. As camadas extras não-embrionárias que envolvem o embrião / cardíaca devem ser cuidadosamente removidos especialmente quando imagiologia todo o embrião. Isto permite a penetração de anticorpos e de compensação mistura profunda dentro dos tecidos embrionários, e também ajuda na remoção do sinal de fundo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,2′,2′ '-nitrilotrietanol	Sigma Aldrich	90279
4% Paraformaldeído em PBS	Affymetrix	19943
BSA	Fischer Scientific
N,N,N',N'-tetrakis(2-hidroxipropil) etilenodiamina	Sigma Aldrich	122262
Tampão de Fosfato Salino	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Triton  X-100	Sigma Aldrich	T8787
Uréia	Sigma Aldrich	U-1250
Sacarose	Sigma Aldrich	84097
Glicerol	Sigma Aldrich	G8773
Tamoxifeno	Sigma Aldrich	T5648
Óleo de semente de girassol	Sigma Aldrich	S5007
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
PECAM (CD31)	BD Pharmingen
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21247
DAPI coloração nuclear	Sigma Aldrich	D9542
37oC Incubadora	Termocientífica Fischer	Heratherm, Incubadoras Microbiológicas Compactas
48 placas de poços	Cell Treat	229148
Balança Analítica	Metler Toledo	PB153-S/FACT
Confocal microscópio	Zeiss	Zeiss 510 microscópio
Microscópio de Dissecação	Unitron	Z850
Microscópio fluorescente	Zeiss	Observer. Esterilizador de
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER-5287-120V
Fonte de Luz	SCHOTT	ACE I
Par de Tesouras Ferramentas de	Ciência Fina	14084-08
Placa de Petri 60 mm x15 mm	TPP Techno Plastic Products AG	93060
Rocker II  Plataforma Rocker	Boekel Scientific	260350
Tubos cintilantes	Fischer Scientific	03-337-26
Pipeta de transferência	Samco Scientific	202
Pinças	Fine Science Tools	11251-20