Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.
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Artigo de método
Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única
Neste artigo
Resumo
Resumo
rastreamento clonal único e análise ao nível de todo o coração pode determinar o comportamento de células progenitoras cardíacas e diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco e permitir o estudo das bases celulares e moleculares da morfogênese cardíaca normal e anormal. tecnologias emergentes recentes de análises clonais individuais retrospectivos tornar o estudo da morfogênese cardíaca em resolução única célula viável. No entanto, a opacidade dos tecidos e espalhamento de luz do coração como a profundidade da imagem é aumentada dificultar imagem de todo o coração a uma resolução de uma única célula. Para superar esses obstáculos, um sistema de compensação de todo o embrião, que pode tornar o coração altamente transparentes para iluminação e detecção deve ser desenvolvida. Felizmente, nos últimos anos, muitas metodologias para sistemas de compensação de todo o organismo, tais como clareza, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, BABB e PACT foram relatados. Este laboratório está interessado nos mecanismos celulares e moleculares de cartãomorfogênese iac. Recentemente, estabelecemos única linhagem de células de rastreamento via ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti às células rótulo escassamente durante o desenvolvimento cardíaco. Nós adaptada várias metodologias de remoção de embriões inteiros, incluindo Sca le e cúbicos (, coquetéis de imagem cerebral claras desobstruídas e análise computacional) para limpar o embrião em combinação com toda a coloração de montagem a imagem clones individuais dentro do coração. O coração foi fotografada com sucesso na resolução de uma única célula. Descobrimos que Sca le pode limpar o coração embrionário, mas não podem efectivamente limpar o coração pós-natal, enquanto cúbico pode limpar o coração pós-natal, mas danifica o coração embrionário por dissolução do tecido. Os métodos descritos aqui irão permitir o estudo da função dos genes em um único clone de resolução durante a morfogénese cardíaca, o que, por sua vez, pode revelar a base molecular e celular de defeitos cardíacos.
Introdução
Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a 1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos 3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) 4. O estudo da morfog....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC), em Albany Medical College e realizada de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Preparações Solução
NOTA: O Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato foram adquiridos comercialmente cTnT-Cre 18 foi um presente do Dr. Jiao na Universidade do Alabama NFATc1-Cre.. foi um presente do Dr. Bin Zhou no Albert Einstein Colleg....
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Resultados
Imaging o coração embrionário apuradas
Formação do coração dos vertebrados é um processo morphogenic espaço-temporalmente regulados e depende da organização e diferenciação de células progenitoras de quatro fontes diferentes 1. As células a partir do primeiro campo do coração do crescente cardíaca irá dobrar para a linha mediana ventral, para formar um tubo cardíaco linear. As células a partir do segundo campo do co.......
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Discussão
O isolamento de embriões é um passo muito crítica. embriões E9.5 são muito frágeis e pequeno em tamanho, por isso o cuidado extra deve ser tomado para não danificar as estruturas do embrião / coração durante o isolamento. As camadas extras não-embrionárias que envolvem o embrião / cardíaca devem ser cuidadosamente removidos especialmente quando imagiologia todo o embrião. Isto permite a penetração de anticorpos e de compensação mistura profunda dentro dos tecidos embrionários, e também ajuda na remoção do sinal de fundo.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos aos membros do laboratório MW pela discussão científica. Este trabalho é apoiado pela AHA [13SDG16920099] para MW, e pelas doações do National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] para MW As imagens foram capturadas no Imaging Core Facility do Albany Medical College.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2,2′,2′ '-nitrilotrietanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldeído em PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | ||
| N,N,N',N'-tetrakis(2-hidroxipropil) etilenodiamina | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Tampão de Fosfato Salino | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Uréia | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sacarose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifeno | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Óleo de semente de girassol | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | ||
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI coloração nuclear | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubadora | Termocientífica Fischer | Heratherm, Incubadoras Microbiológicas Compactas | |
| 48 placas de poços | Cell Treat | 229148 | |
| Balança Analítica | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscópio | Zeiss | Zeiss 510 microscópio | |
| Microscópio de Dissecação | Unitron | Z850 | |
| Microscópio fluorescente | Zeiss | Observer. Esterilizador de | |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Fonte de Luz | SCHOTT | ACE I | |
| Par de Tesouras Ferramentas de | Ciência Fina | 14084-08 | |
| Placa de Petri 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Plataforma Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Tubos cintilantes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Pipeta de transferência | Samco Scientific | 202 | |
| Pinças | Fine Science Tools | 11251-20 |
Referências
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N.
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Reimpressões e permissões
