Medindo In Vitro Actividade ATPase para enzimática Caracterização

Resumo

Descrevemos um protocolo básico para quantificar a atividade da ATPase in vitro. Este protocolo pode ser otimizado com base no nível de atividade e requisitos para uma determinada ATPase purificada.

Resumo

enzimas de hidrólise de trifosfato de adenosina, ou ATPases, desempenham um papel crítico num conjunto diversificado de funções celulares. Estas proteínas dinâmicas podem gerar energia para o trabalho mecânico, tais como o tráfico de proteínas e degradação, transporte de soluto e movimentos celulares. O protocolo aqui descrito é um ensaio de base para a medição da actividade in vitro de ATPases purificadas para a caracterização funcional. Proteínas hidrolisar ATP numa reacção que resulta na libertação de fosfato inorgânico, e a quantidade de fosfato libertado é então quantificada utilizando um ensaio colorimétrico. Este protocolo altamente adaptável pode ser ajustado para medir a actividade de ATPase em ensaios cinéticos ou terminal. Um protocolo representante é fornecido aqui com base na atividade e as exigências de Epse, a AAA + ATPase envolvida no Tipo II Secreção na bactéria Vibrio cholerae. A quantidade de proteína purificada necessária para medir a actividade, duração do ensaio e o calendário e número de saintervalos mpling, tampão e a composição de sal, temperatura, co-factores, estimulantes (se houver), etc., podem variar a partir dos descritos aqui, e, assim, alguma optimização pode ser necessário. Este protocolo fornece uma estrutura básica para ATPases que caracterizam e pode ser realizado de forma rápida e facilmente ajustado conforme necessário.

Introdução

ATPases são enzimas integrais em muitos processos em todos os reinos da vida. As ATPases atuam como motores moleculares que usam a energia da hidrólise do ATP para alimentar reações tão diversas como tráfego, desdobramento e montagem de proteínas; replicação e transcrição; metabolismo celular; movimento muscular; motilidade celular; e bombeamento de íons^1-3. Algumas ATPases são proteínas transmembranares envolvidas no transporte de solutos através das membranas, outras são citoplasmáticas e podem estar associadas a uma membrana biológica, como a membrana plasmática ou as de organelas.

AAA+ ATPases (ATPases associadas a várias atividades celulares) compõem um grande grupo de ATPases que compartilham alguma sequência e conservação estrutural. Essas proteínas contêm motivos de ligação de nucleotídeos conservados, como as caixas Walker-A e -B, e formam oligômeros (geralmente hexâmeros) em seu estado ativo¹. Grandes mudanças conformacionais nessas proteínas após a ligação de nucleotídeos foram caracterizadas entre diversos membros da família AAA+. EpsE é uma ATPase AAA+ e membro da subfamília de secreção bacteriana Tipo II/IV de NTPases^4-6. EpsE potencializa a secreção tipo II (T2S) em Vibrio cholerae, o agente causador da cólera. O sistema T2S é responsável pela secreção de uma grande variedade de proteínas, como a toxina do fator de virulência da cólera, que causa diarreia aquosa abundante quando V. cholerae coloniza o intestino delgado humano⁷.

As técnicas para quantificar a atividade da ATPase in vitro são variadas, mas comumente medem a liberação de fosfato usando substratos colorimétricos, fluorescentes ou radioativos^8-11. Descrevemos um método básico para determinar in vitro a atividade da ATPase de proteínas purificadas usando um ensaio colorimétrico baseado em um substrato contendo verde de malaquita comercialmente disponível que mede o fosfato inorgânico liberado (Pi). Em pH baixo, o molibdato verde malaquita forma um complexo com Pi e o nível de formação do complexo pode ser medido a 650 nm. Este ensaio simples e sensível pode ser usado para caracterizar funcionalmente novas ATPases e avaliar os papéis de potenciais ativadores ou inibidores, para determinar a importância de domínios e/ou resíduos específicos, ou para avaliar o efeito de tratamentos específicos na atividade enzimática.

Protocolo

1. Execute Reaction ATP hidrólise com Proteína Purificada

1. Prepare estoques de todos os reagentes necessários para a incubação com proteína purificada.
   1. Prepare 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) contendo tampão HEPES 100 mM, pH 8,5, NaCl 65 mM e glicerol a 5% (ou outro tampão de ensaio conforme o caso).
   2. Preparação de 100 mM de _MgCl2 (ou outro metal, se é de ATPase dependente de metais) em água.
   3. Prepare fresco ATP 100 mM em 200 mM Tris Base (não ajustar o pH ainda mais), utilizando alta ATP pureza. Alíquotas e armazenar o estoque de ATP a -20 ° C durante não mais do que algumas semanas, como ATP vai quebrar ao longo do tempo, e se abstenham de congelamento e descongelamento o estoque de ATP.
   4. Pré-mistura _{de MgCl2} e ATP em uma relação de 1: 1 pouco antes de se a reacção de hidrólise de ATP.
2. Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para a recolha de amostras em intervalos regulares ao longo da reacção. Preparar tubos para recolher amostras no momento 0 e no momento 15, 30,45 e 60 min.
   NOTA: Como alternativa, recolher amostras apenas em tempo de 0 e o ponto final.
   1. Adicionar 245 ul de tampão 1x HNG a cada tubo, a fim de diluir as amostras recolhidas a partir das reações de hidrólise de ATP 1:50.
3. Prepara-se uma banho de gelo seco e etanol para congelar rapidamente amostras para parar a reacção. Em um balde de borracha gelo ou recipiente outra segura (não de plástico), adicione vários pedaços de gelo seco e despeje com cuidado suficiente de etanol 70-100% para cobrir o gelo seco.
4. Diluir proteína purificada em tampão HNG 1x, conforme apropriado (tipicamente 5-10 mM), e manter em gelo.
5. Configurar as reações de hidrólise de ATP.
   1. Em separados 0,5 ml de tubos para cada amostra, adicionar os seguintes reagentes (por ordem): _H2O (até um volume final de 30 ul), 6 ul de 5x tampão HNG ou outra, 3 ul de MgCl 100 mM de ₂ -ATP mistura, e 0,25-5 proteína uM.
   2. Incluir uma única tampão-condicionado de controlo negativo em que é adicionado nenhuma proteína.
6. Retirar 5 ul a partir da reacção no tempo 0, dilui-se a 1:50 em o tubo de 1,5 mL contendo 245 uL preparado tampão HNG, e congelar imediatamente a amostra no banho de gelo seco / etanol.
7. Incubar as reacções a 37 ° C para permitir a hidrólise do ATP a ocorrer durante 1 h. Em cada intervalo (15, 30, 45, e 60 min), remover aliquotas de 5 ul a partir da reacção e adicionar aos tubos de amostra marcado contendo tampão HNG como no passo 1.6.
8. No final da reacção de hidrólise de ATP, mover-se amostras diluídas para um congelador de -80 ° C para armazenamento. Para garantir que todas as amostras são completamente congelado, espere pelo menos 10 minutos antes de prosseguir.

2. As amostras Incubar Contendo gratuito Pi com Detecção de Reagente

1. Descongelar as amostras diluídas contendo alíquotas de reacção de hidrólise de ATP em cada ponto de tempo (obtidos a partir dos passos 1,6 e 1,7) à temperatura ambiente.
2. Defina-se uma placa de 96 poços contendo amostras e padrões de fosfato.
   1. Em 0,5 ml de uma TUser, dilui-se o padrão de fosfato (fornecida com o reagente de detecção Pi) a partir de 800 uM a 40 uM por adição de 5,5 mL de tampão HNG a 800 uM padrão de 104,5 ul. Misturar bem e adicionar 100 ul deste padrão 40 pM Pi a bem A1 de uma placa de 96 poços.
   2. Adicionar tampão HNG 50 ul a poços B1-H1 para 1: 1 de diluições em série do padrão Pi.
   3. Remover 50 pi de 40 uM de Pi bem A1 e adicionar ao tampão de ensaio 50 uL de B1 bem, misturar e remover a partir de 50 ul bem B1 e adicionar ao Poço C1, continuando através de diluições G1 bem. Descartar 50 ul de G1 bem após a mistura para assegurar a cada poço tem o mesmo volume. Bem H1 deve conter apenas buffer para criar um padrão Pi 40-0 M.
      NOTA: Se um factor adicional (tal como um inibidor) foi adicionado às amostras, criar uma curva padrão, contendo esse factor para controlar as variações de libertação de fosfato ou absorvância sob essas condições.
   4. Adicionar 50 ul de cada SAMPle em duplicado à placa. Adicionar amostras a partir do mesmo ponto de tempo em colunas verticalmente (amostra de 1 hora 0 = A2, A3; amostra 2 0 tempo = B2, B3) e diferentes pontos de tempo horizontalmente. Isto permite até 8 amostras e 5 pontos de tempo por placa.
3. Usar uma pipeta estéril para remover o reagente suficiente malaquite verde / molibdato Pi detecção para adicionar 100 ul a cada um dos poços que contêm as amostras e padrões (reagente necessários (ml) = 0,1 x número de amostras e os padrões) e adicionar a um prato para facilitar a pipetagem utilizando uma pipeta multicanal. Não despeje o reagente de detecção diretamente no prato, como a contaminação Pi é provável que ocorra.
4. Usando uma pipeta multicanal, adicionar 100 uL de reagente de detecção Pi a cada poço e misture cuidadosamente por pipetagem para cima e para baixo um número consistente de vezes sem bolhas de introdução, de um modo preferido, a fim de os últimos pontos de tempo para os primeiros pontos de tempo.
5. Incubar a placa durante 25 minutos à temperatura ambiente, ou de acordo com a madireções de nufacturer.

3. Resultados quantificar usando um leitor de microplacas

1. Leia a absorvância das amostras a 650 nm usando um leitor de microplacas de absorvância.
2. Fazer uma curva padrão Pi. Usando um software de gráficos, o gráfico dos valores de absorção para as amostras padrão Pi em função da concentração, a fim de encontrar uma equação usada para resolver a quantidade de fosfato em cada amostra.
3. Calcula-se a actividade de ATPase para cada amostra de calibração com o padrão de fosfato. Fosfato libertado = (OD ₆₅₀ - Y ordenada) / inclinação.
   1. Média do total Pi de duplicatas de cada amostra. Subtrair a leitura de absorvância do controlo só de tampão a partir deste número. Multiplique isso pelo fator de diluição (50 no nosso exemplo).
   2. Determine o Pi nmol libertada por proteína mol. Representação gráfica destes valores para cada ponto de tempo em um ensaio cinético deve render ajuste linear de, pelo menos, R = 0,99 (Figura 1); Se not, o ensaio pode ser ajustado com mais ou menos proteína ou um tempo de incubação mais longo ou mais curto.
4. Representam os resultados como nmol de Pi / mol de proteína / min (Figuras 2, 3), ou como proteínas nmol Pi / g / min, se desejado.

Resultados

A actividade in vitro da ATPase T2S Epse pode ser estimulada por copurification de Epse com o domínio citoplasmático de EPSL (Epse-cytoEpsL) e adição do ácido ¹² cardiolipina fosfolípido. É também possível determinar o papel de determinados resíduos Epse em hidrólise de ATP comparando a actividade do tipo selvagem (WT) para formas variantes da proteína utilizando este ensaio. Aqui, o efeito da substituição de dois resíduos de lisina no domínio de ligação de zinco Epse...

Discussão

Este é um protocolo geral para a medição da actividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para a caracterização bioquímica. Este método é facilmente optimizado; Por exemplo, ajustando a quantidade de proteína, tampão e composições de sal, temperatura, e variando-se o comprimento de ensaio e intervalos (incluindo o aumento do número total de intervalos) pode melhorar a actividade de quantificação. reagentes verde à base de malaquita comercialmente disponíveis são altamente sensíveis, e pode detect...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tampão HEPES	Fisher	BP310-500
Cloreto de sódio	Fisher	BP358-212
Cloreto de magnésio	Fisher	BP214-500
Trifosfato de adenosina (ATP)	Placas Fisher	BP41325
de 96 poços (transparente, fundo plano)	VWR	82050-760
BIOMOL Green	Enzo Life Ciências	BML-AK111	Reagente de detecção de fosfato preferido. Cuidado: irritante.
		de microplacas	BioTek Synergy ou software
		Prism 5	GraphPad