Descrevemos um protocolo básico para quantificar a atividade da ATPase in vitro. Este protocolo pode ser otimizado com base no nível de atividade e requisitos para uma determinada ATPase purificada.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
enzimas de hidrólise de trifosfato de adenosina, ou ATPases, desempenham um papel crítico num conjunto diversificado de funções celulares. Estas proteínas dinâmicas podem gerar energia para o trabalho mecânico, tais como o tráfico de proteínas e degradação, transporte de soluto e movimentos celulares. O protocolo aqui descrito é um ensaio de base para a medição da actividade in vitro de ATPases purificadas para a caracterização funcional. Proteínas hidrolisar ATP numa reacção que resulta na libertação de fosfato inorgânico, e a quantidade de fosfato libertado é então quantificada utilizando um ensaio colorimétrico. Este protocolo altamente adaptável pode ser ajustado para medir a actividade de ATPase em ensaios cinéticos ou terminal. Um protocolo representante é fornecido aqui com base na atividade e as exigências de Epse, a AAA + ATPase envolvida no Tipo II Secreção na bactéria Vibrio cholerae. A quantidade de proteína purificada necessária para medir a actividade, duração do ensaio e o calendário e número de saintervalos mpling, tampão e a composição de sal, temperatura, co-factores, estimulantes (se houver), etc., podem variar a partir dos descritos aqui, e, assim, alguma optimização pode ser necessário. Este protocolo fornece uma estrutura básica para ATPases que caracterizam e pode ser realizado de forma rápida e facilmente ajustado conforme necessário.
Introdução
ATPases são enzimas integrais em muitos processos em todos os reinos da vida. As ATPases atuam como motores moleculares que usam a energia da hidrólise do ATP para alimentar reações tão diversas como tráfego, desdobramento e montagem de proteínas; replicação e transcrição; metabolismo celular; movimento muscular; motilidade celular; e bombeamento de íons1-3. Algumas ATPases são proteínas transmembranares envolvidas no transporte de solutos através das membranas, outras são citoplasmáticas e podem estar associadas a uma membrana biológica, como a membrana plasmática ou as de organelas.
AAA+ ATPases (ATPases associadas a várias ati....
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Protocolo
1. Execute Reaction ATP hidrólise com Proteína Purificada
- Prepare estoques de todos os reagentes necessários para a incubação com proteína purificada.
- Prepare 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) contendo tampão HEPES 100 mM, pH 8,5, NaCl 65 mM e glicerol a 5% (ou outro tampão de ensaio conforme o caso).
- Preparação de 100 mM de MgCl2 (ou outro metal, se é de ATPase dependente de metais) em água.
- Prepare fresco ATP 100 mM em 200 mM Tris Base (não ajustar o pH ainda mais), utilizando alta ATP pureza. Alíquotas e armazenar o estoque de ATP a -20 ° C durante não mais do que algumas semanas, como ATP vai quebrar ao longo do t....
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Resultados
A actividade in vitro da ATPase T2S Epse pode ser estimulada por copurification de Epse com o domínio citoplasmático de EPSL (Epse-cytoEpsL) e adição do ácido 12 cardiolipina fosfolípido. É também possível determinar o papel de determinados resíduos Epse em hidrólise de ATP comparando a actividade do tipo selvagem (WT) para formas variantes da proteína utilizando este ensaio. Aqui, o efeito da substituição de dois resíduos de lisina no domínio de ligação de zinco Epse.......
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Discussão
Este é um protocolo geral para a medição da actividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para a caracterização bioquímica. Este método é facilmente optimizado; Por exemplo, ajustando a quantidade de proteína, tampão e composições de sal, temperatura, e variando-se o comprimento de ensaio e intervalos (incluindo o aumento do número total de intervalos) pode melhorar a actividade de quantificação. reagentes verde à base de malaquita comercialmente disponíveis são altamente sensíveis, e pode detect.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o financiamento de uma bolsa do National Institutes of Health RO1AI049294 (para MS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tampão HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Cloreto de sódio | Fisher | BP358-212 | |
| Cloreto de magnésio | Fisher | BP214-500 | |
| Trifosfato de adenosina (ATP) | Placas Fisher | BP41325 | |
| de 96 poços (transparente, fundo plano) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Ciências | BML-AK111 | Reagente de detecção de fosfato preferido. Cuidado: irritante. |
| de microplacas | BioTek Synergy ou software | ||
| Prism 5 | GraphPad |
Referências
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15....
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Reimpressões e permissões
