Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados Intestinalis Ciona

Resumo

Apresentamos transgênese transitória e silenciamento de genes em Ciona intestinalis, um grupo irmã cordados aos vertebrados, utilizando técnicas de microinjeção e eletroporação. Tais métodos facilitar a genómica funcional neste invertebrados simples que apresenta características rudimentares de vertebrados, incluindo notocorda e na cabeça epitélio sensorial, e muitas orthologs da doença associada genes humanos.

Resumo

Organismos modelo simples são instrumentais para estudos in vivo de processos de desenvolvimento e diferenciação celular. Atualmente, a distância evolutiva ao homem dos sistemas convencionais de modelos de invertebrados e a complexidade dos genomas em vertebrados são desafios críticos para modelar condições normais e patológicas humanas. O cordado Ciona intestinalis é um cordado de invertebrados que emergiu de um ancestral comum com os vertebrados e pode representar características na interface entre invertebrados e vertebrados. Um plano corporal comum com composição celular e genômica muito mais simples deve revelar ligações de redes reguladoras de genes (GRN) e leituras genômicas funcionais que explicam fenômenos na condição de vertebrados. O genoma compacto de Ciona, uma linhagem embrionária fixa com poucas divisões e células grandes, combinado com ferramentas comunitárias versáteis, promove análises funcionais gênicas eficientes neste organismo. Aqui, apresentamos vários métodos cruciais para este organismo modelo promissor, que pertence ao grupo irmão mais próximo dos vertebrados. Apresentamos protocolos para transgênese transitória por eletroporação, juntamente com knockdown de genes mediado por microinjeção, que juntos fornecem os meios para estudar a função gênica e os elementos reguladores genômicos. Estendemos nossos protocolos para fornecer informações sobre como os bancos de dados da comunidade são utilizados para o projeto in silico de experimentos regulatórios ou funcionais de genes. Um estudo de exemplo demonstra como novas informações podem ser obtidas sobre a interação e sua quantificação de fatores neurais selecionados conservados entre Ciona e o homem. Além disso, mostramos exemplos de localização subcelular diferencial em células embrionárias, após eletroporação de DNA em zigotos de Ciona. Finalmente, discutimos o potencial desses protocolos para serem adaptados para interferência de genes específicos do tecido com métodos emergentes de edição de genes. As abordagens in vivo em Ciona superam as principais deficiências dos organismos modelo clássicos na busca de desvendar mecanismos conservados no programa de desenvolvimento de cordados, relevantes para a pesquisa de células-tronco, descoberta de medicamentos e subsequente aplicação clínica.

Introdução

Recentemente, seqüência do genoma e dos repertórios de genes transcritos tornaram-se acessíveis em vários organismos modelo. Determinação do gene ligações funcionais, no entanto, e como essas conexões são conectados no DNA para executar a actividade de transcrição ao longo do tempo e espaço embrionário, continuam a ser um desafio importante, especialmente em vertebrados. A complexidade das interações reguladoras e da complexidade dos genomas ^1,2, nomeadamente em vertebrados, abrandar análises funcionais eficientes, em particular ao nível do ADN in vivo. Na verdade, nenhum GRN está atualmente analisados ​​desde a fecundação até o estado final, terminalmente diferenciadas do organismo em desenvolvimento.

O ascidian C. intestinalis representa um organismo modelo em que tal completa GRN analisa pode ser possível. Possui um genoma não duplicado típico de invertebrados com pouca redundância gene. Vertebrados, em contraste foram submetidos a duas rodadas de duplicação do genoma que have gerado famílias de genes maiores e diversificação funcional, mas também redundância entre parálogos. As sequências -regulatory cis compactos (as unidades de controle de GRNs) de C. intestinalis, e uma linhagem embrionária invariável com poucas células são uma reminiscência de C. elegans. Além disso, a sua posição filogenética única como um grupo irmã de invertebrados para vertebrados dentro cordados permite a observação do desenvolvimento, em resolução celular, do plano do corpo formando cordados ^3-6.

A questão-chave que garante o sucesso futuro da genómica funcional em organismos modelo é a geração de um grande número de embriões para quantitativos in vivo perturbações. O desenvolvimento da técnica de microinjeção em ovos Ciona ^7, e a possibilidade de obter rapidamente muitos animais transgénicos transitoriamente por eletroporação in vivo em centenas de Ciona zigotos ^8,9 tem sido um grande avanço na Ciona genómica funcional. Aqui, nós apresentamos a técnica de microinjecção mais trabalhoso para alvejar genes individuais que continua a ser o método de escolha para morfolino (MO) silenciamento de genes mediado por, nomeadamente de transcritos maternos. oligos MO tipicamente segmentar o ATG iniciador ou os locais de splice do ARN e interferir com a tradução da proteína. Em seguida, mostramos como electroporação em ovos fertilizados de Ciona permite que um grande número de embriões para ser analisada de forma quantitativa, abrindo assim vias de análise eficiente de potenciadores in vivo e de gain- específico do tecido ou perda de função de abordagens, com a possibilidade para as manipulações e análises simultâneas. Nós demonstrar ainda mais como ferramentas de comunidade Ciona são utilizados para na previsão in silico de regiões reguladoras e clonagem eficiente dos completos quadros de leitura aberta (ORF) em vetores de expressão. Finalmente, demonstramos diferenciais localizações subcelulares de fluorescente etiquetadoou proteínas sobre a superexpressão marcado por electroporação.

Protocolo

1. Preparativos para microinjeção e Eletroporação em Ciona Ovos e zigotos

1. Preparar 10 litros de água do mar artificial com HEPES (ASWH) para a cultura de embriões. Dissolve-se NaCl a 420 mM, 9 mM de KCl, 10 mM de _CaCl2 · 2H ₂ O, MgCl 24,5 mM ₂ .6H ₂ O, _MgSO4 25,5 mM-7H ₂ O, e 2,15 mM de _NaHCO3 em água bidestilada _(ddH2O) por agitação durante a noite. Adicionar HEPES 5 mM, pH 8,0, e verificar / ajustar o pH a 8,0. Armazenar o ASWH a 4 ° C. Aquecê-lo até 18 ° C e filtrar com papel de filtro antes de usar.
2. Prepare 20x solução dechorionation inativada: 20% de tioglicolato de sódio, 1% pronase em ASWH. Armazenar alíquotas de 500 uL a -20 ° C, e dilui-se até um volume final de 10 ml ASWH antes da utilização.
3. Prepare 15 a 20 pratos de cultura para os ovos / embriões. Pour fundida de agarose 1% em ASWH em 3,5, 5, 9 ou 15 cm pratos de petri, revestindo-os com uma camada fina de 1-2 mm.Deixe a agarose solidificar e cobrir as placas com ASWH. Armazená-las a 4 ° C durante 1-2 semanas no máximo. Substitua o ASWH antes do uso.
4. Preparar pratos de injeção especiais.
   1. Pour uma camada de espessura de 5-7 mm de agarose a 1% fundida em 5 cm de caixa de Petri, e colocar um molde em que a agarose (tal como um fecho de bloqueio do fecho de correr colada a uma lamela de cobertura de plástico) para produzir uma reentrância após a solidificação da agarose que pode conter os ovos. Prepare 4 a 5 pratos de injecção e cobrir com ASWH. Armazenar a 4 ° C e substituir com ASWH fresco antes da utilização. Utilize apenas pratos frescos para injecção (máximo de um dia de idade).
5. Prepare β-galactosidase (LacZ) de Tampão de Coloração: 1 mM de _MgCl2 .6H ₂ O, 3 mM de K ₄ [Fe (CN) _6] · 3 H ₂ O, 3 K ₃ mM [Fe (CN) _6] em fosfato tamponado solução salina (PBS) com Tween (PBT) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2 mM de KH ₂ PO _4, 0,05% de Tween). i lojan escuro a 4 ° C. Preparar substrato LacZ 5-bromo-4-cloro-3-indolil SS-D-galactopiranósido (X-gal, 10 L / mL) em aliquotas de 40 mg / ml em dimetilf ormamida (DMF) e estoques de armazenar a -20 ° C até usar.
6. Mergulhe pipetas Pasteur na torneira água durante a noite para evitar que os embriões de degola.
7. Prepare agulhas de injecção.
   1. Configurar um extrator micropipeta em condições como o calor 425, puxar 75, velocidade 75 e hora 200 (a partir de um teste de rampa de filamentos de 415).
   2. Puxar 4 a 5 capilares de vidro contendo filamentos para a produção de 8 a 10 longas agulhas finas, normalmente fechada, na ponta. Armazenar as agulhas numa caixa de agulhas livre de poeira, ligado a dobrar a fita adesiva num suporte elevado, para evitar a quebra das pontas e que é conveniente para a agulha de enchimento.
      NOTA: Testar as agulhas obtidos pela injeção de alguns ovos com corante vital verde (como descrito na seção 6) e ajustar a agulha puxando condições para obter uma forma de ponta que permite a aperfeiçoá-lo e REPETITive injecção tal como foi descrito em 6.6.
8. Preparar a solução de injecção. Prepare 4 ul de solução de injecção, por exemplo, composto por 1 ul de PB 2 mM, 2 ul de 10 ug / ul de corante vital verde e 1 ul de ddH ₂ O. Adicionar uma concentração final de 0,05-0,5 ug / uL tampado ARNm ou 20 ng / uL do plasmídeo de ADN de acordo com a pergunta experimental. Misture bem. Manter em gelo, se a solução contém ARNm.

2. Recolha de gametas

1. Adultos Dissecar Ciona em um 18 ° C arrefeceu quarto embrião. Utilize uma tesoura pequena e começar a partir da extremidade que se opõe os sifões no lado da exalação (mais curto) sifão sob a qual o oviduto e o canal de esperma de execução.
2. Expor o oviduto e delicadamente fazer uma incisão no oviduto usando a ponta de uma tesoura. Soltar os ovos outflowing diretamente em uma placa de 6 poços contendo ASWH pressionando suavemente o oviduto com a tesoura fechados tirando o exemplogs. Transferir os ovos restantes com uma pipeta Pasteur pré-lavado com ASWH.
3. Depositar os ovos de diferentes animais em diferentes poços. Observe a qualidade do ovo no âmbito de dissecação.
   NOTA: Ovos bem desenvolvidos são redondos e cor de rosa a ligeiramente de cor amarela. Eles estão rodeados por um revestimento vitelino não celular, o cório que se forma um espaço perivitelino bem definida em torno do ovo. O córion está associada com células de teste em suas células do folículo dentro e em forma de estrela no seu exterior. Ovos de baixa qualidade muitas vezes não têm o espaço perivitelínico ou as células do folículo. Eles parecem menos redondo, mais granular ou diferentes na cor. oócitos imaturos são menores e têm uma cor branca de prata.
4. Cortar a conduta de espermatozóides com a tesoura e recolher o esperma concentrado para um tubo de 1,5 ml usando uma pipeta de Pasteur separada. A piscina do esperma de diferentes animais (pelo menos dois) no mesmo tubo. esperma Armazenar a 4 ° C durante vários dias.

3.Fertilização

1. Recolha de esperma e os ovos a 18 ° C, conforme descrito no passo 2.
2. Ative o esperma.
   1. Prepare 1 ml ASWH em um tubo de 1,5 ml e misturar-se com 50 ul de 1 M de Tris pH 9,5. Em seguida, adicionar 20 ul de esperma concentrado e misturar suavemente por inversão do tubo.
   2. Verifique a activação de esperma em uma gota de esperma colocado sobre uma tampa de uma pequena caixa de Petri ou uma lâmina de vidro e observar no âmbito do escopo de dissecação. Os espermatozóides devem estar nadando freneticamente.
3. Adicione 100-200 mL da solução de espermatozóides ativados a cada poço de ovos (que contêm entre 100 e 1.000 ovos), misture bem por pipetagem cima e para baixo, de modo que os ovos estão flutuando no meio. Espere por 10 min sem mover os embriões.

4. dechorionation de ovos e embriões

1. Dilui-se uma alíquota de 500 ul de solução 20x dechorionation para 10 ml em ASWH. Ative a solução dechorionation pela adição gota a gota 200 mL de 2.NaOH 5 M para a solução dechorionation 10 ml de 1x. Um precipitado leitoso vai formar. Misture suavemente invertendo o tubo.
2. Recolher os ovos ou zigotos (após os 10 min de espera no passo 3.3) em tubos de vidro utilizando uma pipeta de Pasteur. Reúnem-se os ovos a partir de 2 a 3 animais em um tubo (cerca de 1,000-5,000 ovos / tubo). Sedimentos com uma centrífuga de mão, girando a alta velocidade (1200 xg) durante cerca de 20 segundos para formar uma pelete de embriões na parte inferior do tubo. Lentamente parar a centrífuga e remover o ASWH com uma pipeta de Pasteur.
3. Adicionar 4 ml de solução dechorionation activado para os peletizadas ovos / zigotos em cada tubo. Suspenderá os ovos / zigotos cuidado pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta Pasteur torneira tratada com água coberto com uma pequena pêra de borracha. A solução deve girar amarelado após 1-3 min.
4. Seguir o dechorionation pela remoção de uma pequena alíquota da suspensão de ovos / zigoto dechorionating utilizando a pipeta de Pasteur. Depositar uma gota em um slide e observar sob o s dissecandolidar. Mantenha pipetando ovos / zigotos cima e para baixo e verificar cada 20-30 seg.
   NOTA: as células do folículo Primeira destacar, em seguida, o córion fica amarelo e opaco, e, finalmente, destaca dos zigotos. Rosa dechorionated ovos / zigotos irá afundar para o fundo do tubo de vidro. O dechorionation não deve demorar mais do que max. 5 min.
5. Encha o tubo com ASWH uma vez 50% de ovos / zigotos são dechorionated.
   NOTA: Muito gentilmente centrífuga (8 xg) por cerca de 10-15 seg correspondente a uma velocidade muito baixa apenas o suficiente para sedimentar os ovos dechorionated / embriões. Lentamente parar a centrifugação a fim de não perturbar o sedimento de ovos / zigotos na parte inferior do tubo.
6. Remover quase todo o líquido do tubo de vidro, incluindo o material flutuante com ovos incompleta dechorionated / zigotos e substituir com ASWH. Lentamente pipeta cima e para baixo para lavar e gentilmente centrifugar novamente como no passo 4.2. Em alternativa, aguarde zigotos para se estabelecer por gravidade. Lave mais uma vez até que não haja detritos córion é lEFT.
7. Transferência de ovos / zigotos para placas de cultura utilizando uma pipeta de Pasteur recém-lavado. Mantenha os zigotos (não ovos) a baixa densidade (cerca de 200 embriões por placa de 10 cm) para evitar a sua degola juntos. Cultura os embriões para a fase desejada a temperaturas entre 13 e 20 ° C. Alternativamente, os zigotos electroporate (passo 5) ou injectar os ovos não fertilizados (Passo 6).

5. Eletroporação

1. Fertilizar os ovos e dechorionate os zigotos a 18 ° C como nos pontos 3 e 4. Fornecer entre 50 e 400 ovos por amostra eletroporação.
2. Preparar DNA de plasmídeo em 50 ul de um tubo de 1,5 ml (máx. 100 ug de ADN de plasmídeo em 50 ul de _ddH2O) e adicionar 200 ul manitol 0,95 M. Misturar bem com vórtex.
3. Expedição e gravidade sedimentar as zigotos dechorionated em siliconizadas tubos de 1,5 ml. Remover o ASWH para baixo para a marca de 100 mL sobre o tubo.
4. Prossiga, consecutivamente, para cada tubo zigoto como segue: adicionarsolução de ADN / manitol utilizando uma pipeta de Pasteur. Misturar suavemente com os zigotos e imediatamente tomar-se o manitol / suspensão de ADN / zigoto e transferência para uma cuvete de electroporação de 4 mm.
5. Coloque a tina imediatamente no suporte da eletroporação e dar um único pulso de 16 ms a 50 V.
6. Retire os zigotos da tina usando a mesma pipeta de Pasteur e espalhá-los para fora em uma placa de cultura contendo ASWH fresco e filtrada. Pipetar os zigotos antes de começar a clivagem cerca de 1 hora após a fertilização (hpf) a 18 ° C.
7. Lavar a pipeta entre as amostras numa proveta de ASWH.
8. Cultura dos zigotos 15-20 ° C a uma densidade suficientemente baixa de cerca de 200 embriões por placa de 10 cm para evitar a sua degola juntos.

6. microinjeção

1. Prepare dechorionated ovos para a injecção.
   1. Dechorionate os ovos separadamente, de 2-4 animais, como descrito na seção 4. Mantenha o e não fertilizado e dechorionatedGGS em pequenos pratos de cultura de agarose revestidas separadas. Lavar os ovos várias vezes nos pratos para remover os detritos.
   2. Teste fertilizar os pequenos lotes de ovos dechorionated (cerca de 50) a partir de cada indivíduo. Use um separada 5 cm de placa para cada lote e aplicar 2 mL de esperma ativada (passo 3.2). Misture bem agitando os pratos e espalhar-se os ovos no prato, movendo os pratos de lado. Mantenha o esperma e os ovos juntos por cerca de 10 minutos sem se mover.
   3. Eliminar um máximo de esperma, como segue: transferir os ovos fertilizados para um prato de cultura fresca ou de enxaguamento duas vezes com ASWH fresco. Deixar os embriões não perturbados clivagem até o estádio de 32 células (a 18 ° C durante cerca de 3 horas após a fertilização). Escolha ovos do melhor desenvolvimento lote (melhor percentagem de fertilização e mais padrão de clivagem regular) para a microinjeção.
2. Configurar as agulhas de injecção.
   1. Backfill 4 agulhas de injecção em posição vertical, para permitir a gravidade FLow ao longo do filamento. Depósito 0,5 solução ul injecção (passo 1.8) contendo corante vital verde no back-end das agulhas que estão posicionados de ponta de agulha para baixo. Espere até que o líquido para encher a ponta da agulha na parte inferior.
   2. Reposicionar as agulhas na horizontal e aterrar-los com óleo mineral utilizando um metal fino e longo ou ponta de pipeta de plástico. Lentamente sobrepor a solução de injecção com óleo mineral expelindo todas as bolhas de ar durante o enchimento da agulha.
3. Configuração do Micromanipulator em um 18 ° C Refrigeração quarto.
   1. Ligue o tubo de plástico do suporte de agulha para uma seringa de vidro de 10 ml cheio com óleo mineral. Aterrar a tubagem e suporte da agulha com óleo e expulsar as bolhas de ar.
   2. Inserir a agulha no suporte da agulha e posicionar o suporte no micromanipulador.
   3. Ajustar o movimento do suporte de agulha ao longo de uma linha recta com um ângulo de 45 ° em relação à superfície.
4. Orientar o dechorionated ovos ao longo da reentrância de agarose de o prato de injecção de modo que os ovos podem ser injectados um a um sob o microscópio de dissecação.
5. Quebrar a ponta da agulha, se necessário, empurrando suavemente a agulha contra a agarose ou contra uma peça de cobertura de vidro deslizante colocada sobre a agarose. Ligeiramente pressionar o botão de seringa para verificar se a ponta da agulha está aberto (conteúdos de agulhas verdes irá expulsar).
6. Injectar a não fertilizado ovos um a um pela primeira introdução da agulha dentro do ovo e ligeiramente aspiração para romper a membrana de ovo seguido por injecção. Injectar solução de injecção de verde para o meio do ovo para um máximo de 1/3 do diâmetro da célula. (Isto corresponde a aproximadamente 30 pl para um diâmetro de 140 um ovo).
7. Transferir os ovos não fertilizados injetados a um prato de cultura fresco e incubar-los a 15-18 ° C até a fertilização.
8. Fertilizar os ovos injectados com esperma recém-activado como nas adubações de teste (passo 6.1.2). eliminatEA máximo do esperma, transferindo os zigotos para um prato de cultura fresca. Espalhar-se os embriões e não perturba-los durante as fases de clivagem (até ao estádio de 32 células).
9. Cultura os embriões para a fase desejada a uma temperatura compreendida entre 13 e 20 ° C.
10. Recolher os embriões agitando-los para o meio da placa e transferindo-as em tubos de 1,5 ml siliconizados. Fix e mancha, ou montar (Passos 7 e 8).
11. Comparar os fenótipos obtidos para os embriões de controlo injectados.
    NOTA: Injectar uma segunda MO sobreposição não, que tem como alvo a mesma transcrição para obter fenótipos idênticos. Resgatar o fenótipo MO específico (s) com um mRNA modificados codificação de sua proteína de interesse, mas que não é reconhecida pelos MOs. Injectar um MO controlo que não dá nenhuma fenótipo.

7. LacZ Coloração

1. Coletar os embriões em um estágio desejado em siliconizadas tubos de 1,5 ml e corrigi-los em 0,2% de glutaraldeído em 1 ml ASWH para 15a 30 min no máximo.
2. Lavar 2x 10 minutos com 1 ml de 1x PBT.
3. Lavar uma vez em 500 ul de tampão de coloração LacZ. Substituir com o substrato de X-Gal suplementado 1 ml de tampão de coloração (use 10 ul / ml de 40 mg / ml de X-Gal estoque). Transferir os embriões numa placa de 12 poços para uma melhor observação da coloração.
4. Incubar no escuro. Incubação variam desde 0,5 h até durante a noite a 4 ° C, à TA ou a 37 ° C, dependendo da força do condutor expressando LacZ.
5. Lavar os embriões até 4 vezes em 1 ml de 1X PBT para remover o tampão de coloração.
6. Pós-fix durante 10 min à temperatura ambiente com paraformaldeído a 2% (PFA) em 1 ml de 1x PBT ou 0,2% de glutaraldeído em 1 ml de 1x PBT para interpretação e visualização dos embriões corados.

8. Montagem de fluorescência Labelled Wmbryos

1. Corrigir os embriões de um estágio de desenvolvimento desejado por 20 min em 2% PFA em 1 ml ASWH.
2. Lavar os embriões 2x em 1 ml de 1x PBT. Evitar quaisquer exposições de luzure, mantendo os embriões em condições escuras.
3. Transfira até 50 embriões a um slide. Remover um máximo de PBT primeiro com uma pipeta e cuidadosamente com uma toalha de papel.
4. Adicionar meio de montagem de 20-25 mL.
5. Adicionar uma lamela, posicionando-o em um ângulo (de um lado primeiro) e, lentamente, abaixe-o com um objecto pontiagudo (agulha, fórceps, ponteira), evitando bolhas até a amostra é coberto. Fixar a lamela em suas bordas usando pontos de uma unha polonês transparente.
6. Selar toda a lamela com uma unha polonês após a secagem. Loja no escuro a -20 ° C.

Resultados

Microinjeção para estudos de rede gene regulador

Embriões da ascídia intestinalis Ciona estão bem adaptados para gene estudos regulatórios funcionais ou de genes a nível linhagem celular e com resolução de celular. mRNAs, OMs ou rótulos podem ser microinjeção no óvulo não fertilizado ou em blastômeros individuais após a fertilização. MO gene mediada knockdown usando a técnica de microinjeção é descrito na etapa 6. MOs visar especificamente o mRNA de genes selecionados e evitar a sua tradução em proteínas. MO mediada perda de função (LOF) de genes de desenvolvimento muda a expressão de um amplo conjunto de genes a jusante, em geral, revelando um vislumbre do embrionária GRN ^10. Tais análises em Ciona desde que o primeiro modelo regulamentar todo embrião em um metazoan ^11. Figura 1 mostra um exemplo de como microinjectina foi utilizada para estudar a regulação a montante da expressão do factor de transcrição Ci -Myelin conservada (Ci -MYT) na fase de gástrula embriões de Ciona. Monitorizada por hibridação in situ (ISH), expressão endógena (Figura 1a, esquematizado na Figura 1-A ') é observado nos precursores placa neural 6-fila, de nomeadamente o cérebro (linhas III / IV, a vermelho) e a medula espinal ( row I, em verde). Além disso, a regulação a montante Ci -MYT foi analisado por injecção MO segmentação vários factores que são expressos em ou adjacentes aos precursores neurais anteriores Ci aparecimento expressão -MYT (Figura 1b-g). MO knockdown de factores embrionárias precoces, tais como a caixa de Aa forkhead (foxa-a), factor de transcrição e o factor de crescimento de fibroblastos 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (Figura 1b ou 1c, respectivamente) elimina geral Ci -MYT expressão. Outros factores de transcriçãoafetam apenas parcialmente expressão -MYT Ci resultando em infra-regulação mediada por MO de um subconjunto de precursores cerebrais (cabeças de seta azul na Figura 1d, F e G). Por outro lado, Ci expressão -MYT é ectopicamente activado a regulação negativa da Nodal (Figura 1e, cabeças de setas vermelhas), sugerindo que Nodal normalmente reprime a expressão -MYT Ci nestes precursores cordão nervoso laterais.

A electroporação para estudos funcionais e potenciadoras de genes eficiente

A electroporação de ADN de plasmídeo em zigotos Ciona é um método eficiente para transgénese transiente e subsequente observação de alterações fenotípicas in vivo. Ao contrário de micro-injecção de ARNm, electroporação permite a sobre-expressão especifica de tecido, em que as regiões de codificação de genes (ORFs, grelhas de leitura aberta) são expressas sob o controledos drivers específicos de tecidos. Estes constituem, normalmente, regiões -regulatory cis de genes bem conhecidas (tais como o intensificador brachyury para expressão na notocorda precursores ^8). Por outro lado, a electroporação é instrumental para a análise eficiente de novas regiões reguladoras onde os genes repórter (lacZ ou proteína fluorescente verde, GFP) revelam a sua actividade in vivo. O fluxo de trabalho para a identificação e análise subsequente electroporação mediada de uma nova região reguladora tal (de Ci -MYT) é mostrado na Figura 2.

Um vasto repertório de dados da comunidade Ciona, facilmente acessíveis em ascidian navegadores genoma específicas ^12,13, como a Rede Ascidian para In Expressão situ e Embryological Dados (ANIS) ^23, é inspecionado para a identificação in silico das regiões reguladoras (Figura 2A). Subsequente reação em cadeia da polimerase (PCR) clonagem baseada destas regiões em vectores de expressão permite o teste electroporação mediada in vivo. (Figura 2B). O navegador genoma captura de tela na Figura 2A mostra a região a montante do modelo transcrito KH de Ci -MYT (três primeiros exons, na laranja, e dois íntrons são visíveis). Diferentes faixas navegador genoma anotar dados do genoma funcional previsto para esta região, tais como imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de dados ¹⁴ (aqui apresentados para ZicL, Ci -Zinco dedo do cerebelo L), conservação da sequência entre duas espécies Ciona relacionados ^15,24 ou nucleossomo ocupação ^16,17 (de cima para baixo na Figura 2A). De um modo geral, as regiões codificantes de proteínas exônico são altamente conservadas (pista alinhamento na Figura 2A). picos adicionais de alta conservação aparecem em regiões não codificantes a montante e no primeiro intron. Dois destes são previstos para ser um nucleossoma livreegundo um algoritmo de sequência baseado ^16,17 (frames vermelhos na Figura 2A), sugerindo a acessibilidade aos fatores de transcrição. Na verdade, os sinais de Chip-on-chip ¹⁴ para Ci -ZicL fator de transcrição de ligação (barras verdes na Figura 2A) são enriquecidos nestas duas regiões conservadas. Além disso, usando uma interface ²⁵ que procura por potenciais locais de ligação do factor de transcrição, foram identificados locais ZIC localizados dentro das sequências do genoma marcados por grupos Ci -ZicL chip (setas laranja e sequências com sublinhado ZIC-core, Figura 2A). A ligação do factor de transcrição Ci -ZicL no conservada e previsivelmente nucleossomo regiões reguladoras livres Ci -MYT é consistente com a regulação negativa da expressão Ci -MYT observada em MO-injeção de experimentos knockdown mediadas segmentação ZicL (Figura 1d).

Depois de determineração potenciais regiões -regulatory cis in silico para a expressão Ci -MYT, estes são PCR amplificado a partir de DNA genómico Ciona e inserido por recombinação clonagem em repórter LacZ plasmídeos ^19. As construções são depois submetidas a electroporação em ovos fertilizados Ciona (Figura 2B) e analisadas para a sua actividade através de coloração LacZ (Figura 3).

A Figura 3 mostra que, em uma tal abordagem in silico, foi possível identificar dois -regulatory sequências cis separados que recapitulam domínios de expressão de ARNm Ci -MYT (comparar com a figura 1a). Geralmente, os embriões transgénicos transitoriamente electroporadas com ADN de plasmídeo de expressão de mosaico mostra em apenas aquelas células que incorporaram o ADN. Mosaico expressão de LacZ é assim accionado por pmyt-R3 e podem ser encontrados em todos os precursores que também expressam Ci (Figura 3A, B, cabeças de seta roxo e vermelho, respectivamente). Em contraste, pmyt-R5 está ativo apenas no posterior (linha I) precursores placa neural e começando na fase posterior nêurula (Figura 3c, as cabeças seta vermelha). As duas regiões codificar, portanto, dois aspectos espaciais e temporais distintos de regulação de genes Ci-myt. Curiosamente, ambas as regiões reguladoras também manchar precursores adicionais que não eram vistos na ISH, nomeadamente no anterior e placa neural lateral e no músculo (Figura 3a, b, rosa, branco, e pontas de flechas amarelas, respectivamente). Tal expressão mais ampla pode apontar para repressivas elementos que não estão contidas nos fragmentos reguladoras isoladas (como por Nodal que reprime destino neural lateral, veja a Figura 1e) ou baixos níveis de expressão detectados com a acumulaçãosinal enzimática LacZ.

Em adição aos estudos potenciadoras, electroporação em Ciona também facilita as análises funcionais dos genes que codificam Ciona pela sua sobre-expressão. Uma grande coleção de Ciona ORF completo está disponível para a comunidade, e foi, além disso, anotada para orthologs humanos, incluindo genes associados à doença ^18. Genes individuais ou grupos de genes deste compatível biblioteca de ADNc completa de ORF-clonagem de recombinação (Figura 2B) são facilmente transferidas para vectores de destino que contêm os controladores apropriados para serem expressas em embriões. Os clones resultantes de expressão pode, também, ser co-electroporado com repórter cis -regulatory construções para testar o seu papel putativo na activação potenciador. A Figura 2B ilustra o isolamento de clones completos ORF para os factores de transcrição Ci -ZicL e CI- gataa e sua recombination em vetores de destino adaptadas que podem conter marcas de translação ¹⁹ (por exemplo, verde fluorescente Vênus ou hemaglutinina viral (HA)-tag) e um driver específico de tecidos, tais como a Friend Of Gata região reguladora (driver pfog) para o início de expressão pan-ectodérmica ¹⁵ utilizado no presente estudo. O efeito de Ci -ZicL sobre-expressão nos tecidos ectodérmicos e neuroectodérmicos foi analisada por co-electroporação de pmyt-R3> LacZ e pmyt-R5> repórteres LacZ (Figura 3b ', b' 'e C', C '', respectivamente). Nossas análises sugerem que eletroporação Ci -ZicL pode ativar a expressão Ci -MYT através pmyt-R3 e regiões potenciador pmyt-R5 como ambas as construções repórter mostraram expressão LacZ ectópica em regiões ectodérmicas (cabeças de seta verde na Figura 3B ', b' 'e c &# 39;, c '',). Tal como mostrado na Figura 3d, a electroporação de ADN de plasmídeo em centenas de ovos Ciona permite a quantificação estatisticamente relevante de mudanças de expressão, ilustrados para pmyt-R3> expressão ectópica de LacZ após concentração, pan-ectodérmica expressão Ci -ZicL dependentes.

A electroporação in vivo para a localização subcelular

A Figura 4 ilustra a localização subcelular de factores de transcrição marcados, quando expressa em cima electroporação em blastómeros ectodérmicas utilizando construções de expressão adaptadas (esquematizado na Figura 2B). Por factores de C-terminal de marcação de transcrição (tais como Ci -GATAa) com uma etiqueta de Vénus (Figura 4b) ou um HA-tag (Figura 4c) e que sobre-expressam-los nos tecidos ectodérmicos (pfog) Pudemos observar que in vivo, 'Ci -GATAa é principalmente localizada núcleos, como esperado para um fator de transcrição, enquanto a expressão de Vênus é onipresente, incluindo o citoplasma. Experiências semelhantes podem ser realizados para estudar a dinâmica de localização subcelular ao longo do tempo, do indivíduo ou combinações de factores de transcrição, possivelmente, revelando a sua co-localização com diferentes marcações.

Figura 1:. Avaliando regulação -MYT Ci por micro-injecção em ovos Ciona expressão Ci -MYT mRNA no WT e Morpholino (MO) injetado embriões. (A) padrão de expressão de WT Ci -MYT na placa neural. (A ') Representação esquemática de precursores manchado na placa neural (NP). Row I / II: o destino neural posterior; linha III / IV: destino neural anterior; linha V / VI: palpo destino. ( .. g> b - g) a expressão Ci -MYT sobre microinjeção de vários MOs para derrubar genes indicados que participam no início Ciona GRN (imagens adaptado de Imai et al, 2006) ¹¹ Ci -MYT, Ci -myelin fator de transcrição; WT, tipo selvagem; setas azuis: perda de sinal -MYT Ci; setas vermelhas: sinal de Ci -MYT ectópica. Barra de escala = 100 mm refere-se a todas as imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho para em busca silico das regiões potenciador e recombinação clonagem para transgenia transitória por electroporação em embriões Ciona (A) Um instantâneo do asco ANIS ^23.navegador genoma dian identifica sequências reguladoras a montante de Ci - BRT. Frames vermelhos marcar duas regiões -regulatory cis potenciais, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) e pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) que foram selecionados para análise por eletroporação. Os nomes das faixas: sondas ZicL: Chip-on-chip de dados ^14; KH2012 Transcrições: Ciona intestinalis modelos de transcrição; Alinhamento Score Cs / Ci LastZ: conservação da sequência entre Ciona savignyi (Cs) / intestinalis Ciona (Ci) ^15,24; . Segal 2006 previu nucleossomo ocupação versão 1: Pintainho treinados algoritmo computacional por Segal et al, 2006 ¹⁶ aplicado a Ci como em Khoueiry et al, 2010 ¹⁷ barras verdes:.. Ci -ZicL ChIP picos ^14; setas laranja: previu locais ZIC; GCTG: sítio de ligação do núcleo ZIC. (B) Esquema para gerar construtos superexpressão de uma Cionuma biblioteca de ADNc ORF de comprimento completo, recombinados nos vectores de destino que contêm os controladores de tecidos específicos (pfog) e etiquetas proteicas subsequentemente co-electroporadas com construções repórter (como pmyt-R3> LacZ ou pmyt-R5> lacZ) para in vivo leitura Ci. - MYT, Ci fator -myelin transcrição; Ci -ZicL, Ci -Zinco dedo do fator de transcrição L cerebelo;. pfog, região reguladora de Ci -Friend de GATA por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: embriões electroporated Ciona mostrando Ci -ZicL inducible Regulamentação cis espaço-temporal de Ci -MYT LacZ embriões corados no meio-gastrul.um (mg) / late-gastrula (LG) ou nêurula fase inicial (EN) são mostrados que foram co-electroporado com qualquer pmyt-R3> LacZ ou pmyt-R5> LacZ e uma construção de controle (pfog> mCherry) ou pfog> ZicL. O motorista pfog ¹⁹ medeia (pan-animal) expressão ZicL ectópica no ectoderma e neuroectoderma e provoca mancha LacZ ectópica nestas células. (A) atividade pmyt-R3 LacZ em embriões em estágio mg / lg (pequenas setas, painel esquerdo) ou em territórios esquemáticos correspondentemente coloridos (círculos azuis, painel direito); vista vegetal (VG). Row I / II: o destino neural posterior; Row III / IV: destino neural anterior; Row V / VI: palpo destino. (B) a atividade pmyt-R3 em estágios PT Nos tecidos como em um. (B ') actividade ectópica pmyt-R3 em presença de co-electroporação Ci -ZicL é indicada por setas verdes. (B '') Mesmas embriões como em b ', orientada pólo animal até (a). ( pmyt-R5 LacZ em En estágios ectópica atividade pmyt-R5 mediante co-eletroporação Ci -ZicL (c ') é indicado por setas verdes. (C '') Mesmas embriões como em C ', mas orientada pólo animal até (a). (D) Quantificação de experiências representativas de Ci -ZicL sobre-activação pmyt-R3 em baixas concentrações. Uma repetição biológica é representada Ci -MYT, fator de transcrição -myelin Ci;. Ci -ZicL, Ci -Zinco dedo do fator cerebelo L transcrição; Ci -FOG, Ci -Friend de GATA; WT, tipo selvagem; MG, mid-gastrula; LG, late-gastrula; eN, nêurula precoce; , Uma visão animal; vg, vista vegetal; nls LacZ, sinal de localização nuclear para LacZ. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. Localização subcelular diferencial de proteínas após eletroporação Localização de Vênus-tag ou Hemagglutinin- (HA) tagged proteínas sobre-expressos em células ectodérmicas usando o driver pfog ^19. (A - c) imagens DIC. (A ', b') correspondentes imagens de fluorescência. (C ') imagem de fluorescência correspondente mediante marcação histológica imune com TRITC. Barra de escala = 100 uM refere-se a todas as imagens. DIC, de interferência diferencial Contrast. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Há duas técnicas principais para gerar embriões transgénicos Ciona: microinjecção de ARN ou ADN e a electroporação de ADN. Estas técnicas de perturbação gene em embriões Ciona foram utilizados pela primeira vez na década de 1990 ^7,8 e desde então sucessivamente melhorado, e agora utilizado em Ciona (e outros gêneros ascidian) ²⁰ em todo o mundo.

As etapas críticas no protocolo

Transgénese bem sucedido em gametas Ciona que são facilmente colhidos em animais adultos depende de uma série de factores críticos. A qualidade dos gametas depende da época de desova (geralmente de maio a dezembro, no Atlântico Norte, a mudar com a temperatura da água e oxigenação), sobre a qualidade da água do mar nos aquários (pelo salinidade correta, os adultos se manter saudável durante 2-4 semanas) e, finalmente, para um manuseamento correcto de gâmetas em cima extracção dos adultos, conforme detalhado a seguir para os vários passos doprotocolo.

Durante as etapas de preparação, incubação pipetas Pasteur com água da torneira vai impedir embriões de degola e água do mar pré-incubação de placas de Petri revestidas de agarose irá remover substâncias tóxicas libertadas a partir da agarose. Geralmente, os pratos podem ser preparados até 2 semanas antes do uso, armazenados a 4 ° C para evitar o crescimento bacteriano e lavado de fresco antes da utilização. Um dia de idade, pequenos pratos parecem melhor para injectáveis.

Eficiência e duração da dechorionation é um passo crucial no protocolo como um tratamento prolongado de ovos / embriões irá prejudicar o desenvolvimento. A preparação cuidadosa (sem agitação) e correto armazenamento (a 4 ° C durante até uma semana) preservar a qualidade da solução dechorionation. Proteases na solução perder eficiência se quer misturado violentamente na preparação ou ao longo do tempo, especialmente se forem mantidas à temperatura ambiente por longos horas / dias. Nós otimizamos este passo crítico com a solução de dechorionation fresco convenientementepreparado a partir de alíquotas congeladas de 20x solução de reserva.

manuseio correto dos ovos dechorionated frágeis / embriões é essencial e tosquia ou esfaqueamento de embriões, enquanto pipetagem será prejudicial. Quando pipetagem, os embriões são mantidos tanto quanto possível, em suspensão (por suavemente 'sopro' líquido a girar los seguido por pipetagem suave mas rápida), enquanto segura a pipeta de vidro na vertical, em vez de posição horizontal. Tal cuidado aplica-se a todas as etapas de pipetagem para lavagem, ressuspensão e transferência de ovos / embriões dentro e fora de tubos, tinas ou placas, antes e após a fixação. Após a fixação, cuidados especiais devem também ser tomadas para dispositivos de pipetagem separadas para ao vivo contra embriões fixos para evitar qualquer toxicidade a partir de restos de fixadores.

Microinjeção é bastante complicado em Ciona ovos / embriões devido ao seu pequeno tamanho e a resiliência da membrana vitelina e criticamente depende de um tamanho da ponta otimizada dea agulha de injecção, um ângulo perfeito de injecção (movimento da agulha em uma linha, ao longo do raio do ovo) e um afinado, quebra manual da membrana vitelina (por sucção antes da aspiração para injecção). Este último só é possível se as bolhas de ar são completamente eliminados do tubo de injecção, que contém óleo mineral para suavizar a pressão de aspiração / injecção. Além disso, os pedaços menores de pó ou ovo detritos irão entupir a agulha, e são facilmente evitados por condições de trabalho limpas e passos de lavagem para a ovos antes da transferência sobre o prato de injecção. Após a injecção, a transferência de ovos em placas frescas irá evitar os efeitos tóxicos de embriões mortos não tendo sobrevivido ao processo de injecção.

Solução de problemas

problemas potenciais no procedimento pode ser abordada pelos seguintes soluções. As baixas taxas de fertilização podem surgir de activação de esperma insuficiente, baixa limpeza ovo ou grandes volumes de fertilização. use freshlY reunidas e diluídas menos esperma. Verifique o movimento do esperma após a ativação. Lavar os ovos com ASWH antes da fertilização, tal como descrito na etapa 4.2. Reduzir o volume de água e reduzir a quantidade de ovos por prato fertilização / poço. Perder embriões durante os passos de preparação podem ser evitadas adicionando uma gota de solução dechorionation centrifugar para baixo de forma mais eficiente os ovos undechorionated / embriões. Dechorionation tempo deve ser otimizado como ovos parcialmente dechorionated não sedimentos e dechorionation prolongada é tóxico, fazendo com que os embriões para explodir.

desenvolvimento Asynchronous podem surgir a partir de esperma residual liberado durante a dissecção. Mantenha os lotes de ovos separados de diferentes animais para evitar a fertilização cruzada não controlada. O desenvolvimento anormal pode ter diversas causas. No início e no final da estação, depois de manter o embrião a partir de diferentes indivíduos separados, os melhores lotes pode ser seleccionado. Evite perturbar os embriões para o10 min que seguem a fertilização para evitar interferir com a sua segregação ooplasmic. Certifique-se de que os embriões não começar a dividir ao ser transferido como pipetagem separa os blastômeros irmã e resulta em embriões parciais. Use menos esperma para ovos dechorionated para evitar polispermia. Use pratos de agarose preparadas na hora, mas lavadas. Certifique-se de que o dispositivo de pipetagem é fixador livre. Manter embriões de controle que não foram dechorionated e não electroporated para detectar em que o desenvolvimento etapa foi interrompida. Complementar os embriões com antibióticos, se a contaminação e decomposição ocorre.

Se o dispositivo de injecção ter 'entupido, a abertura da agulha de injecção pode ser verificada por meio de expelir algum do seu conteúdo coradas. material de entupimento pode ser varrido arrastando cuidadosamente a ponta da agulha através da agarose. As bolhas de ar no tubo de injecção e / ou a agulha deve ser removido. Mudar a agulha para um melhor controle do volume de injecção como o neeponta dle pode quebrar ou entupir ao longo injeção. Lavar os ovos e colocá-los em um prato de injeção limpo se os detritos acumulados no prato. Centrifugar a solução de injecção antes de encher agulhas frescas, a fim de sedimentar quaisquer pequenas partículas ou cristais. Também útil é praticar a injeção apenas com corante vital. Verifique a técnica de injecção por meio da fertilização de ovos injetados e não injetados. Finalmente, a consulta com um colega experiente pode ser útil para melhorar a técnica de injeção.

Para controlar os efeitos fora do alvo um segundo sem sobreposição MO e salvamento com um mRNA modificado que não é reconhecido pelos MOs podem fielmente descartar efeitos fenotípicos inespecíficos em Ciona.

Microinjeção: importância e limitações

Microinjecção em Ciona foi utilizada para gerar o primeiro plano para uma rede de transcrição embrião inteiro (GRN) num cordados ^11. No entanto, apesar de um tal Remarkable realização, microinjecção em embriões de Ciona tem limitações, devido ao tamanho relativamente pequeno (0,14 mm de diâmetro) de ovos de Ciona. Comparados com os de outras espécies cordados, onde DNA estranho / mRNA é introduzido por microinjeções, ovos Ciona são comparativamente difíceis de manusear e a taxa de embriões Ciona injetados por experimento permanece baixa (em média 30 a 50 embriões por experiência), impedindo análises quantitativas. No entanto, para os factores maternos perturbador da Ciona, microinjecção de OMs é o método de escolha também para estudar o seu envolvimento no início zigótica de desenvolvimento a partir da célula 16-32 fases ^15. Além disso, é possível, embora muito mais difícil de microinject blastómeros individuais até ao estádio de 16-32 células. Finalmente, microinjecção continua a ser a técnica mais eficiente para a geração de embriões transgênicos (por mRNA ou injeção DNA) em outros animais que Ciona espécies de ascídias, para o qual totalmente optimiprotocolos eletroporação zed não existem.

Eletroporação: importância e limitações

Para superar os baixos números e outros constrangimentos de micro-injecção, a maior parte da comunidade Ciona usou electroporação de ADN de plasmídeo, uma vez que foi desenvolvido e publicado como um protocolo optimizado e padronizado por Zeller et ai., Em 2004, ^9. Na verdade, milhares de embriões transgénicos Ciona pode ser gerado dentro de uma hora com um máximo de 500 embriões simultaneamente electroporadas em uma cuvete com um único pulso de 50 V de 16 mseg. A abordagem de gerar um enorme número de embriões transgênicos ainda é o único entre os organismos modelo cordados. Isto levou Ciona de ser rapidamente reconhecida como um sistema poderoso modelo para a realização de análises in vivo de potenciais regiões -regulatory cis e localização celular / subcelular, como exemplificado aqui.

embora electroporation em zigotos Ciona tem fundamentalmente revolucionou o campo da pesquisa cordados GRN, a técnica, no entanto, enfrenta alguns limites. Primeiro, os plasmídeos são introduzidos em embriões transitoriamente Ciona e são provavelmente herdada como matrizes extracromossómicos, fazendo com que a estabilidade do DNA de plasmídeo electroporado especulativa. Além disso, é muito difícil, ou até mesmo impossível, de controlar as cópias dos plasmídeos electroporadas que serão absorvidos por zigoto, resultando, assim, em flutuações fenotípicas. Um outro problema que faz com que seja difícil de interpretar os resultados eletroporação é um fenômeno que chamamos de mosaicismo. DNA de plasmídeo a electroporação pode ser retomado em diferentes posições do embrião em fase de uma célula; que determina quais e quantos quartos do zigoto receberá plasmídeo a ser herdado pelos descendentes blastômeros. Tais variações claramente fazer a interpretação dos efeitos quantitativos mais difícil. No entanto, a maioria dos problemas que vêm com electroporavariabilidade ção são resolvidos por uma quantidade apropriada de amostras biológicas, com contagem e estatísticas de LacZ (ou GFP) células positivas, que é facilmente obtida em um único lote.

Versatilidade e potencial da eletroporação para a engenharia genética

Eletroporação, eventualmente, permite a triagem meados de taxa de transferência de potenciais regiões -regulatory cis e análises quantitativas da função do gene, uma vez clonados repórter ou expressão plasmídeos. Devido ao genoma Ciona compacto, identificação e clonagem de regiões reguladoras potenciais é bastante simples ^3. A estratégia para usar a riqueza de dados comunidade é demonstrado na Figura 2A. Clonagem de repórter e genes plasmídeos codificação é facilitada pela geração de Ciona adaptado, GATEWAY suites vetor compatíveis ¹⁹ e um comprimento total compatível biblioteca ORF ^18. Ambas as ferramentas estão disponíveis para a comunidade epermitir a restrição recombinação eficiente e livre de enzima dos condutores reguladoras e regiões codificadoras, como representado na Figura 2B.

Nos últimos anos, a eletroporação foi adaptado com sucesso para alcançar a manipulação gene alvo de tecido com plasmídeos que expressam as ferramentas de edição de genes como os componentes CRISPR / Cas9 sob o controle do tecido drivers específicos ^21,22. Tais abordagens rapidamente avançar nossa compreensão da dinâmica de GRNs e os mecanismos de sinalização potencialmente conservadas, incluindo códigos de fator de transcrição envolvidos na formação de tecido e a saída gradual de pluripotência. Além disso, deficitária específico de tecido ou com ganho de função (por abordagens CRISPR / ou por sobre-expressão Cas9) utilizando electroporação serão instrumentais para estudar Ciona ortólogos de genes associados a doenças humanas. Na verdade, catálogos para orthologs Ciona de genes de doenças humanas e seu comprimento total ORF que codificam clones estão prontamente disponle para análise em Ciona ^{1 8.} Devido à grande duplicações do genoma em vertebrados, a maioria dos genes humanos possuem paralogs funcionalmente redundantes que complicam as análises da função do gene ^1. Ciona ser um sistema mais simples com o arranjo típico tecido cordados em larvas deve revelar papéis fundamentais de tais importantes genes, frequentemente funcionalmente conservadas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laboratório com temperatura constante (~ 18 ° C)			Para embriões
Ciona intestinalis adultos	UPMC - Station Biologique, Roscoff, França		Para coleta de gametas
NaCl	Roth	3957.1	Para ASWH
KCl	Roth	6781.1	Para ASWH
CaCl2x2H2O	Roth	A119.1	Para ASWH
MgCl2x6H2O	Roth	2189.1	Para ASWH
MgS04x7H2O	Roth	P027.2	Para ASWH
NaHCO3	Roth	6885.1	Para
ASWH Hepes	Roth	HN78.3	Para ASWH
Tioglicolato de sódio	Sigma	MZ-6	de Decorionação
	Sigma	T0632-100G	Para
D-Manitol	Sigma Aldrich	M9546-250G	Para DNA de plasmídeo de eletroporação
(preparação >1µ g/µ l)	Macherey-Nagel	740410.100	Para eletroporação ou microinjeção
de agarose	qualquer fornecedor		Para revestir placas de cultura de embriões
Placas de Petri de plástico	VWR	612-2079	Revestidas com 1% de agarose em ASWH, cobertas com ASWH
Tesouras pequenas	qualquer fornecedor		Para dissecar gametas
NaOH	Roth	6771.1	Para ativar a solução de descorionação
Tris	Roth	5429.3	1 M pH 9.5, para ativação de espermatozóides
Pipetas Pasteur	VWR	612-1701	Tratado por imersão em água da torneira durante, pelo menos, 12 horas
Centrífuga manual	Hettich Zentrifugen	1011	Utilização de tubos de centrífuga de vidro
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	Sigma	T3406-250EA
Tubos Eppendorf de 2 ml	Sigma	T3531-200EA
Eletroporador quadrado	Bio Rad Gene Pulser Xcell
Cubetas de eletroporação 4 mm	Eurogentec	CE-0004-50
Lamínulas	Sto Premium	PR248212600
Lâminas de vidro	VWR	ECN 613-1551
Glutaraldeído	Sigma	G6257-10ML	Para fixação em coloração LacZ
Paraformaldeído	Sigma	P6148-500G	Para fixação de amostras fluorescentes
Vectashield	Vector	H-1000	Para montagem de amostras fluorescentes
X-Gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil ß-D-Galactopiranosídeo)	Roth	2315.2	LacZ substrato; estoque em 40 mg/ml DMF (Dimetilformamida)
K4Fe(CN)6• 3H2O	Merck	4984	Para tampão de coloração LacZ
K3Fe(CN)6	Merck	4973	Para tampão de coloração
LacZ Na22HPO4	Roth	4984.2	Para PBT
KH2PO4	Roth	3904.2	Para interpolação PBT
	Sigma	SLBJ5103V	Para PBT
Óleo Mineral	Sigma	M8410	Testado em cultura de embriões
Verde Vital Dye	Fast Green Sigma	F7251	para microinjeção; 10µ g/µ l
Extrator de Micropipeta (Flamejante/Marrom)	Sutter Instruments	Modelo P-97	Para puxar agulhas de injeção
Capilares de vidro borossilicato GC100TF-10	Harvard Apparatus Ltd. UK	30-0038	1,0 mm O.D. x 0,78 mm I.D., contendo filamento, para microinjeção
Micromanipulador	Narishige	MWS-2	Sistema Hidráulico de Óleo de Três Eixos; para movimento fino 3D durante a injeção
Suporte de injeção	Narishige	1M-H1	Para segurar agulhas de injeção, todo o sistema preenchido com óleo mineral
Seringa de vidro Walter	Graf & Co GmbH & Co. KG	No. 95199.10427A4	10 ml FortunaOptima; preenchido com óleo mineral, para ajuste fino da pressão de microinjeção
Morfolinos	GeneTools LLC, Pilomath, OR, EUA		Injeção a 0.25-0.5 mM
Kit de mRNA	Ambion mMessage mMashine Limitado		a 0.05-0.5µ g/µ l
		plasmídeo	a 20 ng/µ l
Kit de clonagem de recombinação	Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen	11789-013
Kit de clonagem de recombinação	Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen	11791-019
anticorpo anti-HA tag	abcam	ab9110	para imunofluorescência, use 1:400 em 3% BSA/PBT
TRITC anticorpo anti-coelho de cabra	Jackson	111-025-144	para imunofluorescência, use 1:300 em BSA/PBT a 3%