Artigo de método

Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

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DOI:

10.3791/54315

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20 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a funcionalização de superfície personalizável do sistema de destiobiotina, estreptavidina e APTES para isolar tipos específicos de células de interesse. Além disso, este manuscrito cobre as aplicações, otimização e verificação desse processo.

Resumo

Um dos fatores limitantes para a adoção e avanço da medicina personalizada é a incapacidade de desenvolver ferramentas de diagnóstico para sondar nuances individuais na expressão de paciente para paciente. As metodologias atuais que tentam separar as células para preencher esse nicho resultam na interrupção da expressão fisiológica, tornando a técnica de separação inútil como ferramenta diagnóstica. Neste protocolo, descrevemos a funcionalização e otimização de uma superfície para a captura e liberação celular. Esta superfície funcionalizada integra anticorpos biotinilados com uma superfície de vidro funcionalizada com um aminosilano (APTES), destiobietina e estreptavidina. A liberação celular é facilitada pela introdução de biotina, permitindo a coleta e purificação das células capturadas pela superfície. Essa liberação é feita por meio do direcionamento da porção secundária destiobiotina, o que resulta em um paradigma de liberação muito mais suave. Essa redução nos reagentes agressivos e nas forças de cisalhamento reduz as mudanças na expressão celular. A superfície funcionalizada captura até 80% das células em uma mistura de células únicas e demonstrou 50% de captura em uma mistura de células duplas. Aplicações desta tecnologia em xenoenxertos e estudos de separação de câncer são investigadas. Técnicas de quantificação para verificação de superfície, como leitor de placas e análises ImageJ, também são descritas.

Introdução

De bancada abordagens de separação de células atuais (por exemplo, de células activadas por fluorescência 1, captura a laser micro-dissecção 2, talão de separação imuno-magnética 1) pode levar várias horas de preparação e triagem. Estes grandes escalas de tempo podem afetar os níveis de resposta e expressão fisiológicos, resultando em análises que não são representativas da resposta fisiológica 3. São necessários sistemas que podem rapidamente e eficientemente isolar tipos de células específicas, sem perturbar os níveis de receptor de superfície celular a fim de melhorar o isolamento de células e de enriquecimento para aplicações biomédicas. Portanto, a justificativa para nossa abordagem é desenvolver uma abordagem suave para o isolamento de células.

O "laboratório em um chip" conceito oferece a promessa de ordens de magnitude mais rápido isolamento de células (horas-a-minutos), e mais frequentemente envolve a captura de células em uma superfície e células ou conte intracelular liberandoNTS através física 4,5 ou métodos químicos 6. Embora estas abordagens oferecem algumas vantagens, tais como a identificação de expressão de proteína de 7,8, identificando a expressão do ARN de 9-11, ou mesmo proporcionar células para a cultura in vitro 12,13, muitas destas técnicas não pode ser traduzido para o diagnóstico, tais como perfis de receptor de células devido aos seus ambientes não-fisiológicos. Agentes de elevação enzimáticos, tais como colagenases podem também afectar essas quantidades de receptores de 14,15, ou seja, técnicas de quantificação receptor celular que usam esses agentes de elevação não irá gerar dados fisiológicos precisos. Lise celular impede a diferenciação entre os receptores de superfície nativas, bem como as que foram anteriormente internalizado 16. Este protocolo descreve uma abordagem rápida e suave para isolamento de células.

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Protocolo

1. Limpar a superfície de vidro e preparação de reagentes

  1. Colocar uma superfície de vidro numa máquina de plasma de oxigénio durante 5 min a 50% de potência para o limpar.
  2. Prepare reconstituída (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) solução de 2,5 ml de 2%, por adição de 50 ul de APTES e 2,45 ml de etanol num tubo cónico.

2. APTES e DSB funcionalização

  1. Adicionar solução APTES para as superfícies. Pipete 150 pi por poço para 8 placas de poços. Pipetar 100 ul por poço de placas de 24 poços. Pipetar 1,1 ml para pratos de vidro de 60 x 15 mm. Cobrir as superfícies para evitar a evaporação e distribuição desigual de solução APTES. Coloque as superfícies num agitador de plataforma durante 50 min à temperatura ambiente, o que cria uma distribuição uniforme da camada de APTES.
    NOTA: APTES é um aminosilano que forma a primeira camada de superfície. Se utilizar uma superfície diferente, heuristicamente determinar o volume de solução necessário para cobrir a superfície.
  2. Seleccionar a temperatura para o forno, ao passo que as superfícies estão no agitador: Aquece-se a 55 ° C durante 2 h para as placas de poços e 8 placas de 24 poços. vidro de calor apenas pratos a 90 ° C durante 1 hora.
  3. Lavar as superfícies com etanol.
    1. Administrar a quantidade de etanol necessária referenciando baseado na superfície usado. Adicionar 150 ul de etanol a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de etanol a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de etanol para pratos de vidro.
    2. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Lavar mais duas vezes com etanol.
      NOTA: Se qualquer um dos vidro placas bem inferior têm todo o plástico em si, não aquecê-los acima de 65 ° C, como o plástico vai começar a derreter e deformar.
  4. Seco com gás de azoto a 100% dispensado a partir de um tanque. Coloque as superfícies no oven.
  5. Preparar 2,5 ml de uma solução de d-destiobiotina (DSB) através da combinação de 1,5 mg / ml de DSB em 37,5 ul de dimetil sulfóxido (DMSO), e 5 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) em 2462,5 ul da 0,1 M de 4-morpholinoethanesulfonic hidrato de ácido (MES) (6 pH) tampão. Em seguida, combinar as duas soluções.
  6. Adicionar 1 ml de 2-mercaptoetanol β, após 15 min, à solução para extinguir a reacção entre OSC e EDC. Remover APTES quentes funcionalizados superfícies de vidro do forno. Aguarde 5-10 min para as superfícies de vidro para esfriar.
  7. Adicionar tampão MES a superfície de lavar, utilizando-se quantidades com base na superfície. Adicionar 150 mL de tampão MES a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de tampão MES a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de tampão MES para pratos de vidro.
  8. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não está apontado directamentena superfície. Lavar mais duas vezes com tampão MES.
  9. Aplicar a solução ORL-se às superfícies para permitir a incubar. Adicionar 150 ul de solução de DSB por poço para 8 placas de poços. Adicionar 100 ul de solução de DSB por poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de solução de pratos DSB vidro.
  10. Coloque as superfícies de vidro DSB cobertos em uma toalha de papel úmido dentro de uma placa de Petri. Cobrir e incubar em um 4 ° C geladeira por 18-24 horas.

3. Estreptavidina funcionalização

  1. Lavar cada superfície de vidro três vezes com 1 ml de 1,0 x tampão fosfato salino (PBS). Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Diluir a solução estreptavidina (SAv) estoque para 0,4 mg / ml (recomendado).
    NOTA: PBS é isotónica para que ele possa ser utilizado como um meio de diluição e de enxaguamento. PBS é utilizado como um solvente para o SAv, e, portanto, não afecta a capacidade do SAV para se ligar à superfície.
  2. Aplicar 0,4 mg / ml de solução SAv uniformemente às superfícies de modo a que uma fina camada de formas na parte inferior do vidro, seleccionar a quantidade de solução base na superfície. Para 8 placas de poços, adicionar solução SAv 150 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para placas de 24 poços, adicionar solução SAv 100 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para pratos de vidro, adicione 1,1 ml 0,4 mg solução SAv / ml.
  3. Cubra e mover as placas para uma 14 centímetros de Petri para reter a umidade. Incubar a placa de Petri na geladeira por 18-24 horas.
    NOTA: É essencial utilizar volumes consistentes de APTES, DSB, e SAv em cada superfície.
  4. Lavar cada superfície de vidro três vezes com 150 ul de PBS para remover SAv. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
  5. Umedeça uma toalha de papel wom água deionizada e coloque a toalha de papel plana em 14 centímetros de Petri em torno das placas de reter a umidade nos poços. Cobrir a placa de Petri contendo os poços. Incubar a placa de Petri em um 4 ° C Nível de Biossegurança 1 (BSL-1) geladeira até ser necessário.

4. Captação celular and Release

  1. Comece com balão T175 (s) de células destinadas para a experiência. Aspirar a mídia do frasco (s). Lavar a mídia restante com 5 ml de temperatura ambiente PBS. Aspirar PBS do frasco (s).
  2. Adicionam-se 10 ml de agente de elevação não-enzimática, tal como células de dissociação da solução, para o frasco T-175 de células. Colocar o frasco no incubador durante 6 min para permitir a elevação de células a partir do frasco.
  3. Após 6 min, adicionar 10 ml de solução salina equilibrada fria de Hank (HBSS; Veja Lista de Materiais) para inactivar o agente de elevação. Retire 20 uL de células para contar o número de células em solução, utilizando um hemacitómetro.
    NOTA: Dependendo do funcsuperfícies utilizadas na experiência de captura tionalized, o número de células necessário varia. Para funcionalizados 8 placas de poços, usar 300.000 células por poço. Para pratos de vidro funcionalizadas, usar 1,1 milhões de células. Para funcionalizados placas de 24 poços, 125000 células são recomendados. Mais informações sobre a contagem de células é encontrada no suplemento.
  4. Repita os passos 4.1- 4.3 para outro frasco de células, se menos células estão presentes do que o necessário para o experimento. Combinar as suspensões de células e as células contam à obter o número total de células em solução.
  5. Girar suspensão de células numa centrífuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para obter um pellet de células concentradas. Localizar a quantidade apropriada de HBSS para adicionar à suspensão de células para obter uma concentração de 1 x 10 6 culas por ml, em seguida, aspirar o sobrenadante das células centrifugadas, e adicionar o volume calculado. Este volume pode ser calculada usando as equações no suplemento.
  6. Pipeta cima e para baixo (triturado) para voltar a suspender the células em solução e reduzir a aglomeração celular na solução que pode reduzir a ligação do anticorpo. Dividir a solução celular no controle separado e soluções experimentais. Ver Arquivo Suplementar para componentes e cálculos.
  7. Adicionar os anticorpos biotinilados às respectivas soluções de células como descrito no ficheiro suplementar. Incubar durante 30 min a 4 ° C num misturador de extremidade-sobre-extremidade.
    NOTA: Para as células MCF7GFP, 0,5 mg / ml de hlgG ou anticorpos / ml de HLA-ABC 0,5 mg são recomendados. Para macrófagos RAW, 1 mg / ml mCD11b são recomendados pela metade do volume para explicar as diferenças de diluição. No caso de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), 0,5 mg / ml de hCD31 é recomendado.
  8. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS. Para esta experiência, uma placa de 8 também é aconselhável.
    1. Adicionar 150 uL de HBSS a cada poço para 8 placas de poços. Lavar mais duas vezes usando HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço.Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Manter frio a 4 ° C.
  9. Adicionar soluções de células aos poços e esperar 45 minutos para as células a incubar em gelo no agitador. Adicione a solução de biotina em HBSS estéril usando volumes calculados como descrito no suplemento.
  10. Remover a solução de células dos poços de vidro usando HBSS.
    1. Gentilmente pipeta 150 uL de HBSS a cada poço. Em seguida, pipetar a HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
    2. Repita mais duas vezes. Após lavagem, adiciona-se aos poços de HBSS para manter as células húmidas.
  11. Adicione 150 ml de solução de biotina 20 mM a cada liberação respectivo bem, e depois esperar 20 min para permitir a reação.
  12. Recordar células não-especificamente ligados por lavagem com HBSS como indicado acima, e em seguida, se usando células marcadas por fluorescência, proceder a fluorescência das células imagem. Também imagem de células vivas em um recipiente de vidro (como um controlo, para comparar com as células no poço). Se utilizando células transfectadas verdes proteína fluorescente (GFP), a excitação vai ser 470 nm, e a emissão será 515 nm.

5. Anticorpo Optimization: Antibody Titulação

  1. Começar por levantar as células do frasco T75 T175 ou como explicado no passo 4.1- 4.3.
    NOTA: Estes volumes são calibrados para placas de 24 poços, mas pode ser alterado para se adequar a qualquer superfícies de vidro funcionalizadas através de testes heurística. Uma titulação de anticorpos representativo é mostrado na Figura 1.
  2. Contagem de células usando o hemacitómetro, e depois girar a solução de células num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml, utilizando os cálculos descritos no suplemento.
  3. Dividir a 1 milhões células por ml de solução em seis soluções diferentes de 500 ul em diferentes tubos de centrifugação para o anticorpo (Ab) soluções.
    1. Dilui-se a solução stock de anticorpo de 10 ug / mL, 1 ug / mL, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Criar os controles, utilizando 100 ul de tampão de coloração (PBS + 1% de azida de sódio + BSA a 1%), e 500 ul de células de controlo sem Ab nele. Para o controlo em branco (n AB e não células), utilizar uma solução de 300 ul de PBS.
      NOTA: CUIDADO: A azida de sódio é extremamente tóxico, explosivo e extremo cuidado deve ser tomado quando usá-lo. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) e usar o equipamento de segurança apropriado.
  4. Combinar e incubar as soluções ab com as soluções de células no misturador de extremidade-sobre-extremidade a 4 ° C durante 30 min. Lavar as placas de 24 poços funcionalizados com HBSS três vezes. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Segure o pipette num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
  5. Alíquotas de 125 ul de cada solução de amostra para os APTES apropriadas, DSB, e SAv funcionalizado bem. Incubar a 4 ° C ou sobre gelo durante 45 min sobre a superfície de vidro. Lavar a superfície com HBSS três vezes para remover as células não especificamente ligados. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Não lave a linha de fundo, como aqueles são os controles.
  6. Adicionar 150 mL de HBSS a cada poço lavado, coloque as placas de 24 poços em gelo, e então usar um leitor de placas para medir a fluorescência das células GFP (excitação 485 nm / emissão de 528 nm).

Optimization 6. celular: Titulação celular

  1. Levantar as células como mencionado nas etapas 4.1 -4,3.
  2. Contagem de células utilizando um hemacitómetro. Spin down celular paralução num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml.
    NOTA: Para mais informações sobre a utilização do hemacitómetro pode ser encontrado no suplemento.
  3. Pipeta de 1,6 ml da solução de células para o estoque de 1,6 milhões de células e coloque em um tubo cônico. Pipetar 800 ul de células a partir da solução de células para o estoque de 800.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 80 mL do estoque de células para o estoque de 80.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 8 mL do estoque de células imagens 8.000 células e coloque em um tubo cônico.
    NOTA: As concentrações são dadas por 8 medições de placa bem, replicar, conforme necessário. Um exemplo de saída da placa é mostrado na Figura 2.
  4. Aqui as quatro soluções de reserva e girar num centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Re-suspender todas as soluções estoque em 400 mL de HBSS.
  5. Adicionar 1,6 mL de anticorpo ng / ml 100 ao estoque de 1,6 milhões de células, 0,8 μl ao estoque de 800.000 células, e 0,5 l para todas as outras reservas. Incubar o anticorpo durante 30 min no misturador de extremidade-sobre-extremidade durante 30 minutos a 4 ° C. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS três vezes.
    NOTA: A placa de funcionalizado 8 é recomendado para quantificação microscopia, enquanto que a placa de 24 poços funcionalizado é recomendado para quantificação leitor de placas. Concentração de anticorpo para estoque de células 8000 não foi reduzida para permitir que o factor limitante da superfície de captura para não ser a falta de anticorpos em solução, mas as propriedades de captura de superfície.
  6. Aplicar 150 ul das soluções de amostra a cada poço. Aplicar o estoque de 1,6 milhões de célula para a primeira coluna de poços à esquerda. Aplicar o banco de 800.000 células para a segunda coluna a partir da esquerda. Aplicar o banco de células de 80.000 para a terceira coluna da esquerda. Finalmente, aplicar o estoque 8000 células para a última coluna. Incubar durante 45 min a 4 ° C num agitador.
    NOTA: O 1,6 milhãoda célula serve como a concentração mais alta a ser testada, e é o dobro da quantidade de células que é utilizado normalmente em experiências de separação de células (600.000 células por poço) O estoque 800000 célula serve como controlo para a experiência, uma vez que é a concentração celular típica que é usada em experiências de separação de células (3.000.000 células por poço). O estoque de 80000 células serve como uma diluição de dez vezes para testar para concentrações mais baixas para captura celular (30.000 células por poço). O estoque de células 8000 serve como uma diluição de cem vezes para usar como um teste para verificar o limite inferior da separação celular (3.000 células por cavidade).
  7. Enxágüe com HBSS três vezes. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Colete todas as lavagens.
  8. Imagem as células em um microscópio de fluorescência, se utilizando 8 pratos bem, tirar fotos de cada surrosto, e aplicam-se 150 ul a cada superfície biotina durante uma hora a 4 ° C num agitador. Após uma hora, lavar os poços de libertação de biotina com HBSS 3 vezes como antes. Recolha todas as lavagens de poços para contar com o hemocitômetro e da imagem dos poços de libertação.
  9. Aplicar 150 mL de solução de biotina excesso de 20 mM a cavidades apropriadas de liberação de biotina, durante 1 hora, se estiver usando placas de 24 poços, e depois enxaguar esses poços 3 vezes com HBSS. Quantificar placas de 24 poços utilizando um leitor de placas. Usar um hemacitómetro para contar as células de todas as lavagens assim recolhidos.

Análise 7. Imagem

Nota: O pacote de software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) é recomendado para análise de imagem. Inicialmente, as imagens foram convertidas em imagem em tons de cinza, e então o brilho / contraste foi alterado para trazer para fora das células.

  1. Carregar a imagem, e converter em tons de cinza, clicando na guia imagem, em seguida, role para baixo até "Type" e clicando em4; 8 bit ".
  2. Aumentar o contraste da imagem clicando na guia de imagem e, em seguida, deslocando-se para "Ajuste". Clique em "Brilho e Contraste" e use as barras de rolagem para fazer as células se destacam. Se estiver usando imagens de fluorescência, inverter as imagens para tornar as células mais definidos.
  3. Carregar um plug-in para ImageJ chamado ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) para analisar as imagens.
  4. Abrir ITCN. Quando uma caixa de diálogo que pede ao utilizador com vários parâmetros para estimar o tamanho da célula, defina a largura mínima da célula de interesse em primeiro lugar. Clique na opção "Detectar escuras Peaks" se a imagem é fluorescente e as células são escurecidas.
  5. Defina o valor limite a 2, inicialmente, e, em seguida, apertar o botão de "Contagem". A versão recém contados da imagem aparecerá com pontos vermelhos delineando onde as células foram contadas.
  6. Ajuste o parâmetro de limite e largura para obter dados mais precisos celulares por defining do tamanho de uma "célula". Nota: O número de células contadas será em uma caixa de diálogo à direita. alteração de parâmetros dará número diferente de células contadas.
  7. Continuar a percorrer os parâmetros de limites e de largura até que uma boa estimativa é alcançado para o número de células.

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Resultados

Usando este protocolo que mostram captação celular (Figura 3A) e a libertação de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, bem como controlos de células vivas (Figura 4). Foram quantificados a captura celular como 60% e 80% foram liberados (Figura 3C). Quando estendido esta abordagem a uma mistura de RAW 264.7 de macrófagos e células MCF7GFP, 50% de macrófagos RAW foram capturados (Fig. 3D) e 80% de macróf...

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Discussão

Melhorias nas técnicas de isolamento de células promove estudos científicos em relações estrutura-função em neurociência 18, caule de programação celular em biologia regenerativa, e sinalização angiogênico em biologia vascular 19. De facto, a cultura de células primária 20 (por exemplo, células HUVEC) em biologia vascular é feito principalmente por meio do uso de técnicas de isolamento de células. Isolamento celular também foi usada recentemente para o fluxo quantitativo (qFlow)...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à American Cancer Society, Illinois Division (282802) e à National Science Foundation CBET (1512598) pelo apoio financeiro. Também gostaríamos de agradecer à Dra. Dianwen Zhang, do Instituto Beckman da Universidade de Illinois, pelo treinamento em microscopia. Por fim, gostaríamos de agradecer a Jared Weddell, Stacie Chen e Spencer Mamer pelas discussões perspicazes.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(3-Aminopropil) trietoxissilano (APTES)Acros Organics919-30-2Usado para fazer solução APTES a 2%
Plasma Cleaner PicoDienerModelo 1Limpa superfícies e permite a ligação de PDMS ao vidro
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Usado como mecanismo de liberação na superfície de captura celular. 
dimetilsulfóxido (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDissolve o DSB em solução
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Ativa ácidos carboxílicos e permite a ligação de proteínas à superfície do vidro.
lâmina de cultura de 8 poços não revestidaBD FalconCaixa de 24: 354118
Caixa de 96: 354108		Usado em experimentos celulares envolvendo microscópio de fluorescência Zeiss, como experimentos iniciais de quantificação de captura e liberação
Placas de 24 poços com fundo de vidroMatTekP24G-0-13-FUsado em experimentos celulares envolvendo o leitor de placas, como experimentos de anticorpos e titulação celular
MercaptoetanolScience Lab60-24-2Usado para extinguir a reação entre EDC e DSB
Hidrato de ácido 4-morfolinoetanossulfônico
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250Usado para fazer 0,1 M MES Buffer para uso em reação EDC
Precision OvenThermo Scientific11-475-153Usado na cura da camada PDMS e APTES.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Usado para garantir a distribuição uniforme de APTES em superfícies.
1x Estreptavidina 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Proteína de ligação à biotina. Pode causar irritação.
Prato de vidro de 5 cmFisher Scientific08748AUsado em estudos HUVEC, bem como em futuros estudos de perfil.
Placa de Petri de 14 cm com TampaSigma-AldrichZ717231Utilizada para guardar amostras que estão sendo funcionalizadas e transportá-las.
Células MCF7-GFPCell BiolabsAKR211Armazenado em nitrogênio líquido
RAW264.7 macrófagos de camundongoATCCTIB-71Presenteado a nós pelo laboratório Smith da Universidade de Illinois. Armazenado em nitrogênio líquido.
TrypLELife Technologies12605036Armazenado em 100 ml à temperatura ambiente
Dulbecco' s modificado Eagle mediumCell Media Facility na Escola de Ciências Químicas da UIUC50003PCFornecedor: Corning
Aminoácidos não essenciaisCell Media Facility na School of Chemical Sciences da UIUC25-025-CIJá adicionado ao DMEM pela instalação. Fornecedor: Corning.
Raspador de célulasFisher Scientific12-565-58Pequeno 23 cm 50 pack
Solução de Dissociação CelularCorningMT-25-056CIUsado para levantar células não enzimaticamente para uso em experimentos celulares
HemacytometerHausser02-671-54Usado para contar células para quantificação de soluções celulares e efetividade de captura e liberação.
BiotinaAmresco58-85-5Usado para liberar células da superfície.
HBSSCriado a partir da ReceitaN/AUsado para manter as células vivas em suspensão, bem como lavar superfícies de ligação não específica. Adaptado de Cold Spring Harbor Protocols: In 500  ml, use 4  g NaCl, 0,2  g KCl, 0,0402  g Na2PO4• 7H2O, 0,03  g KH2PO4 e 0,5  g de glicose. Adicione água DI para chegar a  500 ml, filtre e leve à geladeira.
Anticorpo HLA-ABCBioLegend311402Anticorpo usado para capturar células MCF7gfp
Anticorpo hIgGBioLegendHP6017Anticorpo usado para capturar células MCF7gfp
Células MCF7 GFPCell BiolabsAKR-211Linha de câncer de mama luminal que foi transfectada com proteína fluorescente verde.
Cônicas SortidasThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml cônicas de plástico para armazenar soluções e alíquotas.
Rotadores de mini-tubo (misturador de ponta a ponta)Fisher Scientific05-450-127Usado para incubar anticorpos e misturar outras soluções celulares para misturar
Axiovert 200M (Microscópio de Fluorescência)ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M microscópio de florescência invertida.
Colunas de dessalinização ZebaThermo-ScientificPI-87770Usado para purificar anticorpos recém-biotinilados após o uso do Kit de Biotinilação. Instruções fornecidas em: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Kit de Biotinilação de Baixo PesoTermocientíficoUsado para biotinilar anticorpos para permitir que eles se integrem com a superfície de captura
Leitor de PlacasBioTekSynergy HTXUsado para medir quantitativamente a intensidade fluorescente nos experimentos de titulação.
Leitor Multimodo

Referências

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