Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

Resumo

Este protocolo descreve a funcionalização de superfície personalizável do sistema de destiobiotina, estreptavidina e APTES para isolar tipos específicos de células de interesse. Além disso, este manuscrito cobre as aplicações, otimização e verificação desse processo.

Resumo

Um dos fatores limitantes para a adoção e avanço da medicina personalizada é a incapacidade de desenvolver ferramentas de diagnóstico para sondar nuances individuais na expressão de paciente para paciente. As metodologias atuais que tentam separar as células para preencher esse nicho resultam na interrupção da expressão fisiológica, tornando a técnica de separação inútil como ferramenta diagnóstica. Neste protocolo, descrevemos a funcionalização e otimização de uma superfície para a captura e liberação celular. Esta superfície funcionalizada integra anticorpos biotinilados com uma superfície de vidro funcionalizada com um aminosilano (APTES), destiobietina e estreptavidina. A liberação celular é facilitada pela introdução de biotina, permitindo a coleta e purificação das células capturadas pela superfície. Essa liberação é feita por meio do direcionamento da porção secundária destiobiotina, o que resulta em um paradigma de liberação muito mais suave. Essa redução nos reagentes agressivos e nas forças de cisalhamento reduz as mudanças na expressão celular. A superfície funcionalizada captura até 80% das células em uma mistura de células únicas e demonstrou 50% de captura em uma mistura de células duplas. Aplicações desta tecnologia em xenoenxertos e estudos de separação de câncer são investigadas. Técnicas de quantificação para verificação de superfície, como leitor de placas e análises ImageJ, também são descritas.

Introdução

De bancada abordagens de separação de células atuais (por exemplo, de células activadas por fluorescência ^1, captura a laser micro-dissecção ^2, talão de separação imuno-magnética ¹⁾ pode levar várias horas de preparação e triagem. Estes grandes escalas de tempo podem afetar os níveis de resposta e expressão fisiológicos, resultando em análises que não são representativas da resposta fisiológica ^3. São necessários sistemas que podem rapidamente e eficientemente isolar tipos de células específicas, sem perturbar os níveis de receptor de superfície celular a fim de melhorar o isolamento de células e de enriquecimento ....

Protocolo

1. Limpar a superfície de vidro e preparação de reagentes

1. Colocar uma superfície de vidro numa máquina de plasma de oxigénio durante 5 min a 50% de potência para o limpar.
2. Prepare reconstituída (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) solução de 2,5 ml de 2%, por adição de 50 ul de APTES e 2,45 ml de etanol num tubo cónico.

2. APTES e DSB funcionalização

1. Adicionar solução APTES para as superfícies. Pipete 150 pi por poço para 8 placas de poços. Pipetar 100 ul por poço de placas de 24 poços. Pipetar 1,1 ml para pratos de vidro de 60 x 15 mm. Cobrir as superfícies para evitar a evaporação e distribuição ....

Resultados

Usando este protocolo que mostram captação celular (Figura 3A) e a libertação de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, bem como controlos de células vivas (Figura 4). Foram quantificados a captura celular como 60% e 80% foram liberados (Figura 3C). Quando estendido esta abordagem a uma mistura de RAW 264.7 de macrófagos e células MCF7GFP, 50% de macrófagos RAW foram capturados (Fig. 3D) e 80% de macróf.......

Discussão

Melhorias nas técnicas de isolamento de células promove estudos científicos em relações estrutura-função em neurociência ^18, caule de programação celular em biologia regenerativa, e sinalização angiogênico em biologia vascular ^19. De facto, a cultura de células primária ²⁰ (por exemplo, células HUVEC) em biologia vascular é feito principalmente por meio do uso de técnicas de isolamento de células. Isolamento celular também foi usada recentemente para o fluxo quantitativo (qFlow).......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(3-Aminopropil) trietoxissilano (APTES)	Acros Organics	919-30-2	Usado para fazer solução APTES a 2%
Plasma Cleaner Pico	Diener	Modelo 1	Limpa superfícies e permite a ligação de PDMS ao vidro
d-Desthiobiotin (DSB)	Sigma	D20655	Usado como mecanismo de liberação na superfície de captura celular.
dimetilsulfóxido (DMSO)	British Drug Houses (BDH)	BDH1115-1LP	Dissolve o DSB em solução
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)	Thermo-Scientific	5g: 22980 25g: 22981	Ativa ácidos carboxílicos e permite a ligação de proteínas à superfície do vidro.
lâmina de cultura de 8 poços não revestida	BD Falcon	Caixa de 24: 354118 Caixa de 96: 354108	Usado em experimentos celulares envolvendo microscópio de fluorescência Zeiss, como experimentos iniciais de quantificação de captura e liberação
Placas de 24 poços com fundo de vidro	MatTek	P24G-0-13-F	Usado em experimentos celulares envolvendo o leitor de placas, como experimentos de anticorpos e titulação celular
Mercaptoetanol	Science Lab	60-24-2	Usado para extinguir a reação entre EDC e DSB
Hidrato de ácido 4-morfolinoetanossulfônico (MES Hydrate 99%)	Fisher Scientific	AC172590250	Usado para fazer 0,1 M MES Buffer para uso em reação EDC
Precision Oven	Thermo Scientific	11-475-153	Usado na cura da camada PDMS e APTES.
Titramax 1000 Shaker	Heidolph	13-889-420	Usado para garantir a distribuição uniforme de APTES em superfícies.
1x Estreptavidina 5 mg [e7105-5mg]	Proteo Chem	9013-20-1	Proteína de ligação à biotina. Pode causar irritação.
Prato de vidro de 5 cm	Fisher Scientific	08748A	Usado em estudos HUVEC, bem como em futuros estudos de perfil.
Placa de Petri de 14 cm com Tampa	Sigma-Aldrich	Z717231	Utilizada para guardar amostras que estão sendo funcionalizadas e transportá-las.
Células MCF7-GFP	Cell Biolabs	AKR211	Armazenado em nitrogênio líquido
RAW264.7 macrófagos de camundongo	ATCC	TIB-71	Presenteado a nós pelo laboratório Smith da Universidade de Illinois. Armazenado em nitrogênio líquido.
TrypLE	Life Technologies	12605036	Armazenado em 100 ml à temperatura ambiente
Dulbecco' s modificado Eagle medium	Cell Media Facility na Escola de Ciências Químicas da UIUC	50003PC	Fornecedor: Corning
Aminoácidos não essenciais	Cell Media Facility na School of Chemical Sciences da UIUC	25-025-CI	Já adicionado ao DMEM pela instalação. Fornecedor: Corning.
Raspador de células	Fisher Scientific	12-565-58	Pequeno 23 cm 50 pack
Solução de Dissociação Celular	Corning	MT-25-056CI	Usado para levantar células não enzimaticamente para uso em experimentos celulares
Hemacytometer	Hausser	02-671-54	Usado para contar células para quantificação de soluções celulares e efetividade de captura e liberação.
Biotina	Amresco	58-85-5	Usado para liberar células da superfície.
HBSS	Criado a partir da Receita	N/A	Usado para manter as células vivas em suspensão, bem como lavar superfícies de ligação não específica. Adaptado de Cold Spring Harbor Protocols: In 500  ml, use 4  g NaCl, 0,2  g KCl, 0,0402  g Na2PO4• 7H2O, 0,03  g KH2PO4 e 0,5  g de glicose. Adicione água DI para chegar a  500 ml, filtre e leve à geladeira.
Anticorpo HLA-ABC	BioLegend	311402	Anticorpo usado para capturar células MCF7gfp
Anticorpo hIgG	BioLegend	HP6017	Anticorpo usado para capturar células MCF7gfp
Células MCF7 GFP	Cell Biolabs	AKR-211	Linha de câncer de mama luminal que foi transfectada com proteína fluorescente verde.
Cônicas Sortidas	Thermo-Scientific	15mL: 12-565-268	50/15 ml cônicas de plástico para armazenar soluções e alíquotas.
Rotadores de mini-tubo (misturador de ponta a ponta)	Fisher Scientific	05-450-127	Usado para incubar anticorpos e misturar outras soluções celulares para misturar
Axiovert 200M (Microscópio de Fluorescência)	Zeiss	N/A	Zeiss Axiovert 200 M microscópio de florescência invertida.
Colunas de dessalinização Zeba	Thermo-Scientific	PI-87770	Usado para purificar anticorpos recém-biotinilados após o uso do Kit de Biotinilação. Instruções fornecidas em: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Kit de Biotinilação de Baixo Peso		Termocientífico	Usado para biotinilar anticorpos para permitir que eles se integrem com a superfície de captura
Leitor de Placas	BioTek	Synergy HTX	Usado para medir quantitativamente a intensidade fluorescente nos experimentos de titulação.