Artigo de método

De alto rendimento Gene Tagging no

DOI:

10.3791/54342

⸱

12 de agosto de 2016

 ,  , 
1Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.

Resumo

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Melhorias na espectrometria de massa, sequenciamento e bioinformática geraram grandes conjuntos de dados de genes potencialmente interessantes. A marcação dessas proteínas pode fornecer informações sobre sua função, determinando sua localização dentro da célula e permitindo a identificação do parceiro de interação. Recentemente, publicamos um método rápido e escalável para gerar linhagens celulares de Trypanosoma brucei que expressam uma proteína marcada do locus endógeno. O método foi baseado em um plasmídeo que geramos que, quando acoplado a PCR de primer longo, pode ser usado para modificar um gene para codificar uma proteína marcada em qualquer terminal. Isso permite a marcação de dezenas de proteínas tripanossomas em paralelo, facilitando a validação em larga escala de genes candidatos de interesse. Este sistema pode ser usado para marcar proteínas para localização (usando uma proteína fluorescente, etiqueta de epítopo ou etiqueta de microscopia eletrônica) ou bioquímica (usando etiquetas para purificação, como a etiqueta TAP (purificação de afinidade em tandem)). Aqui, descrevemos um protocolo para realizar a PCR de primer longo e a eletroporação em placas de 96 poços, com a recuperação e seleção de tripanossomas transgênicos ocorrendo em placas de 24 poços. Com esse fluxo de trabalho, centenas de proteínas podem ser marcadas em paralelo; Esta é uma melhoria de ordem de magnitude em relação ao nosso protocolo anterior e a marcação em escala de genoma agora é possível.

Introdução

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Trypanosoma brucei é um parasita protozoário que causa trypanosomasis Africano humana e nagana em bovinos. T. brucei é um organismo ideal para a análise da função da proteína, devido à combinação de um genoma de alta qualidade, numerosos conjuntos de dados e proteómica transcriptômica e ferramentas moleculares bem desenvolvidos 1-3. Avanços na proteômica e sequenciamento resultaram em grandes conjuntos de dados que destacam potencialmente genes interessantes 4-6; no entanto, muitos genes têm o mínimo de informação que lhes estão associados nas bases de dados existentes. Existe portanto uma necessidade de um método de alto rendimento para ajudar a caracterização funcional de proteínas.

A expressão de uma proteína com a etiqueta pode dar uma multiplicidade de perspectivas sobre a função de uma proteína. Por exemplo, uma proteína etiquetada com um epitopo ou a proteína fluorescente pode estar localizada por microscopia de fluorescência, que dá informações sobre o onde ProtEin pode ser exercer o seu efeito biológico. Alternativamente, uma proteína marcado com um TAP 7, 8 ou HaloTag Sua marca pode ser purificado para ensaios bioquímicos e identificação dos seus parceiros de interação.

Recentemente, desenvolveu uma metodologia de marcação robusta para T. brucei 9. Este utilizado longo de iniciadores de PCR para gerar o ADN para transfecção e deixada a marcação de dezenas de proteínas em paralelo - uma grande melhoria com os protocolos existentes. Temos agora melhorou a escalabilidade deste protocolo em formas pró-cíclicos por uma ordem de magnitude. Aqui, apresentamos o nosso método em que realizar a PCR e transfecção em placas de 96 poços, com a recuperação e seleção ocorrendo em placas de 24 poços. Enquanto centenas de proteínas podem agora ser marcado em paralelo este método fornece um método rentável e viável para marcar o genoma inteiro tripanossoma.

Protocolo

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1. 96 poços longo iniciador de PCR

  1. Pré-congelação mais frio de 96 poços de PCR em -80 ° C congelador.
  2. Num tubo de 10 ml, preparar a Mistura de PCR A: 2100 DDH ul H2O, 105 ul de PCR grau DMSO, 105 ul de dNTPs 10 mM, 105 ul de molde pPOT (25 ng / ul) 9, para um volume total de 2415 mL por placa .
  3. Aliquota 23 uL em cada poço de uma placa de 96 poços de PCR.
  4. Adicionar 2 ul de 100 uM reunidas iniciadores para cada uma carregada poço utilizando uma pipeta multicanal com P20 de 12 canais. Selar com filme, colocar a placa no sistema de arrefecimento por PCR pré-gelada e deixa-se congelar durante pelo menos 20 min a -80 ° C.
  5. Num tubo de 10 ml, preparar a Mistura Principal B: 2048 ul de ddH2O, 525 ul de tampão 10X, 52,5 ul de polimerase para um volume total de 2626 mL por placa.
  6. Remova a placa e refrigerador de PCR da -80 ° C congelador.
  7. Com a placa ainda no sistema de arrefecimento de PCR, adicionar 25 ul de Mistura B em cima do congeloun mestre Mistura A para um volume total de reacção de 50 ul. Este é um tempo crítico, e deve ser concluída antes Mix A pode descongelar. Selar placa com película.
  8. Definir termociclador como se segue: 94 ° C durante 10 min, depois 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 65 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 2 min, seguido por um período de extensão final de 72 ° C durante 7 min .
  9. Coloque a placa de PCR após o bloco atingiu 94 ° C.

2. Validação de 96 poços longo Primer PCR

  1. Transmitir um grande 1% (w / v) em gel de agarose em Tris-Acetato EDTA (TAE) com tampão de corrida pentes 4 x 28 poços para dar um gel com 4 filas de poços. Alinhar dentes alternados do pente com a ponta de uma pipeta de canais múltiplos 12 de canal. Cuidadosamente submergir o gel em TAE de tampão de corrida após as pistas são carregados.
  2. Carga escada de DNA 1 kb para o 1º e 28 de poço de cada linha.
  3. Usando uma pipeta multicanal P20 12 canais, transferir 2 mL de dir produto de PCRrectamente para cada faixa do gel (Figura 1A). Fazer isso rapidamente para reduzir a possibilidade de contaminar os produtos de amplificação.
    1. Coloque os produtos de PCR de linha A da placa de PCR para as pistas numeradas ímpares da 1ª fila do gel (A1 - pista 3, A2 - pista 5 ...... A11 - pista 23, A12 - pista 25) e carregar os produtos de PCR da linha B da placa de PCR para as pistas pares do st linha 1 do gel (B1 - faixa 4, A2 - pista 6 ...... B11 - pista 24, B12 - pista 26).
    2. Carregar os produtos de PCR a partir de linha C e D da placa de PCR, utilizando o mesmo padrão tal como descrito acima, com a linha C para a linha e pistas numeradas D estranho nas pistas de números pares. Continue este padrão de carga até que cada uma das cavidades da placa de PCR é carregado no gel. tampão de carga de ADN não é necessária para carregar este gel.
  4. Colocar o gel para o tanque de corrida e encher o depósito com tampão de corrida TAE até que o gel está submerso. Executar a 100 V durante 30 min evisualizar utilizando um transiluminador de UV. Ver Figura 1B para um gel de exemplo.
    Nota: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante várias semanas antes da transfecção

3. A transfecção de 96 poços

  1. Use o T. linha brucei pró-cíclica de células forma SMOXP9 10 para este procedimento e crescer em SDM-79 meios contendo 10% FCS 10.
  2. Use 1 x 10 7 células por transfecção (total de 1,1 x 10 9 células) ao etiquetar no terminal N da proteína e 2 x 10 7 células por transfecção (total de 2,2 x 10 9 células) ao etiquetar no terminal C de a proteína. Manter as células em mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 células / ml) durante vários dias antes da transfecção e colheita das células para transfecção a uma densidade de 5-8 x 10 6 culas / ml.
  3. Permitir que os produtos de PCR para a transfecção congelados a descongelar à temperatura ambiente.
  4. Contagem de células utilizando um hemeocytometer ou contador de células automático.
  5. Pellet número necessário de células em vários tubos de 50 ml a 800 xg durante 10 min.
  6. Após centrifugação o sobrenadante de descarte e ressuspender as células em 10 ml cytomix modificado (EGTA 0,8 mM, KCl 24 mM, CaCl 0,15 mM de 2, 10 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,6, 25 mM de HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM de MgCl2, 0,5% (w / v) de glucose, 100 ug / ml de BSA, 1 mM de hipoxantina, sacarose 144 mM) por tubo. Transferir todas as soluções de células a um único tubo e girar novamente a 800 xg durante 10 min.
  7. Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 23 ml de cytomix modificado para uma concentração final de 5 x 10 7 células / ml.
  8. Enquanto as células estão girando, adicionar 1 ml de SDM-79 media a cada poço de placas de cultura de tecidos de 4 x 24 poços. Rotular as placas AD e desenhar um anel em torno de bem A1 em cada placa no marcador permanente para ajudar a orientação placa.
  9. Ligue o manipulador de placa para a electroporator. No electroporaTor unidade definir a tensão de 1.500 V, a duração do pulso de 100 ms e o número de impulsos de 12 e o intervalo de pulso de 500 ms. No processador de chapa, defina a contagem de impulsos para 1. Isto assegura que electroporador que vai aplicar um único impulso para cada uma das 12 colunas da placa electroporação.
  10. Usando uma pipeta multicanal canal P200 12, transferir as reacções de PCR a partir da placa de PCR para as placas de 96 poços de electroporação descartável, lacuna de 4 mm.
  11. Quando as células foram fiadas e são ressuspensos a uma concentração final de 5 x 10 7 células / ml (Passo 3.7), transferidos para um reservatório de reagente. Pipete 200 pi da solução de células em cada poço da placa de electroporação utilizando um canal de pipeta multicanal P200 12, misturar com o produto de PCR por pipetagem.
  12. Utilizando tecido remover quaisquer gotas a partir do topo da placa para evitar curto-circuitos.
  13. Aplicar a película de vedação proporcionada na embalagem placa para o topo da placa de electroporação, positioning-lo de modo a deixar os furos para os eléctrodos descobertos na parte superior e inferior de cada coluna. Evite cobrir os pontos levantados usados ​​para guiar o filme.
  14. Coloque a placa de eletroporação para o manipulador de placa e feche a tampa. Pressione 'Pulso' na unidade electroporator.
  15. Após a electroporação, transferir rapidamente as células a partir da placa de electroporação de 96 poços para as placas de cultura de tecidos de 4 x 24 poços. Para transferir as células, usar um canal de pipeta multicanal P200 12 com cada outra ponta ausente de tal modo que as restantes 6 pontas alinham com as 6 linhas sobre uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Transferir as células electroporadas em electroporações as placas de 96 poços em teste padrão pré-definido para as placas de cultura de tecidos de 24 poços (Figura 2A).
  16. Prepare as pontas de pipeta P200 - para cada transfecção de 96 poços preparar 2 caixas de 96 pontas com cada outra coluna removido.
    1. poços de transferência de A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 na placa eletroporação de 96 poços paraplaca seguido uma das placas de cultura de 24 poços de tecido, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 na fileira B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 na linha C e D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 em fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 cavidades para a placa de 24 poços, os poços da placa de 96 poços são então lavadas com meio dos poços correspondentes na 24- bem placa e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços.
    2. poços de transferência E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 na placa de electroporação de 96 poços a 24-well plate B linha A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 para a linha B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 na linha C e H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 na fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, os poços no 96 -bem placa são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços.
    3. Transferência de poços A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 na placa electroporação de 96 poços a 24-well plate C fila A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 na fileira B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 na linha C e D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 na fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços a partir do 96 -bem placa para a placa de 24 poços, os poços da placa de 96 poços são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços.
    4. poços de transferência E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 na placa de electroporação de 96 poços a 24-well plate D linha A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 para a linha B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 em linha C e H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 em fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 cavidades para a placa de 24 poços, os poços no 96 -bem placa são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços.
  17. Usando um microscópio de contraste de fase invertida, examine um bem de cada coluna para verificar as células. Haverá uma mistura de células vivas e mortas com umquantidade substancial de restos de células. As células vivas pode ser distinguido a partir de células mortas porque eles serão brilhante sob microscopia de contraste de fase e serão em movimento.
  18. Colocar as placas de 24 poços numa caixa limpa, de plástico com uma tampa que forma uma vedação estanque. Coloque a caixa em um 28 ° C incubadora.
  19. Entre 6-8 h mais tarde, adicionar 1 ml de SDM-79 com FCS a 10% contendo antibiótico selectivo 2x a cada poço. Na nossa experiência, linhas celulares onde os genes são codificados na extremidade N-terminal são resistentes a concentrações mais elevadas de droga selectiva. Portanto, utilizando blasticidina como um exemplo, a marcação na extremidade N-terminal requer uma concentração final de 20 ug / ml de blasticidina e marcação no terminal C exige uma concentração final de 10 ug / ml de blasticidina.
    Nota: linhas de células transgênicas se tornarão visíveis 9-10 dias após a transfecção.
  20. Passagem, pelo menos, duas vezes em droga fresca e meios de comunicação antes da análise. A Figura 2B mostra os resultados de uma transfe típico de 96 poçoscção para colocação de etiquetas 96 proteínas diferentes na terminação N. Avaliar cada poço por microscopia de contraste de fase para determinar se ele contém as células saudáveis, resistentes a drogas. Um bem saudável contém predominantemente (<95%), as células altamente ativos que são brilhantes em microscopia de contraste de fase. Análise subsequente por microscopia de epifluorescência ou western blot é necessário para determinar se a proteína foi marcado com sucesso.

Resultados

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Neste transfecção representativa, os iniciadores foram desenhados utilizando o script TagIt perl 9 e sintetizado comercialmente. A 96 poços de PCR foi realizada como descrito e validado (Figura 1A); Neste exemplo, 95/96 PCRs foram bem sucedidos (Figura 1B). Em nossa experiência, repetindo reacções falhadas quer com os iniciadores originais ou iniciadores sintetizados-re não resulta em um PCR bem sucedido.

Os fragmentos amplificados foram transferidos para placas de 96 poços de electroporação para electroporação (Figura 2A) e, em seguida, transferidos para placas de cultura de 24 poços para a recuperação e selecção. Depois de tempo suficiente para permitir a selecção de ocorrer, os poços foram marcados para a sobrevivência antes de posterior análise. Neste exemplo, 88/96 cavidades (92%) foram positivos após 15 dias de selecção.

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Figura 1: Validação da longa iniciador de PCR (A) padrão para a transferência de produtos de PCR a partir de placa de 96 poços de PCR para o gel de agarose para a validação de PCR.. (B) de 96 poços de gel representativa validação de PCR para etiquetar 95 genes na extremidade N-terminal, e um fragmento amplificado contendo não "homologia segmentar 5 para actuar como um controlo negativo na transfecção. As amostras são carregados em um 1% (w / v) em gel de agarose e resolvidos a 100 V durante 30 minutos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: 96 poços electroporação e selecção (a) o padrão para a transferência de células electroporadas a partir de 96 poços plat electroporação.E para placas de 24 poços de cultura de tecidos. (B) um esquema que mostra uma pontuação ao vivo / morto típico após 15 dias de selecção em placas de 24 poços. Verde representa uma transfecção bem sucedida, cinzento representa um poço com apenas células mortas. Neste exemplo, 88/96 (92%) de poços continham parasitas transfectadas com sucesso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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melhorias dramáticas na sensibilidade da proteômica e métodos transcriptômica nos últimos 5-10 anos forneceu dados valiosos em milhares de genes e seus produtos. No entanto, as ferramentas para lidar com a função destas proteínas não mantiveram o ritmo.

Marcação de uma proteína facilita numerosos experimentos para determinar a sua função. Por exemplo, uma proteína podem ser fundidos com uma proteína fluorescente em uma variedade de cores diferentes para facilitar estudos de localização e de co-localização. Etiquetas desenvolvido para microscopia eletrônica, tais como APEX2 ou miniSOG 11,12, permitir a localização ultra-estrutural da proteína marcada. Marcações de bioquímica, tais como a etiqueta TAP, e ProtC-TEV-Prota (PTP) etiquetar 7,13 permitir a purificação de complexos associados com a proteína para a identificação de parceiros de ligação ou em ensaios bioquímicos in vitro.

Os passos específicos que são críticos para o sucesso da PROTOCol são: a incorporação de DMSO para a PCR master mix 1, congelação da PCR master mix 1 antes da adição da Mistura Principal 2, a utilização da polimerase comercial na Master Mix 2 e a modificação do tampão cytomix electroporação. Em nossa experiência, é necessário utilizar o dobro do número de células para C transfections terminal de marcação como for N transfections terminal de marcação, a fim de alcançar uma proporção semelhante de poços positivos. Portanto, todos os passos devem ser realizados tal como descrito.

Esta técnica só é susceptível de ser bem sucedida quando a transfecção o inseto pró-cíclica forma tripanossoma. Formas corrente sanguínea tem uma menor eficiência de transfecção 14, além disso eles são propensos a morrer durante a selecção devido a toxicidade dependente de densidade que não está relacionada com a droga seletiva. Portanto, o nosso protocolo anterior representa a melhor tecnologia atual para marcar de forma sanguínea tripanossomas 9. É também provável que o transeficiência de infecção variará dependendo do isolado tripanossoma específica. Este protocolo foi otimizado usando 927 SMOX as formas procíclica - outras estirpes pode exigir otimização adicional. As medidas que podem aumentar a probabilidade de sucesso incluem: o aumento da quantidade do fragmento amplificado por PCR, o aumento do número de células incluídas na transfecção.

Apresenta-se um método em que centenas de proteínas pode ser marcado em paralelo. Isso irá facilitar estudos de larga escala sobre a localização e interação, complementando conjuntos de dados grandes existentes e fornecendo informações valiosas para a comunidade. modelos de primers estão disponíveis mediante solicitação e uma lista de modelos de plasmídeos está disponível em: http://www.sdeanresearch.com/

Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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SD foi apoiado por uma Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. Este trabalho foi financiado por doações do Wellcome Trust [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] ao professor Keith Gull. Gostaríamos de agradecer ao professor Keith Gull por conversas e insights úteis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
OligonucleotídeoLife technologiesnadessalinização apenas (não use purificação adicional)
DMSORocheIncluído com o pacote Expand HiFiDeve ser grau PCR
dNTPrespeitável
Roche11759078001
BTX ECM830Harvard ApparatusElectroporator
Manipulador de placas HT-200Harvard ApparatusHT-200Manipula as eletroplacas de 96 poços
MOS 96 ELECTROPLATE 4 mmHarvard Apparatus45-0452Galvanização para eletroporação de 96 poços
Cloridrato de Blasticidina SMelford3513-03-9
Higromicina b GoldInvivogenant-hg-1
FleomicinaMelfordP0187
Frasco TC de 225 cm, pescoço inclinado, tampa fenólicaAppletonwoodsBC006
Placas de cultura de 24 poçosAppletonwoodsBC017
Eppendorf® Resfriador PCR, sistema de armazenamento a frio sem gelo para placas de 96 poços e tubos de PCRSigma AldrichZ606634-1EA
Multiplicação de 96 poços® Placa PCR com saia lateralSarstedt72.1979.203
qualquer polimerase Expand HiFi

Referências

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