Comparação de tabaco métodos de remoção de células hospedeiras de proteínas por descascamento plantas intactas ou por tratamento térmico de extratos

Resumo

Três métodos de precipitação de calor são apresentados de forma eficaz que remova mais do que 90% de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de tabaco extrai antes de qualquer outro passo de purificação. A planta HCPs agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C.

Resumo

As plantas que não só fornecem alimentos, rações e matérias-primas para os seres humanos, mas também foram desenvolvidos como um sistema económico para a produção de proteínas biofarmacêuticos, tais como anticorpos, vacinas candidatas e enzimas. Estes devem ser purificada a partir da biomassa da planta, mas etapas de cromatografia são prejudicados pelas concentrações elevadas de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em extractos de plantas. No entanto, a maioria dos profissionais de saúde agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C facilitam a purificação posterior da proteína alvo. Aqui, são apresentados três métodos para conseguir a precipitação de calor de profissionais de saúde do tabaco em folhas, quer intactos ou extractos. O branqueamento de folhas intactas podem ser facilmente incorporados nos processos existentes, mas pode ter um impacto negativo sobre as etapas de filtração subsequentes. O oposto é verdadeiro para a precipitação de calor de extratos de folhas em um vaso agitado, o que pode melhorar o desempenho das operações a jusante embora com grandes mudanças no design de equipamento de processo, tais comogeometria homogeneizador. Por fim, uma configuração de permutador de calor está bem caracterizada em termos de condições de transferência de calor e fácil à escala, mas a limpeza pode ser difícil e pode haver um impacto negativo sobre a capacidade do filtro. A abordagem de design-de-experiências pode ser utilizada para identificar os parâmetros de processo mais importantes que afectam a remoção de HCP e recuperação do produto. Isto facilita a aplicação de cada método em outras plataformas de expressão e na identificação de o método mais adequado para uma dada estratégia de purificação.

Introdução

Modernos sistemas de saúde dependem cada vez mais proteínas biofarmacêuticas ^1. Produzindo estas proteínas em plantas é vantajoso devido à carga patógeno baixo e escalabilidade maior em comparação com os sistemas de expressão convencionais ^2-4. No entanto, o processamento a jusante (DSP) de produtos farmacêuticos derivados de plantas pode ser um desafio, porque os procedimentos de extração disruptivas resultar em uma carga de partículas de alta, com turbidez superior a 5.000 unidades nefelométrico de turbidez (NTUs) e proteína da célula hospedeira (HCP) concentrações muitas vezes superior a 95 % [m / m] ^5,6.

Protocolo

1. Cultive as plantas de tabaco

1. Lavar cada bloco de lã mineral com 1 a 2 L de água desionizada e, subsequentemente, com 1 L de 0,1% [W / v] solução de fertilizante. Coloque uma semente de tabaco em cada bloco de lã mineral e suavemente nivelado com 0,25 L de solução de fertilizante sem lavar a descendência ^16.
2. Cultivar as plantas de tabaco para 7 semanas em casa de vegetação com 70% de umidade relativa, fotoperíodo de 16 horas (180 pmol sec ^{- 1} m ^{- 2;} λ = 400 - 700 nm) e um regime de temperatura 25/22 ° C claro / escuro.
3. Colher todas as folhas excepto das quatro folhas cotiledonares....

Resultados

Precipitação de calor de proteínas da célula hospedeira de tabaco por branqueamento
O processo de branqueamento descrito no ponto 2. foi utilizado com sucesso para precipitar os profissionais de saúde de folhas de tabaco com 70 ° C, reduzindo o TSP por 96 ± 1% (n = 3), enquanto que a recuperação até 51% da proteína alvo Vax8, aumentando assim a sua pureza a partir de 0,1% a 1,2% antes da separação cromatográf ica ^16. Também era possível recuperar 83 ± 1% (n = 3.......

Discussão

Os três métodos de precipitação acima descritos calor pode remover eficazmente os profissionais de saúde do tabaco antes de qualquer passo de purificação cromatográfica ^16,17. Eles complementam outras estratégias que visam aumentar a pureza inicial do produto, por exemplo, gutação ^{29, 30} ou rhizosecretion centrífuga extracção ^31,32, todos os quais são limitados para as proteínas secretadas. No entanto, os métodos baseados em calor só pode ser utilizado de uma forma si.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Turbidímetro Portátil 2100P	Hach	4650000
Kit de Acoplamento de Amina	Turbidimeter GE Healthcare	BR100050	Kit de acoplamento de cavacos SPR
Cesto de autoclave	Nalgene	6917-0230	Cesto para branqueamento de folhas
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	Dispositivo SPR
Bio Cell Analyser BCA 003 R& D com 3D ORM	Sequip	n.a.Analisador	tamanho de partícula
Liquidificador	Waring	800EG	Liquidificador
BP-410	Furh	2632410001	Filtro de
mangas Centrífuga 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrífuga
Tubo de centrífuga 15 ml	Tubo de 2017106	Labomédico
centrífuga 50 ml autoportante	Tubo	de	reação
chip CM5 GE	Healthcare	BR100012	Chip para medições SPR
Cubeta 10 x 10 x 45	Sarsted	67.754	Cubeta para Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE	software
Fosfato dissódico	Carl Roth GmbH	4984.3	Componente de mídia
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizante
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.n.a.Para		cultivo de plantas
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm	Grodan	102446	Rockwool block
Trocador de calor de loop Twentey (4,8 m de comprimento)	n.a. (design personalizado)	n.a.Heat	permutador
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente de mídia
K200P 60D	Pall	5302303	Camada de filtro de profundidade
KS50P 60D	Pall	B12486	Camada de filtro de profundidade
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Termostato de banho-maria
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubulação
mAb 5.2	American Type Culture Collection	HB-9148	Vax8 anticorpo específico
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Bomba peristáltica
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Pano de filtro
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	medidor de pH / medidor de condutividade
Osram branco frio 36 W	Osram	4930440	Fonte de luz
Phytotron	Ilka Zell	n.a.Para	cultivo de plantas
Dissulfito de sódio	Carl Roth GmbH	8554.1	Componente do meio Cloreto
de sódio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente do meio
Recipiente de aço inoxidável; 0,7 kg 2,0 L; altura 180 mm; diâmetro 120 mm	n.a. (design personalizado)	n.a.Recipiente	para precipitação de calor
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Leitor de placas espectrométricas e de fluorescência
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Caixa do filtro
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS Medição da distribuição do tamanho das partículas
Zetasizer Software v7.11	Malvern	n.a.Software	para operar o dispositivo Zetasizer Nano ZS

de Tubo de 1110504 Labomedic