Artigo de método

Comparação de tabaco métodos de remoção de células hospedeiras de proteínas por descascamento plantas intactas ou por tratamento térmico de extratos

8.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/54343

⸱

8 de agosto de 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Neste artigo

Resumo

Três métodos de precipitação de calor são apresentados de forma eficaz que remova mais do que 90% de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de tabaco extrai antes de qualquer outro passo de purificação. A planta HCPs agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C.

Resumo

As plantas que não só fornecem alimentos, rações e matérias-primas para os seres humanos, mas também foram desenvolvidos como um sistema económico para a produção de proteínas biofarmacêuticos, tais como anticorpos, vacinas candidatas e enzimas. Estes devem ser purificada a partir da biomassa da planta, mas etapas de cromatografia são prejudicados pelas concentrações elevadas de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em extractos de plantas. No entanto, a maioria dos profissionais de saúde agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C facilitam a purificação posterior da proteína alvo. Aqui, são apresentados três métodos para conseguir a precipitação de calor de profissionais de saúde do tabaco em folhas, quer intactos ou extractos. O branqueamento de folhas intactas podem ser facilmente incorporados nos processos existentes, mas pode ter um impacto negativo sobre as etapas de filtração subsequentes. O oposto é verdadeiro para a precipitação de calor de extratos de folhas em um vaso agitado, o que pode melhorar o desempenho das operações a jusante embora com grandes mudanças no design de equipamento de processo, tais comogeometria homogeneizador. Por fim, uma configuração de permutador de calor está bem caracterizada em termos de condições de transferência de calor e fácil à escala, mas a limpeza pode ser difícil e pode haver um impacto negativo sobre a capacidade do filtro. A abordagem de design-de-experiências pode ser utilizada para identificar os parâmetros de processo mais importantes que afectam a remoção de HCP e recuperação do produto. Isto facilita a aplicação de cada método em outras plataformas de expressão e na identificação de o método mais adequado para uma dada estratégia de purificação.

Introdução

Modernos sistemas de saúde dependem cada vez mais proteínas biofarmacêuticas 1. Produzindo estas proteínas em plantas é vantajoso devido à carga patógeno baixo e escalabilidade maior em comparação com os sistemas de expressão convencionais 2-4. No entanto, o processamento a jusante (DSP) de produtos farmacêuticos derivados de plantas pode ser um desafio, porque os procedimentos de extração disruptivas resultar em uma carga de partículas de alta, com turbidez superior a 5.000 unidades nefelométrico de turbidez (NTUs) e proteína da célula hospedeira (HCP) concentrações muitas vezes superior a 95 % [m / m] 5,6.

Processos de clarificação elaborados são necessários para remover as partículas dispersas 7-9, mas o equipamento de cromatografia é menos dispendioso para operar em modo de ligação e-eluem durante a recuperação inicial do produto, se houver um passo anterior para a remoção eficiente dos profissionais de saúde 10,11. Isto pode ser conseguido quer por precipitação da proteína alvo usando flocculformigas 12 ou baixo pH 13,14, bem como fazendo com que os profissionais de saúde para agregar. A agregação selectiva da ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase / oxigenase (RuBisCO), a HCP mais abundante nas plantas verdes, tais como o tabaco (Nicotiana tabacum), pode ser promovida através da adição de polietilenoglicol 15, mas isso é caro e incompatível com grande fabricação -scale. O tratamento térmico tem sido demonstrado para desnaturar e precipitar mais de 95% dos profissionais de saúde do tabaco, enquanto vacinas candidatas contra a malária proteína, tais como Vax8 permanecer estável na solução 16-18.

Três diferentes abordagens foram usadas para conseguir a precipitação induzida pelo calor de profissionais de saúde do tabaco: (i) de branqueamento, isto é, a imersão das folhas intactas no estado líquido quente, (ii) uma temperatura controlada agitada recipiente, e (iii) um permutador de calor ( A Figura 1) 16. Para as folhas intactas, o branqueamento conseguida a precipitação rápida e eficiente dos profissionais de saúde e também foi fácilampliar e compatível com processos de fabricação em grande escala existentes que incluem um passo inicial para lavar a biomassa vegetal 19. Em contraste, vasos de temperatura controlada já estão disponíveis em alguns processos e pode ser utilizado para o tratamento térmico de extractos de plantas 20, mas a sua escalabilidade e taxa de transferência de energia são limitados porque a razão de superfície para volume dos tanques é progressivamente reduzida e torna-se inadequada em escala processo. Um permutador de calor é uma alternativa tecnicamente bem definido para aquecida vasos agitados mas requer um fornecimento abundante de meios de aquecimento e arrefecimento, por exemplo, de vapor e de água fria, assim como uma taxa de fluxo volumétrica rigidamente controlado, que é adaptada à geometria do permutador de calor e propriedades de mídia, por exemplo., a capacidade de calor específico. Este artigo mostra como todos os três métodos podem ser usados ​​para a precipitação induzida pelo calor de tabaco, os profissionais de saúde e os profissionais de saúde da planta em geral. A criação e funcionamento de each método em um ambiente de laboratório pode ser usado para avaliar a sua aptidão para processos de grande escala. O grande desafio é identificar modelos de escala para baixo adequados e condições de funcionamento para cada operação que se parecem com os dispositivos e condições utilizadas durante a fabricação em escala processo. Os dados aqui apresentados referem-se a experiências conduzidas com plantas de tabaco transgénicas que expressam a vacina candidata malária Vax8 e proteína fluorescente DsRed 16, mas o método também tem sido aplicada com sucesso a N. benthamiana plantas que expressam transitoriamente outras proteínas biofarmacêuticas 21.

Um projeto-de-experimentos (DOE) aproximar 22 pode facilitar o desenvolvimento de processos, e floculantes 23 também pode ser benéfico, neste contexto, como descrito anteriormente 8. A principal diferença entre o branqueamento, reservatórios aquecidos e permutadores de calor é que o branqueamento é aplicado a folhas intactas no início do processo ao passo que o OTdela são aplicados aos extractos de plantas (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1:. Esquema de Fluxo do Processo Ilustrando a implementação de três métodos diferentes para Tobacco HCP Calor Precipitation O material vegetal é lavado e homogeneizadas antes de clarificação e purificação. O equipamento para a etapa de branqueamento (vermelho) podem ser facilmente adicionados à maquinaria existente. Em contraste, usando um recipiente com agitação (laranja) e, especialmente, um permutador de calor (azul) requer um ou vários dispositivos e tubos adicionais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Cultive as plantas de tabaco

  1. Lavar cada bloco de lã mineral com 1 a 2 L de água desionizada e, subsequentemente, com 1 L de 0,1% [W / v] solução de fertilizante. Coloque uma semente de tabaco em cada bloco de lã mineral e suavemente nivelado com 0,25 L de solução de fertilizante sem lavar a descendência 16.
  2. Cultivar as plantas de tabaco para 7 semanas em casa de vegetação com 70% de umidade relativa, fotoperíodo de 16 horas (180 pmol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) e um regime de temperatura 25/22 ° C claro / escuro.
  3. Colher todas as folhas excepto das quatro folhas cotiledonares, que estão localizados na base do caule da planta.

2. Opcional: Calor Precipitation pelo descascamento

NOTA: Executar as etapas descritas nos passos 2,1-2,12 para precipitar os profissionais de saúde do tabaco por branqueamento. Ir toda a seção 2, se os profissionais de saúde será precipitadoem um recipiente aquecido (seção 4) ou utilizando um permutador de calor (seção 5).

  1. Separe 50 g de material vegetal e realizar a extração sem branqueamento (seção 3). Tomar uma amostra deste extrato como um controlo interno durante a análise subsequente (secção 7).
  2. Configurar um banho de 8-L volume de trabalho de água, por exemplo, 50 x 40 x 40 cm, em um balde de espuma de poliestireno termicamente isolados ou similar. Montar o termostato ajustável no banho de água para controle de temperatura subsequente (passo 2.7).
  3. Transferir toda a montagem sobre uma placa de agitação magnética e colocar uma barra de agitação magnética no banho de água. Certifique-se de que o campo magnético é suficientemente forte para girar a barra de agitação.
  4. Cercar a barra de agitação com pelo menos quatro peças de suporte sobre o qual uma cesta de polipropileno (passo 2.6) serão colocados mais tarde, durante o processo de branqueamento. Certifique-se de que as peças de suporte são feitos de um material não magnético (por exemplo, liga de aço inoxidável contendo níquel) e que elessão mais elevada do que a barra de agitação (Figura 2).
  5. Adiciona-se 8 L de água desionizada ao banho de água.
    NOTA:. Usando um tampão, por exemplo, fosfato de sódio 50 mM (pH 7,5), pode aumentar consideravelmente a quantidade de proteína alvo se baixa o pH de precipitação é um problema.
  6. Coloque um centímetro cesto de polipropileno de 23 x 23 x 23 sobre as telhas de suporte e certificar-se de que o cesto não interfira com a rotação da barra de agitação, e que é totalmente submersa no líquido. Se necessário, adicione água / tampão adicional até que a cesta está totalmente submersa, em seguida, retire o cesto novamente.
    CUIDADO: Todos os passos subsequentes até 2,12 envolvem a manipulação de líquido quente. Usar equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas de isolamento térmico.
  7. Utilizar o termostato ajustável para trazer o banho de água a 70 ° C (ou a temperatura necessária para as experiências). Aguardar pelo menos 15 minutos após a temperatura desejada seja atingida para garantir todo o conjunto tenha atingido uma thermal equilíbrio.
  8. Preparar alíquotas de 150 g de folhas de tabaco colhidas. Colocar uma alíquota para o cesto de compressão, evitando danos irreversíveis e para as folhas, por exemplo, por rasgamento. Evitar o enchimento excessivo do carrinho com material vegetal ou uma embalagem densa do último.
  9. Cuidadosamente mas rapidamente submergir a cesta no líquido quente e colocá-lo sobre as telhas de apoio. Coloque um bloco de aço inoxidável na parte superior da cesta para impedir a flutuação.
  10. Incubar as folhas para 5 min no fluido branqueamento, ou selecione um tempo adequando o projeto experimental. Monitorar a temperatura do líquido durante todo o período de incubação.
  11. Remova cuidadosamente o cesto do fluido de branqueamento e deixe escorrer líquido residual a partir das folhas por 30 s. Em seguida, tomar as folhas da planta do cesto, transferi-los para o liquidificador e iniciar imediatamente a extração (seção 3).
    NOTA: As plantas podem ser mantidos por períodos de tempo prolongados após branqueamento e antes do início do the extracção, por exemplo, mais de 30 min em gelo ou congelado a -20 ° C durante várias semanas foi testado com sucesso. No entanto, a estabilidade do produto pode diminuir com o aumento do tempo de armazenamento e assim processamento imediato é recomendado.
  12. Repita os passos 2,8-2,11 com material de folha fresca até que toda a biomassa colhida é processada.

3. Extração de proteínas de folhas de tabaco

ATENÇÃO: Os próximos passos envolvem um liquidificador com lâminas rotativas. Não trabalhar no balde misturador, enquanto que está montado no motor misturador.

  1. Colocar 150 g (massa húmida) de colheita (passo 1.3) ou branqueados (passo 2.11) folhas no misturador e adicione 450 ml de tampão de extracção (fosfato de sódio 50 mM, cloreto de sódio 500 mM, bisulfito de sódio a 10 mM, pH 8,0).
    NOTA: A composição do tampão de extracção depende da proteína a ser extraída e pode, assim, requerer um ajuste, por exemplo, o uso de um outro tampão de pH ou componente tal como Tré.
  2. Homogeneizar as folhas para 3 x 30 pulsos segundos com 30 segundos intercalados breaks. Certifique-se que as folhas são homogeneizada e não entopem o balde liquidificador. Parar o liquidificador e retire as folhas para evitar o entupimento, se necessário, e depois continuar a homogeneização.
  3. Tomar uma amostra de 1 ml de cada extracto que é produzido para posterior análise (secção 7). Se o material vegetal é empalideceu, continuam a secção 6. Caso contrário, continue com a precipitação de calor num recipiente (seção 4) ou trocador de calor (seção 5), dependendo da abordagem experimental selecionado.

4. Opcional: Calor Precipitation em um recipiente agitado

NOTA: Realizar os passos descritos nas secções 4.2 a 4.11, a fim de precipitar os profissionais de saúde do tabaco num vaso agitado. Ir toda a secção 4, se os profissionais de saúde têm sido precipitada por branqueamento (seção 2), ou vai ser precipitado utilizando um permutador de calor (seção 5).

  1. Configurar dois 8-L de água volume de trabalhobanhos, por exemplo, 50 x 40 x 40 cm, em espuma de poliestireno isolada termicamente ou semelhante. No primeiro banho, montar o termostato regulável para controle de temperatura subsequente (passo 4.6). Na segunda, adicionam-se 5 L de água desionizada e 2 kg de gelo para arrefecimento subsequente (passo 4.9).
  2. Transferir o primeiro banho de água sobre uma placa de agitação magnética, e colocar o recipiente de aço inoxidável de 2 L para o banho de água de tal modo que o centro do recipiente está alinhado com o centro da placa de agitação.
  3. Colocar uma barra de agitação magnética no recipiente de aço inoxidável. Certifique-se de que o campo magnético é suficientemente forte para girar a barra de agitação.
  4. Encher o banho de água com água de s ionizada a 5 cm abaixo do bordo superior do recipiente de aço inoxidável. Em seguida, encher o navio com tampão de extração. Colocar uma tampa de espuma de poliestireno na embarcação.
    CUIDADO: Todos os passos subsequentes até 4,9 envolvem a manipulação de líquido quente. Usar equipamento de protecção individual adequado, incluindo ins termicamenteluvas povoadas.
  5. Insira um termómetro no recipiente de aço inoxidável através de um buraco adequando na tampa de espuma de poliestireno. Regule a temperatura do banho de água a 78 ° C e incubar todo o conjunto por 15 min para atingir o equilíbrio térmico. Certifique-se de que a temperatura no recipiente é de 70 ° C, a cerca de 8 ° C abaixo do ponto de o banho de água regulado.
  6. Se a temperatura no recipiente de aço inoxidável varia entre 70 ° C, ajustar a temperatura do banho de água em conformidade e deixar o sistema equilibrar durante mais 15 min. Repetir este passo até que a temperatura no recipiente é de 70 ° C ou como necessário para a experiência, e esvaziar o recipiente de aço inoxidável.
  7. Pour 300 ml de extracto (passo 3.2), para dentro do vaso de aço inoxidável, enquanto ele ainda está no banho de água e iniciar um temporizador. Agita-se o extracto a 150 rpm e incubar durante 5 min. Assegure-se que o extracto a uma temperatura de 70 ° C durante pelo menos 2 minutos, durante este período de incubação.
  8. Remova o banho de água quente a partir do agitador magnético, tirar o recipiente de aço inoxidável e colocá-lo no balde gelado. Coloque esta última sobre o agitador magnético e remover a tampa de espuma de poliestireno.
  9. Certifique-se de que o homogenato planta é bem agitado a 150 rpm, colocar o termómetro no extracto e incubar até que ele atinja uma temperatura de 20 ° C ou à temperatura especificada pelo desenho experimental.
  10. Repita os passos de 4,7-4,9 para todas as alíquotas. Tomar uma amostra de 1 ml de cada calor precipitado extrair uma vez que atingiu a temperatura final, em seguida, continue com a secção 6.

5. Opcional: Precipitação de calor num permutador de calor

NOTA: Realizar os passos descritos nas secções 5.2 a 5.12, a fim de precipitar os profissionais de saúde do tabaco usando um permutador de calor. Ir toda a seção 5, se os profissionais de saúde têm sido precipitada por branqueamento (seção 2), ou em um recipiente aquecido (secção 4).

  1. Configurar dois volumes de trabalho de 8 Lbanhos de água, por exemplo, 50 x 40 x 40 cm, em baldes de espuma de poliestireno termicamente isolados ou similar. No primeiro banho, montar o termostato regulável para controle de temperatura subsequente (passo 5.3). Na segunda, adicionam-se 5 L de água desionizada e 2 kg de gelo para arrefecimento subsequente (passo 5.10).
    CUIDADO: Todos os passos subsequentes até 5,9 envolvem a manipulação de líquido quente. Usar equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas de isolamento térmico.
  2. Encha o primeiro banho de água com 8 L de água deionizada. Regule a temperatura para 74,5 ° C usando o termostato. Incubar a montagem por 15 min para atingir o equilíbrio térmico.
  3. Preparar um recipiente de armazenamento isolado por colocação de um 0,5-G em copo de plástico de 1 L de copo de plástico e preencher as lacunas com lã de algodão. Em alternativa, utilizar um recipiente termicamente isolado dedicado com um volume de trabalho de 0,5-G.
  4. Ligue o permutador de calor para a bomba peristáltica, a uma das extremidades e a uma mangueira de saída no outrr acabam utilizando L / S 24 tubos. Coloque as duas extremidades da tubagem juntamente com um termómetro no recipiente de armazenamento isolado e encha-o com 300 ml de tampão de extracção (Figura 2).
  5. Colocar o permutador de calor para o banho de água quente e ligar a bomba peristáltica a um caudal de 300 ml min -1. Certifique-se de que a temperatura resultante no vaso a 70 ° C, cerca de 4,5 ° C abaixo do ponto de o banho de água regulado, após 3 min.
  6. Se a temperatura no vaso isolado difere de 70 ° C, ajustar a temperatura do banho de água em conformidade e deixar o sistema equilibrar durante mais 15 min. Repetir este passo até que a temperatura do tampão de extracção aumenta desde a ambiente até 70 ° C em menos de 3 minutos, ou igual que o requerido para a experiência, e esvaziar o recipiente de aço inoxidável.
  7. Descartar o tampão de extracção a partir do vaso isolado e preparar aliquotas de 300 ml de extracto de planta. Encher o reservatório isolado com uma alíquota.
  8. Bombear o extrato da planta (secção 3.3) através do trocador de calor em 300 ml min -1 por 5 min. Certifique-se de que a temperatura do extracto é de 70 ° C, após 3 minutos, ou é igual à temperatura definida no desenho experimental.
  9. Após 5 min, colocar o permutador de calor para o banho de água gelada enquanto que o extracto ainda está a ser bombeado. Incubar em esta configuração até que a temperatura atinja exactamente 20 ° C, ou a temperatura definida no desenho experimental.
  10. Remover o tubo de entrada ligado à bomba peristáltica a partir do vaso isolado e continuar a bombear para recolher extracto vegetal precipitado com calor residual a partir de dentro do permutador de calor. Em seguida, parar a bomba.
  11. Repita os passos 5,7-5,10 para todas as alíquotas. Tomar uma amostra de 1 ml de cada extracto precipitou-calor, uma vez que atingiu a temperatura final, em seguida, passar os extratos para filtração saco (secção 6).
    NOTA: Depois de um primeiro ciclo de passos através de 5,7-5,10 não haverá tampão de extracção dedescartar no passo 5.7.

6. Bag filtração do Extrato vegetal

  1. Montar um filtro de saco para o cesto de suporte correspondente, o qual é montado no alojamento do filtro e proporciona suporte mecânico para o material de filtro flexível. Colocar num recipiente de 1 L por baixo do cesto e aplicam-se as alíquotas de extracção (a secção 3.3, 4.10 ou 5.11, dependendo do tratamento térmico) seleccionado para o saco a uma taxa de 150 ml min -1.
  2. Após filtração, medir a turbidez de uma diluição 1:10 de filtrado em tampão de extracção usando o turbidímetro.
  3. Retirar uma amostra de 1 ml e processar o filtrado saco como definido na concepção experimental, por exemplo, filtrao em profundidade e 7,10 cromatografia.

Análise 7. Amostra

  1. Medir a quantidade de proteína total solúvel (TSP), utilizando o método de Bradford 24,25.
    1. Em triplicado, pipetar 2,5 mL de cada amostra para os poços de uma únicaplaca de 96 poços. Incluir oito albumina de soro bovino (BSA) padrões, em triplicado, cobrindo a faixa de 0 - 2000 ng ml-1.
    2. Adicionar 200 mL de reagente Bradford a cada poço e misture bem por pipetagem cima e para baixo, mas com cuidado suficiente para evitar a formação de bolhas.
    3. Incubar durante 10 min a 22 ° C e mede-se a absorvância a 595 nm num espectrofotómetro. Calcular a concentração de TSP nas amostras com base na curva padrão através de um dos pontos de referência de BSA.
  2. Quantificar Vax8 por ressonância de plasma de superfície espectroscopia 26.
    1. Configuração do instrumento de ressonância plasmónica de superfície com 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) correndo tampão (HEPES 10 mM, ácido etilenodiaminotetraacético 3 mM (EDTA), cloreto de sódio 1,500 mM, 0,05% v / v de polissorbato 20, pH 7,4) e montagem de superfície de um chip de dextrano carboximetilado para dentro do dispositivo. Use a função primordial para limpar o sistema e iniciar uma execução manual com um caudal de 30ul min -1 em relação às células de fluxo 1 e 2. Injectar 30 mM de cloreto de hidrogénio duas vezes durante 60 segundos com uma injecção intercaladas 60 seg de hidróxido de sódio a 25 mM.
    2. Preparar 200 ul de uma 500 ng ml-1 de solução de mAb 5,2 em acetato de sódio 10 mM (pH 4,0). Descongelar 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida frascos (NHS) e centrifugar para a 16.000 xg durante 1 min. Misturar 70 uL de EDC com 70 ul de NHS e transferir para um frasco de plástico de 7 mm.
    3. Activa a superfície do chip de dextrano carboximetilado por superfície injectar a mistura de EDC / NHS em relação às células de fluxo 1 e 2 durante 10 min com um caudal de 10 ul min -1.
    4. Defina o caminho de fluxo para fluir somente célula 2. Pares de mAb 5,2, injectando-o durante 15 minutos a uma taxa de 10 ul min -1.
    5. Mudar o trajecto do fluxo flua células 1 e 2 e injectar de etanolamina durante 7 min a uma velocidade de 5 mL min -1 para desactivar a superfície. Tgalinha injectar cloreto de hidrogénio a 30 mM duas vezes durante 60 segundos com uma injecção intercaladas 60 seg de hidróxido de sódio a 25 mM.
    6. Injectar as amostras e MSP1 - 19 normas a uma taxa de 30 min mL -1 para 180 seg. Certifique-se de que a concentração Vax8 é de 50 - 1000 ng ml -1. Prepare pré-diluições em solução salina tamponada com HEPES contendo EDTA e polissorbato 20 (HBSEP) se necessário.
    7. Subtrair o sinal de pico de fluxo de uma célula a partir da célula de fluxo que 2 e utilizar a diferença para calcular a concentração Vax8 em amostras com base no sinal de MSP 1 - 19 de injecção com uma concentração conhecida de proteína de 500 ng mL -1.
    8. Regenerar a superfície do chip, após cada amostra ou MSP 1-19 injecção por exposição a cloreto de hidrogénio a 30 mM durante 60 segundos a uma taxa de fluxo de 30 ul min -1.
  3. Quantificar dsRed por espectrometria de fluorescência
    1. Em triplicado, de pipeta 50 ul de cada amostra para os poços individuais de uma meia-AR pretoEA placa de 96 poços. Incluem seis padrões DsRed que cobrem a faixa de 0 - 225 ug ml -1.
    2. Medir a fluorescência em duplicado utilizando um filtro de excitação de 530 nm ± 30 nm e um filtro de emissão de 590 ± 35 num espectrofotómetro. Calcular a concentração DsRed nas amostras com base na curva padrão através de um dos pontos de referência DsRed.
  4. Determinação de distribuições de tamanho de partícula
    1. Lavar uma cuvete com 1 ml de isopropanol e, em seguida, com 2 ml de água desionizada para remover partículas de poeira. Pipetar 850 mL da amostra na cuvete.
    2. Coloque a cuvete no potencial e partículas analisador de tamanho de zeta. Abra o "Software" e iniciar uma medição manual com "Proteína" como o material e "PBS", como o dispersante. Seleccionar uma temperatura de 25 ° C e um tempo de equilíbrio de 180 seg.
    3. Escolha a célula "DTS0012" e medida a 173 ° backscatter. Verifique a funct "auto"ion para a duração da medição e selecionar três medições com nenhum atraso intercaladas.
    4. Investigar o tamanho de partícula perfil do pico de distribuição uma vez que a medição estiver concluída, selecionando as três medições da amostra na vista experimento. Escolha a aba "PSD Volume".

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Precipitação de calor de proteínas da célula hospedeira de tabaco por branqueamento
O processo de branqueamento descrito no ponto 2. foi utilizado com sucesso para precipitar os profissionais de saúde de folhas de tabaco com 70 ° C, reduzindo o TSP por 96 ± 1% (n = 3), enquanto que a recuperação até 51% da proteína alvo Vax8, aumentando assim a sua pureza a partir de 0,1% a 1,2% antes da separação cromatográf ica 16. Também era possível recuperar 83 ± 1% (n = 3...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Os três métodos de precipitação acima descritos calor pode remover eficazmente os profissionais de saúde do tabaco antes de qualquer passo de purificação cromatográfica 16,17. Eles complementam outras estratégias que visam aumentar a pureza inicial do produto, por exemplo, gutação 29, 30 ou rhizosecretion centrífuga extracção 31,32, todos os quais são limitados para as proteínas secretadas. No entanto, os métodos baseados em calor só pode ser utilizado de uma forma si...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes e Veronique Beiß por fornecerem as sementes de tabaco transgênicas e a Ibrahim Al Amedi pelo cultivo das plantas de tabaco. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Richard M. Twyman pela assistência editorial, bem como a Güven Edgü por fornecer a referência MSP1-19. Este trabalho foi financiado em parte pela Bolsa Avançada do Conselho Europeu de Pesquisa ''Future-Pharma'', proposta número 269110, pela Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fundação Fraunhofer Future) e pelos Programas Internos da Fraunhofer-Gesellschaft sob a Bolsa nº. Atraia 125-600164.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Turbidímetro Portátil 2100PHach4650000
Kit de Acoplamento de AminaTurbidimeter GE HealthcareBR100050 Kit de acoplamento de cavacos SPR
Cesto de autoclaveNalgene6917-0230Cesto para branqueamento de folhas
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01Dispositivo SPR
Bio Cell Analyser BCA 003 R& D com 3D ORMSequipn.a.Analisadortamanho de partícula
LiquidificadorWaring800EGLiquidificador
BP-410Furh2632410001Filtro de
mangas Centrífuga 5415DEppendorf5424 000.410Centrífuga
Tubo de centrífuga 15 mlTubo de 2017106Labomédico
centrífuga 50 ml autoportanteTubodereação
chip CM5 GEHealthcareBR100012 Chip para medições SPR
Cubeta 10 x 10 x 45Sarsted67.754Cubeta para Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEsoftware
Fosfato dissódicoCarl Roth GmbH  4984.3 Componente de mídia
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Fertilizante
Forma -86C ULT freezerThermoFisher88400Freezer
Greenhousen.a.n.a.Paracultivo de plantas
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Rockwool block
Trocador de calor de loop Twentey (4,8 m de comprimento)n.a. (design personalizado)n.a.Heat permutador
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Componente de mídia
K200P 60DPall5302303Camada de filtro de profundidade
KS50P 60DPallB12486Camada de filtro de profundidade
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Termostato de banho-maria
L/S 24MasterflexSN-06508-24Tubulação
mAb 5.2American Type Culture CollectionHB-9148Vax8 anticorpo específico
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Bomba peristáltica
MiraclothLabomedic475855-1RPano de filtro
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020medidor de pH / medidor de condutividade
Osram branco frio 36 WOsram4930440Fonte de luz
PhytotronIlka Zelln.a.Paracultivo de plantas
Dissulfito de sódioCarl Roth GmbH8554.1Componente do meio Cloreto
de sódioCarl Roth GmbHP029.2Componente do meio
Recipiente de aço inoxidável; 0,7 kg 2,0 L; altura 180 mm; diâmetro 120 mmn.a. (design personalizado)n.a.Recipientepara precipitação de calor
Synergy HTBioTekSIAFRTLeitor de placas espectrométricas e de fluorescência
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Caixa do filtro
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS Medição da distribuição do tamanho das partículas
Zetasizer Software v7.11Malvernn.a.Softwarepara operar o dispositivo Zetasizer Nano ZS
de Tubo de 1110504 Labomedic

Referências

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940(2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Branqueamento de Plantas de TabacoExtratos de Tratamento T rmicoPrecipita o em Recipiente AgitadoConfigura o de Trocador de CalorPlanejamento de ExperimentosPurifica o Cromatogr ficaFiltra o de Fluxo PosteriorAn lise de Pureza ProteicaOtimiza o de Processo

Artigos relacionados