Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino

Resumo

A atividade enzimática da lactase é essencial para o processamento catabólico de lactose o dissacarídeo. Aqui, a atividade da lactase encontrado em suplementos dietéticos é analisada usando um ensaio colorimétrico. Isto fornece aos alunos uma plataforma experimental para a compreensão da atividade da lactase e enzima cinética.

Resumo

Compreender como funcionam as enzimas e isto aos exemplos da vida real, são fundamental para uma ampla gama de graduação em ciências biológicas e biomédicas. Tão fácil de seguir protocolo foi desenvolvido para estudantes de graduação de farmácia primeiros ano e fornece uma introdução de nível básico de reacções enzimáticas e procedimentos analíticos para análise enzimática. A enzima de escolha é a lactase, como este representa um exemplo de uma enzima disponível comercialmente relevante para a prática de doença humana/farmacêutica. Lactase é extraído de comprimidos de suplemento dietético e avaliados usando um ensaio colorimétrico baseado a hidrólise de um substrato artificial para lactase (Orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Lançamento do Orto-nitrofenol após a clivagem hidrolítica de ONPG pela lactase é medido por uma alteração na absorbância a 420 nm e o efeito da temperatura sobre a reação enzimática é avaliada por realizar a reação no gelo, à temperatura ambiente e em 37 ° C. Análise mais avançada pode ser implementada usando este protocolo, avaliar a atividade da enzima em condições diferentes e usando diferentes reagentes.

Introdução

As enzimas são um tipo especializado de proteína que agem como catalisadores biológicos, por reações químicas na vida organismos¹. A ação de enzimas é fundamental para a vida, fornecendo energia, eliminação de resíduos e permitindo que os organismos funcionar. Enzimas de compreensão é, portanto, fundamental para uma compreensão completa da vida. Esse conhecimento é essencial para uma grande variedade de programas de grau de nível de Universidade, variando de ciências médicas de biologia. Enquanto um fundo detalhado desde princípios de catálise até modelos teóricos da atividade da enzima pode ser fornecido aos estudantes utilizando palestras e material de leitura, as propriedades de reacções enzimáticas são melhor compreendidas pelas mãos na experiência prática de enzimas em ação como previamente demonstraram². Este protocolo fornece um simples para seguir o paradigma experimental para medir a atividade da enzima em condições de laboratório, utilizando lactase como um exemplo de uma enzima com uma actividade relevante para a saúde e nutrição humana.

A lactase hidrolase glicosídica (CE-3.2.1.23/26) é uma enzima de central importância nutricional para mamíferos³. A atividade da lactase é altamente conservada através da evolução e deriva da família de enzimas beta-galactosidase — uma família presente de Escherichia coli através de Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)⁴. A importância fundamental da lactase num cenário nutricional humano decorre de seu papel em permitir que a quebra da lactose em seus componentes monossacarídeos constituintes, que podem ser usados para gerar energia no corpo. Lactase catalisa a hidrólise da ligação glicosídica em lactose dissacarídeo, liberando a galactose e a glicose (Figura 2)⁵. Esses monossacarídeos são usados principalmente para a geração de adenosina trifosfato (ATP) através do ciclo do ácido cítrico e fosforilação oxidativa⁶. Durante o desenvolvimento infantil e neonato, lactase é altamente expresso no sistema digestivo humano, quebrando à lactose recebida do leite materno de que lactose é o componente primário de hidrato de carbono e uma das principais fontes de nutrição durante os primeiros anos ⁷. a importância médica de lactase é destacada por deficiência de lactase congênita (CID), uma rara condição autossômica recessiva, causada por mutações no gene da lactase (LCT) que codifica para a enzima de lactase⁸. Recém-nascidos com CID apresentam pouca atividade de lactase, assim eles não podem ser alimentados com leite materno, qualquer outro tipo de leite ou fórmula que contenha lactose.

Durante a infância, expressão de lactase normalmente é reduzida; no entanto, esta redução após o desmame varia geograficamente, com aproximadamente 35% dos adultos em todo o mundo continua a expressar a enzima⁹. Expressão sustentado de lactase, conhecido como persistência da lactase, permite que indivíduos continuar a digerir leite e produtos lácteos de uma variedade de fontes. Por outro lado, a perda de expressão de lactase pode levar à intolerância à lactose, também conhecido como adulto-tipo hypolactasia (ATH), resultante de uma incapacidade de quebrar a lactose no intestino. ATH é caracterizada por uma compilação acima de lactose no cólon após a ingestão de lactose, contendo produtos alimentares. No cólon, a lactose acumulada é fermentada pela fauna microbiana do intestino, liberando gases incluindo hidrogênio, metano e dióxido de carbono. A produção desses gases em indivíduos com deficiências de enzima lactase promover distensão abdominal, flatulência aumentada, dor, náusea e borborygmi (rumbling estômago)⁷. Aumento dos níveis de lactose no tracto digestivo também pode levar a fezes soltas.

O controle da expressão do gene LCT é modulado por polimorfismos localizados em intrões do gene MCM6 nas proximidades. Indivíduos com expressão sustentado de lactase carregam polimorfismos que funcionam como potenciadores distais fortes para a expressão do gene LCT , compensando assim o normal no Regulamento da transcrição de LCT durante o desmame e, consequentemente, sustentar a expressão de lactase na idade adulta³. Polimorfismos de potenciador sugeridos que foram selecionadas positivamente após a domesticação do gado e camelos no Oriente Médio há mais de cinco mil anos de^9,10.

Os sintomas resultantes de ATH podem ser gerenciados por reduzir a ingestão de lactose, por exemplo, removendo produtos lácteos da dieta. Uma abordagem alternativa para ATH e a abordagem de escolha para CID, é o uso de suplementos de lactase, amplamente disponíveis em farmácias. Estes suplementos fornecem lactase isolado de uma variedade de fontes, incluindo leveduras e bactérias, em um formulário líquido ou comprimido-based que pode ser tomado com ou adicionado à lactose contendo alimentos. O suplemento vai hidrolisar uma proporção de lactose presente nos alimentos de produtos de glicose e galactose, assim permitindo a sua absorção e evitar o acúmulo de substrato de lactose não digerida no intestino.

Baseado no uso de suplementos de lactase, como uma dieta ajuda, nós desenvolvemos uma experiência de laboratório de enzimologia simples apropriada para primeiro ano biomédica ciência ou farmácia estudantes. Este experimento de laboratório aproveita-se de suplementos de lactase comercialmente disponível e usa orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) para fornecer um ponto de extremidade colorimétrico para medir a clivagem das ligações glicosídicas por lactase ( Figura 3)¹¹. ONPG atua um substrato artificial para a lactase, que quando submetidos à hidrólise por esta enzima produz a D-galactose e orto-nitrofenol. O último produto tem uma cor amarela, absorve luz no comprimento de onda de 420 nm. Através da quantificação quaisquer alterações em absorvância a 420 seguinte nm a exposição de ONPG a lactase, é possível estimar a atividade desta enzima. Este experimento de laboratório fornece uma demonstração de atividade enzimática hidrolase. Construindo em repetições adicionais e realização de ensaios em diferentes condições, é possível incorporar mais sofisticadas análises de cinética enzimática, proporcionando um valioso exemplo de vida real de enzimas em ação relevante para a saúde humana.

Protocolo

Nota: O protocolo abaixo foi desenvolvido para ser realizado ao longo de duas horas (incluindo a conclusão de planilhas de classe) em um laboratório de ensino purpose-built. As etapas experimentais foram deliberadamente colocar juntos para excluir a análise mais detalhada da cinética enzimática (realizada no âmbito deste curso usando o modelo de dados); no entanto — conforme observado na discussão — o protocolo fornece um modelo para análises mais avançadas, dependendo do tempo, instalações e o nível de realização.

SEGURANÇA: Este prático deve ser efectuado de acordo com as regras da prática boa de laboratório químico (GCLP) — equipamento de protecção pessoal, incluindo o casaco de laboratório afivelados, luvas descartáveis e óculos de segurança deve ser usado em todos os momentos no laboratório .

1. extrair a enzima

1. Esmaga um comprimido de lactase, contendo 200 mg de enzima, para um mesmo pó usando um almofariz e um pilão.
2. Coloque o pó resultante em um tubo de 15 mL rotulados de "suspensão" e ressuspender em 10 mL de soro de 100 mM tamponado fosfato (PBS).
3. Vórtice para 1 min maximizar a extração da enzima.
4. Transferi 1 mL da suspensão para um tubo de 1,5 mL centrífuga e centrifugar por 1 min a 10.000 x g de partículas sólidas de sedimentos.
5. Transferi 500 µ l do sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL rotulado "Extrato da Lactase".

2. observar a reação colorimétrica

1. Lugar 390 µ l de PBS a 100 mM em um tubo de 1,5 mL rotulados "A reação".
2. Adicione 100 µ l de solução ONPG 5mm e misture bem, num Vortex.
   Atenção: Esta prática usa orto-nitrofenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) como um substituto para a lactose. Desde ONPG é um composto fenólico, devem ser manuseado com cuidado. Em caso de contacto com a pele com ONPG, a pele exposta deve ser lavada imediatamente. Todos os derramamentos devem ser limpou imediatamente com toalhas de papel para ser escoado o fluxo adequado de resíduos.
3. Adicione 10 µ l de extrato para o tubo de reação A e misture bem, num Vortex.
4. Observar a mistura de reação por 5 minutos e observe quaisquer alterações colorimétricas para a solução.

3. medir a atividade da enzima

1. Configurar dois tubos de 1,5 mL: um rotulado "Reação B", uma marcada "controle".
2. Adicionar 390 µ l de PBS a 100 mM para a reação do tubo B, 400 µ l de PBS de 100 mM para o tubo de controle e em seguida, adicionar 100 µ l de ONPG de 5 mM a cada tubo.
3. Misture o conteúdo num Vortex.
4. Adicionar 10 µ l de extracto de lactase no tubo de reação B, misturar vortexing e permitir a reação proceder para 1 min à temperatura ambiente.
5. Decorrido 1 min, adicione 500 µ l de carbonato de sódio 1 M para ambos os tubos para inibir a enzima lactase, aumentando o pH, encerrando assim a reação.
6. Transferir 500 µ l de cada tubo em cubetas de espectrofotômetro limpo e medir a absorbância a 420 nm, utilizando o Espectrofotômetro.
7. Observe a absorvância para reação B e amostras de controle e em seguida, subtrair o valor do controle do valor de reação para derivar a mudança de absorbância devido à hidrólise de ONPG na presença da enzima activa.

4. efeito da temperatura na atividade enzimática

1. Configurar o controle de três tubos e três tubos de reação conforme descrito na seção 3 e rotular estes "4 ° C", "Temperatura ambiente" e "37 ° C".
2. Após a adição da enzima extrair, incubar um tubo no gelo, um em temperatura ambiente e um a 37 ° C (em um banho de água pré-aquecida).
3. Permitir que as reações prosseguir por 1 min e então terminar a reação adicionando 500 µ l de carbonato de sódio 1 M para cada tubo.
4. Medir a absorbância a 420 nm para cada tubo, conforme descrito na seção 3. Registre os valores, subtraindo o valor do controle do valor de reação em cada caso.

Resultados

Resultados representativos para a seção 2 do protocolo são mostrados na Figura 4A. A reação de controle, na ausência da enzima lactase, permanece clara enquanto a solução de reação, contendo extrato do comprimido de lactase, fica amarela como ONPG é hidrolisado liberando orto- nitrofenol. Figura 4B mostra a quantificação utilizando unidades arbitrárias da secção 4 do protocolo, seguir análise de amostras usando o Espectrofotômetro. Produção de orto-nitrofenol é mais baixa quando a reação é incubada no gelo e mais alto quando a reação é realizada a 37 ° C.

Figura 1 : Escherichia coli beta-galactosidase. (A) estrutura de cristal da beta-galactosidase de Escherichia coli, mostrando a estrutura tetramérica da ativo complexo. (B) Allolactose (mostrado em vermelho) ligado ao sítio ativo da beta-galactosidase. Imagens geradas a partir de PDB 1JZ8⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Acção enzimática de lactase. Hidrólise da lactose por lactase para produzir beta-D-galactose e beta-D-glicose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Hidrólise de orto-nitrofenol - beta -D-galactopyranoside. Hidrólise ONPG pela lactase para produzir beta-D-galactose e orto-nitrofenol (que é na cor amarela), que permite a estimativa da atividade da lactase de medição de absorbância a 420 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 4 : Hidrólise ONPG. Resultados representativos de hidrólise ONPG, mostrando tubos de controle e reação (A) e dados representativos da secção 4 do protocolo registrados em planilhas em sua classe, mostrando a absorvância cru em unidades arbitrárias em 420 nm, corrigida para o fundo e em três temperaturas diferentes (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Condição experimental	Variáveis experimentais
Temperatura	0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
Concentração de substrato	0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Inibição competitiva	à lactose ONPG além de 0 mM, 1 mM, 5 mM ou 10 mM 5 mM
Dependência do tempo	0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Desnaturação térmica	Extrato da lactase aquecido a 100 ° C durante 10 min antes de ensaio

Tabela 1: potencial estendido condição experimental. Sugere-se experiências estendidas, a efectuar em triplicado, investigar aspectos específicos da biologia do lactase.

Discussão

Um detalhado conhecimento e compreensão das enzimas, reações enzimáticas e cinética enzimática é necessária para uma vasta gama de tópicos abrangendo biologia, biomedicina e farmacologia. O protocolo descrito acima usa lactase como um exemplo de uma enzima relevante para a saúde humana, para demonstrar reações enzimáticas, fornecendo as competências-chave que podem ser usadas em experimentos de laboratório-baseado mais avançados.

Este protocolo foi deliberadamente concebido para ser tão robusto como possíveis, permitindo que os estudantes com pouca ou nenhuma experiência de laboratório molhado para produzir resultados interpretáveis em um curto espaço de tempo. No ano letivo de 2014/2015 da faculdade de farmácia da Universidade de Reading, um total de 144 estudantes, organizados em grupos de 3, realizado o experimento "medindo lactase", com todos os grupos capazes de detectar algum nível de atividade enzimática de tablet de lactase extratos.

Há uma série de passos críticos no presente protocolo. Em primeiro lugar, é essencial que a extração inicial seja eficiente, permitindo que a solubilização de suficiente enzima activa para análises subsequentes. Em nossa experiência, primeiro ano estudantes podem alcançar isto seguindo o protocolo descritos; no entanto algumas orientações de manifestantes de laboratório era necessária neste momento. Embora parece um ponto óbvio, um fator chave no sucesso deste protocolo é a capacidade de cuidadosamente medir volumes, corretamente rotular tubos e siga as instruções. Enquanto um certo nível de proficiência pode ser assumido por muitos alunos, monitoramento cuidadoso e um pedido claro para que os alunos pedir ajuda no caso em que eles não tem certo de o que fazer em seguida fornece a maior probabilidade de um ensaio bem sucedida.

Avaliação de estudante pode ser efectuada em-classe planilha (disponível como material suplementar), pedindo os alunos observar dados de experimentos, comentário sobre seus resultados e link para informações de plano de fundo/leitura do material da palestra, ou por mais detalhada, sem avaliação de classe com o modelo de dados fornecido permitindo análises cinéticas ser tentada e avaliada.

O protocolo apresentado aqui é um exemplo simples de um ensaio de atividade de lactase sob condições de laboratório de ensino, e há muitas oportunidades para aumentar a complexidade do experimento para permitir análises mais avançadas. Em particular, o protocolo apresentado fornece uma introdução ao conceito de cinética enzimática, mas não permite a análise cinética de dados experimentais. Como tal, recomendamos Visualizar o protocolo descrito como um modelo inicial para classes, com os detalhes precisos, adaptados para atender os objetivos específicos e talentos da coorte estudante realizar os experimentos. Exemplos de experimentos prolongados poderiam incluir: repetidas medições em diferentes temperaturas, usando concentrações de substrato diferentes para permitir a análise estatística, análise cinética de dados (apropriados para estudantes de bioquímica/majors), começando com vários comprimidos diferentes e permitindo que os alunos a avaliar diferente atividade da enzima em cada um (com a adição de tabuletas controle, apropriadas para estudantes de ciência forense/majors), avaliação do impacto de desnaturação térmica ou realização de competição experiências por adição de lactose ou inibidores de lactase (tabela 1). Um protocolo detalhado para análise cinética de lactase já havia sido publicado¹².

Uma força importante deste protocolo é que ele combina uma introdução básica à cinética de enzimologia e enzima com um estudo de caso da vida real da enzimologia na medicina. Isso faz com que este laboratório experiência de particular relevância para os estudantes de medicina, farmácia, ciências biomédicas e assuntos relacionados. Importante, o fato de que haja uma condição médica séria e uma questão dietética mais generalizada associada com catabolismo à lactose fornece a oportunidade de criar uma vasta gama de questões éticas e médicas com os alunos. Isto poderia incluir as questões que envolvem testes genéticos para condições médicas e associado a discussões relacionadas a terapia genética e aconselhamento genético, bem como a utilização e venda de suplementos medicinais. Uma limitação importante é que o protocolo não permite a estimativa precisa da concentração de enzima, devido às matérias-primas usadas para a extração. Uma modificação para dar conta disto, no entanto, seria usar a enzima de grau reagente para o ensaio. Importante, isto também permitiria um cálculo mais preciso da cinética para a enzima lactase.

Em conclusão, análise da atividade da lactase em um laboratório de ensino ambiente fornece uma introdução robusta, atraente e interessante para o campo da biologia de enzima para fase inicial estudantes universitários.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Comprimido de lactase	Lamberts	8511-60
Solução salina tamponada com fosfato (em pó)	Sigma	P3813	Dissolvido em água deionizada até uma concentração final de 100 mM
ONPG	Sigma	N1127	Dissolvido em água deionizada até uma concentração final de 5 mM
Carbonato de sódio	Sigma	451614	Dissolvido em água deionizada até uma concentração final de 1 M
Água desionizada	NA	NA
Pilão e almofariz	VWR
Espectrofotômetro	Jenway 6315
Pipetas	Gilson
Tubos de 15 mL	VWR
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf
Espectrofotômetro Cuvetes	Jenway
Vortex	Vortex genie 2
Centrífuga	Beckman
Balde de gelo	VWR
Banho-maria	Thermo-Scientific
Balanças	Thermo-Scientific