Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Resumo

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Resumo

As partículas de ribonucleoproteína direcionam a biogênese e a regulação pós-transcricional de todos os mRNAs por meio de combinações distintas de proteínas de ligação ao RNA. Eles são compostos de elementos de RNA de ação cis dependentes da posição e combinações únicas de proteínas de ligação ao RNA. Definir a composição de uma RNP específica é essencial para alcançar uma compreensão fundamental da regulação gênica. O isolamento de um RNP selecionado é semelhante a encontrar uma agulha no palheiro. Aqui, demonstramos uma abordagem para isolar RNPs associados na região 5 'não traduzida de um mRNA selecionado em células assíncronas e transfectadas. Este RNP cognato demonstrou ser necessário para a tradução de vírus selecionados e genes celulares de resposta ao estresse.

O protocolo de coprecipitação RNA-proteína demonstrado é adequado para a análise a jusante de componentes proteicos por meio de análises proteômicas, immunoblots, Este protocolo experimental demonstra que DHX9 / RNA helicase A é enriquecido no terminal 5 'do RNA retroviral cognato e fornece informações preliminares para a identificação de sua associação com mRNAs cognatos huR e junD associados ao estresse celular.

Introdução

a expressão do gene pós-transcrição é regulada com precisão, começando com a transcrição do DNA no núcleo. Controlada pela ligação RNA proteínas (RBPs), mRNA biogênese e metabolismo ocorrem em partículas de ribonucleoproteínas altamente dinâmicos (RNPs), que se associam e dissociam com um mRNA precursor do substrato durante a progressão da RNA metabolismo ^1-3. mudanças dinâmicas em componentes RNP afetar o destino pós-transcricional de um mRNA e fornecer garantia de qualidade durante o processamento de transcritos primários, seu tráfico nuclear e localização, a sua actividade como modelos de mRNA para a tradução, ea eventual volume de negócios de mRNAs mad....

Protocolo

tampão composições

Tampão de Lavagem:

mM de Tris-HCl a 50, pH 7,4

150 mM de NaCl

MgCl2 3 mM

Tampão de baixo teor de sal:

mM de Tris-HCl a 20, pH 7,5

10 mM de NaCl

MgCl2 3 mM

2 mM de DTT

1x cocktail inibidor de protease livre EDTA-

RNase Out 5 ul / ml (inibidor de RNase)

Citoplasmático de tampão de lise:

Resultados

Resultados RIP anteriores identificaram RNAs gag retrovirais e selecionados RNAs celulares que co-precipitado com DHX9 / RHA, incluindo HIV-1 ^6, Jund ⁶ e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, não publicado). O retroviral 5 'UTR foi demonstrada para co-precipitar com DHX9 / RHA no núcleo e para a co-isolar no citoplasma em polirribossomas. Ela é definida exclusivamente como a cis actuando elemento de controlo pós-transcricional (PCE) ^6. Para isolar os comple.......

Discussão

O isolamento RNP e estratégia de identificação RNA cognate aqui descrito é um meio seletivo de investigar a interacção RNA-proteína específica e de descobrir proteínas candidatas co-regulação de um RNP específica em células.

A vantagem de utilizar clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos para isolar RNP é a capacidade para capturar e analisar especificamente o elemento que actua em cis de ARN RNP sobre RNP heterogéneos ligados a jusante do elemento de ARN actuam em cis de in.......

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dynabeads Proteína A	Invitrogen	10002D
Dynabeads Proteína G	Invitrogen	10004D
Anti-FLAG anticorpo	Sigma	F3165
Anti-FLAG	Sigma	F7425
Anti-RHA anticorpo	Vaxron	PA-001
TRizol LS reagente	Tecnologia de	vida10296-028
RNase H	Ambion	AM2292
Clorofórmio	Fisher Scientific	BP1145-1
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
RNaeasy coluna de limpeza	Qiagen	74204
Omniscript transcriptase reversa	Qiagen	205113
RNase Out	Invitrogen	10777-019
Coquetel inibidor de protease	Roche	5056489001
Triton X-100	Sigma	X100
NP-40	Sigma	98379
Glicerol	Fisher Scientific	17904
Primers hexâmeros aleatórios	Invitrogen	N8080127
Oligo-dT primers	Invitrogen
Primers de PCR	IDT		Primers específicos para o gene para
Oligonucleotídeo de amplificação de PCR para clivagem mediada por RNase H	IDT		Primer anti-sentido para RNA alvo
Tripsina	Gibco Tecnologia de vida	25300-054
Meio de cultura de tecidos DMEM	Tecnologia de vida Gibco	Tecnologia 11965-092
Soro bovino fetal	Tecnologia de vida Gibco Tecnologia	10082-147
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-5
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	S642-212
Cloreto de magnésio	Fisher Scientific	BP214
DTT	Fisher Scientific	R0862
Sacarose	Fisher Scientific	BP220-212
Membrana de nitrocelulose	Bio-Rad	1620112
Suporte magnético			Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml segurando
Capuz			Para cultura de tecidos animais
Incubadora			Para cultura de tecidos animais
Aparelho			de proteínas Separação de amostras de proteínas
Aparelho			Transferência de amostras de proteínas
Pronto para uso géis de proteína (4-15%)			Separação de amostras de proteína
Centrífuga			Pellet abaixo do
rotador			Misture a amostra de ponta a ponta
Vortex			Misture as amostras

AM5730G laminar CO de gel de transferência de proteínas de mesa de mesa de amostra