Artigo de método

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

DOI:

10.3791/54391

⸱

16 de janeiro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As partículas de ribonucleoproteína direcionam a biogênese e a regulação pós-transcricional de todos os mRNAs por meio de combinações distintas de proteínas de ligação ao RNA. Eles são compostos de elementos de RNA de ação cis dependentes da posição e combinações únicas de proteínas de ligação ao RNA. Definir a composição de uma RNP específica é essencial para alcançar uma compreensão fundamental da regulação gênica. O isolamento de um RNP selecionado é semelhante a encontrar uma agulha no palheiro. Aqui, demonstramos uma abordagem para isolar RNPs associados na região 5 'não traduzida de um mRNA selecionado em células assíncronas e transfectadas. Este RNP cognato demonstrou ser necessário para a tradução de vírus selecionados e genes celulares de resposta ao estresse.

O protocolo de coprecipitação RNA-proteína demonstrado é adequado para a análise a jusante de componentes proteicos por meio de análises proteômicas, immunoblots, Este protocolo experimental demonstra que DHX9 / RNA helicase A é enriquecido no terminal 5 'do RNA retroviral cognato e fornece informações preliminares para a identificação de sua associação com mRNAs cognatos huR e junD associados ao estresse celular.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

a expressão do gene pós-transcrição é regulada com precisão, começando com a transcrição do DNA no núcleo. Controlada pela ligação RNA proteínas (RBPs), mRNA biogênese e metabolismo ocorrem em partículas de ribonucleoproteínas altamente dinâmicos (RNPs), que se associam e dissociam com um mRNA precursor do substrato durante a progressão da RNA metabolismo 1-3. mudanças dinâmicas em componentes RNP afetar o destino pós-transcricional de um mRNA e fornecer garantia de qualidade durante o processamento de transcritos primários, seu tráfico nuclear e localização, a sua actividade como modelos de mRNA para a tradução, ea eventual volume de negócios de mRNAs maduros.

Numerosas proteínas são designadas como RBPs em virtude dos seus domínios de aminoácidos conservados, incluindo o motivo de reconhecimento de ARN (RRM), a cadeia dupla de ARN domínio de ligação (RBD), e trechos de resíduos básicos (por exemplo, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs são rotineiramenteisolado por estratégias de imunoprecipitação e são selecionados para identificar os RNAs cognatos. Alguns RBPs co-regular pré-ARNm que estão relacionadas funcionalmente-, designados como regulons ARN 5-8. Estes RBPs, seus mRNAs cognatos, e às vezes RNA não-codificante, formar RNPs catalíticos que variam em composição; a sua singularidade se deve a várias combinações de factores associados, bem como a sequência temporal, localização, e a duração das suas interacções 9.

Imunoprecipitação ARN (RIP) é uma técnica poderosa para isolar RNP de células e para identificar transcritos associados utilizando análise da sequência 10-13. Mover-se de candidato a genoma-wide rastreio é viável através de RIP combinada com uma análise de microarray 14 ou sequenciamento de alto rendimento (RNA-Seq) 15. Do mesmo modo, as proteínas co-precipitação pode ser identificado por espectrometria de massa, se eles são suficientemente abundante e separável a partir do anticorpo de co-precipitante 16,17. Aqui, nos dirigimos a metodologia para o isolamento de componentes de RNP de um ARN cognato específico a partir de células humanas de cultura, embora a abordagem é alterável para lisados ​​solúveis das células vegetais, fungos, vírus e bactérias. Análises a jusante do material incluem a identificação de candidatos e validação por imunotransferência, espectrometria de massa, ensaio enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, conforme resumido na Figura 1.

Dado o papel fundamental da RNP para controlar a expressão do gene ao nível pós-transcricional, alterações na expressão de RBPs componentes ou a sua acessibilidade às cognato RNAs pode ser prejudicial para a célula e está associada com vários tipos de afecções, incluindo a doença neurológica 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) é necessário para a tradução de mRNAs selecionados de origens celulares e retrovirais 6. Estes RNAs cognatos exibem elementos de actuação cis-estruturalmente relacionados dentro do seuUTR 5 ', que é designado como o elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 19. Actividade RHA-PCE é necessário para a tradução eficiente dependente da tampa de diversos retrovirus, incluindo o HIV-1, e de genes reguladores do crescimento, incluindo Jund 6,20,21. Codificada por um gene essencial (dhx9), RHA é essencial para a proliferação celular e a sua infra-regulação elimina a viabilidade das células 22. A análise molecular de RHA-PCE RNP é um passo essencial para entender por que a atividade RHA-PCE é necessário controlar a proliferação celular.

A caracterização precisa dos componentes RNP RHA-PCE no estado estacionário, ou mediante perturbação fisiológica da célula requer o enriquecimento selectivo e captura das RNPs RHA-PCE em abundância suficiente para a análise a jusante. Aqui, o RNA retroviral PCEgag foi etiquetado com 6 cópias do local de ligação de ARN de actuação cis para a proteína de revestimento de MS2 (CP) dentro do enquadramento de leitura aberto. A proteína de revestimento de MS2 foi exogenously co-expressa com PCEgag ARN por transfecção do plasmídeo para facilitar a montagem RNP em células em crescimento. RNP contendo a proteína de revestimento de MS2 ARN com PCEgag cognato MS2-tagged foram imunoprecipitadas a partir do extracto celular e capturada em esférulas magnéticas (Figura 2A). Para capturar selectivamente os componentes ligados ao RNP PCE, a RNP imobilizado foi incubado com um oligonucleótido complementar a sequências distais ao PCE, formando um híbrido de ARN-ADN que é o substrato para a actividade de RNase H. Desde PCE é posicionado no 'terminal do 5' não traduzida a 5 região, o oligonucleótido é complementar às sequências de ARN adjacentes ao sítio de iniciação da tradução retroviral (gag codão de iniciação). Clivagem com ribonuclease H perto do início da mordaça codão libertado complexo UTR a 5 'a partir do RNP imobilizada, que foi recolhido como o eluente. Em seguida, a amostra foi avaliada por RT-PCR para confirmar a captura de PCEgag e por SDS-PAGE e imunotransf erência para confirmar a capture da proteína de revestimento alvo MS2. A validação da proteína de ligação a ARN-associado PCE, DHX9 / ARN helicase A, foi então realizada.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
tampão composições
Tampão de Lavagem:
mM de Tris-HCl a 50, pH 7,4
150 mM de NaCl
MgCl2 3 mM
Tampão de baixo teor de sal:
mM de Tris-HCl a 20, pH 7,5
10 mM de NaCl
MgCl2 3 mM
2 mM de DTT
1x cocktail inibidor de protease livre EDTA-
RNase Out 5 ul / ml (inibidor de RNase)
Citoplasmático de tampão de lise:
0,2 M de sacarose
1,2% de Triton X-100
NETN-150 Tampão de Lavagem:
mM de Tris-HCl a 20, pH 7,4
150 mMNaCl
0,5% de NP-40
MgCl2 3 mM
10% de Glicerol
Tampão de Ligação:
HEPES 10 mM, pH 7,6
KCl 40 mM
MgCl2 3 mM
2 mM de DTT
5% de glicerol

Tabela 2: Composições de memória intermédia.

1. Preparação de células e com a matriz de afinidade

  1. A cultura de uma linha celular de interesse à sub-confluência (80%) numa placa de 10 cm. Utilizar placas de 10 cm para imunoprecipi independentes (IP) de uma proteína de revestimento de MS2-NLS marcado com FLAG. Execute o IP utilizando anti-soros para a marca de epitopo-FLAG. Ao expressar o MS2 plasmídeo proteína de revestimento marcado com FLAG, as células transfectar 24-48 h antes da colheita 20.
    NOTA: A RNP particular pode ser enriquecida a partir nuclear ou citoplasmaOs lisados ​​de IC ou uma preparação bioquimicamente fraccionadas, tais como fracções de gradiente de sacarose. Recomenda-se a colheita do ligado de células não transfectadas em paralelo para instituir um controlo negativo adicional.
  2. Transferir 60 uL por IP de proteína G suspensão esférulas magnéticas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
  3. Colocar o tubo em uma cremalheira íman para tubos de microcentrífuga para separar os grânulos a partir da solução de armazenamento.
  4. Retirar a solução de armazenamento, chamando-o cuidadosamente com uma micropipeta.
  5. Retire o tubo do rack ímã.
  6. Lavagem e equilibrar as contas com 600 ul (10 vezes o volume utilizado de esferas) de 1x tampão de lavagem (Tris-HCl a 20, pH 7,4; MgCl2 3 mM, e NaCl 150 mM) e-sobre-extremidade final da rotação durante 3 min à temperatura ambiente.
  7. Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem.
  8. Adicionar 10 volumes (600 ul) de tampão de lavagem 1x e anticorpo FLAG imunoprecipitar ao pr equilibradaotein G esferas magnéticas (de acordo com a quantidade recomendada pelo fabricante para uma imunoprecipitação) e rodar para a sobre-extremidade final à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min para conjugar o anticorpo imunoprecipitação. Utilizar a IgG de isotipo correspondente como um controlo negativo de anticorpo adequado.
  9. Colocar o tubo na cremalheira íman para recolher as esferas e para remover o sobrenadante.
  10. Remover o tubo a partir da cremalheira íman e lavar as esferas de anticorpo conjugado com 10 volumes (600 L) de tampão de lavagem 1x e rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita esta etapa duas vezes.
  11. Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem.

2. A colheita da RNP

Nota: Preparar a RNP durante o tempo de incubação após o passo 1.8.

  1. Remover o meio de cultura das células por aspiração e lavar as células duas vezes com 1-5 ml de gelo-frio 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Use um raspador de células para desalojar molhado,células aderentes antes da colheita por centrifugação a 226 xg durante 4 min a 4 ° C.
  2. Adicionar 375 ul de gelado, tampão de baixo teor salino (Tris-HCl a 20, pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 10 mM de NaCl; 2 mM de DTT; 1x cocktail inibidor de protease, isento de EDTA; e 5 ul / ml Inibidor de RNase) para o sedimento celular e permitir inchaço, colocando-o em gelo durante 5 min.
    NOTA: Tailor o volume de tampão de baixo teor salino de acordo com o tamanho do agregado de células. Para 1,2 x 10 6 células de uma placa de 10 cm, 375 ul de tampão é suficiente.
  3. Para recolher o lisado celular citoplasmática, adicionar 125 ul de tampão de lise arrefecido com gelo (sacarose 0,2 M / 1,2% de Triton X-100), e, em seguida, executar 10 pancadas com um homogeneizador de Dounce que foi pré-arrefecido num balde de gelo.
    NOTA: Para recolher o extracto celular total, tampão de lise RIPA padrão é recomendada para solubilizar o nucleoplasma / cromatina.
  4. Rotação numa microcentrífuga a velocidade máxima (16000 xg) durante 1 min; isso vai limpar o sobrenadante de detritos de umanúcleos nd.
  5. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,7 mL que foi em gelo. Determinar a concentração de proteína total através de uma norma, o método preferido em laboratório, tais como o Ensaio de Bradford 23. Reserva-se uma alíquota de pelo menos 10% para uma análise de transferência de Western, para ser usado como um controle de entrada. Use o ligado de células colhidas imediatamente para imunoprecipitação ou armazená-lo a -80 ° C para análise futura.
    NOTA: Em nossa experiência, estas amostras podem ser armazenados e utilizados vários meses mais tarde para análise de imunoprecipitação, sem um compromisso de integridade.

3. Immunoprecipitation

  1. Adicionar o volume desejado do lisado de células colhida, com base na concentração de proteína foi determinada na etapa 2.5, com as esferas de anticorpo conjugado alvo. Usando 1X tampão de lavagem, levar o volume total até 600 uL e girar extremidade-sobre-extremidade durante 90 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Este período de tempo é suficiente para gerarum isolamento sólido de complexos de RNP de afinidade elevada, minimizando a ligação não específica. Diluir RNP fontes alternativas, tais como as fracções de gradiente de sacarose, de pelo menos 1: 1 com tampão de lavagem 1x e, em seguida, incuba-los com complexos de anticorpo-grânulo previamente preparados, como mencionado acima.
  2. Após 90 minutos de incubação, colocar o tubo IP na prateleira ímã para recolher as contas. Reservar o sobrenadante como por escoamento.
    NOTA: Este primeiro flow-through é uma amostra de controlo importante para medir a eficiência IP. Um ensaio de imunotransferência irá fornecer uma indicação da eficiência de IP, bem como a especificidade das interacções investigados. Recomenda-se manter este sobrenadante para análise a jusante.
  3. Lavar as, esferas de anticorpo conjugado ligado a RNP com 10 volumes (600 L) de NETN-150 tampão de lavagem arrefecido com gelo (Tris-HCl a 20, pH 7,4; NaCl 150 mM; MgCl2 3 mM; NP40 a 0,5%; e glicerol a 10%), sob rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita o passo 3 vezes.
    NOTA: Este tampão difere do tampão de lise e reduz eficazmente associações fracas ou não-específicas.
  4. Após a lavagem final, ressuspender os complexos RNP imobilizada em 60 ul de tampão gelado 1x de ligação (HEPES 10 mM, pH 7,6; KCl 40 mM; MgCl2 3 mM; glicerol a 5%, e 2 mM de DTT) e de reserva de 10% dos grânulos complexos imobilizados por Western blot e 20% para o isolamento de ARN.

4. eluição

  1. Ajustar o volume remanescente para 100 ul com tampão de ligação arrefecido com gelo 1x e aquecer o tubo a 70 ° C durante 3 min.
  2. Para isolar complexos de ARN-proteína cognatos, adicionar um oligonucleótido de ADN de ~ 30 nt que é complementar ao contorno da sequência 3 'do ARN de interesse e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave (100 nM de oligonucleótido é suficiente).
    NOTA: O oligonucleótido é anti-sentido para os resíduos de nucleótidos adjacentes, para o início da tradução do local da construção PCE usados ​​como um example neste protocolo. complementaridade sequência apropriada é fornecido pelo teor de GC ~ 40%. Desenhar o oligonucleótido anti-sentido para a hibridação eficaz para a região mínima complementar do RNA alvo.
  3. Adicionar 5-10 unidades de ARNase H para o tubo e incubar à temperatura ambiente durante 1 h para clivar o ARN do ARN: ADN híbrido. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,7 mL; Este exemplo contém os complexos RNP capturados de interesse.
    NOTA: Dependendo da acessibilidade do ARN cognato, dois ou mais ciclos de tratamento com RNase H podem ser úteis para aumentar a abundância da amostra para as análises a jusante.
  4. Usar 20% do eluato de uma transferência de Western de proteínas associadas conhecidas e 20% do eluído para isolamento do ARN seguida por RT qPCR. Os restantes 60% pode ser usado para a espectrometria de massa para identificar ou componentes proteicos.
  5. Em paralelo, submeter-se uma alíquota do lisado celular reservada para isolamento de ARN e a análise de RT-PCR. este assessment fornece uma indicação do enriquecimento de ARN dentro de um complexo de RNP.
    NOTA: Utilize a preparação proteína isolada em um western blot controle para verificar que a clivagem RNase H foi eficaz na liberação da RNP do complexo immunuoprecipitated.

5. Proteína Análise Eletroforese e Western Blot

  1. Objecto de aproximadamente 10-20% do total da amostra de SDS-PAGE e análise de imunotransf erência de acordo com protocolo padrão de laboratório.
    NOTA: Este passo serve para validar a eficiência e especificidade de IP antes da análise do RNA a jusante. Ele também pode ser usado para avaliar a composição de proteína do complexo RNP isolado.

6. Coleta do RNA imunoprecipitadas

NOTA: O isolamento de RNA pode ser feito pelo método de Trizol ou seguindo o protocolo descrito.

  1. Ressuspender metade do total da amostra em 750 ul de reagente de ácido tiocianato de guanidina e incubar a sala temperatura durante 5 minutos antes da extracção do ARN a partir dos complexos de RNP PCE-capturados.
  2. Adicionar 200 ul de clorofórmio a de o tubo, agitar vigorosamente durante 10 segundos, e incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
  3. Após centrifugação a 16000 xg durante 15 min a 4 ° C, recolher a fase aquosa para um tubo novo e adicionar um volume igual de isopropanol. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. Adicionar 1 ml de azul-glicol para a amostra e armazená-lo a -20 ° C no congelador por precipitação ou de processamento eficiente em uma data futura.
  4. Centrifuga-se o tubo a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante, de modo a não perturbar o sedimento de ARN; a utilização de uma ponta de micropipeta P-200 é recomendado para facilitar este processo.
  5. Adicionar 500 ul de etanol a 75% a cada tubo, vórtice, e centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante como no passo 6.4. Ar-secar o sedimento durante 2-3 min e ressuspender em 100 mL de água isenta de RNase.
    NOTA: Não prolongar o tempo o ar-pelota seca, a fim de evitar um problema com a ressuspensão.
  6. Adicionar 100 ul de amostra de ARN a uma coluna de ARN de limpeza. Processá-lo usando o protocolo do fabricante. Eluir o RNA em 30 mL de água livre de RNase e armazenar a -80 ° C por até 3 meses.
    NOTA: Este RNA isolado é adequado para análise de jusante por RT-PCR em tempo real (qPCR), microarray, e seqüenciamento RNA. Dependendo da abundância do RNP e a eficiência com a qual a RNP de interesse é isolado, o mesmo lisado pode ser submetido a dois ou mais ciclos de IP para gerar ARN suficiente aplicável para as análises a jusante.

A transcrição reversa de ARN e 7. A amplificação do ADNc por PCR

  1. Submeter o ARN isolado a transcrição reversa por um iniciador aleatório com uma transcriptase reversa de alta qualidade (RT), de acordo com a manufainstruções do cturer.
  2. Para amplificar o ARN de interesse, conceber um iniciador anti-sentido específico para o gene dentro da sequência de clivagem com ribonuclease H. Use quantidades semelhantes de o oligonucleótido anti-sentido, um iniciador aleatório, ou um iniciador oligo-dT (Ver Tabela Materiais).
    NOTA: O iniciador oligo-dT e o ARNm poli-adenilada proporcionar reacções de controlo positivo para as reacções de RT-PCR.
  3. Reserva 5% da reacção de RT (1 ul) para um qPCR preparativa feito em conjunto com o controlo negativo lisado-IP e amostras de DNA de controlo positivo para definir o ponto de corte e produzir uma curva padrão. Se o valor CT do qPCR preparativa está além do alcance da curva padrão, diluir a reacção RT no consecutivos 1: diluições 5 e repita o passo 7.2.
    NOTA: Para um seqüenciamento RNA e técnica de espectrometria de massa, consulte o arquivo método complementar. Por favor clique aqui to ver este arquivo método complementar. (Botão direito do mouse para baixar).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultados RIP anteriores identificaram RNAs gag retrovirais e selecionados RNAs celulares que co-precipitado com DHX9 / RHA, incluindo HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, não publicado). O retroviral 5 'UTR foi demonstrada para co-precipitar com DHX9 / RHA no núcleo e para a co-isolar no citoplasma em polirribossomas. Ela é definida exclusivamente como a cis actuando elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 6. Para isolar os comple...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O isolamento RNP e estratégia de identificação RNA cognate aqui descrito é um meio seletivo de investigar a interacção RNA-proteína específica e de descobrir proteínas candidatas co-regulação de um RNP específica em células.

A vantagem de utilizar clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos para isolar RNP é a capacidade para capturar e analisar especificamente o elemento que actua em cis de ARN RNP sobre RNP heterogéneos ligados a jusante do elemento de ARN actuam em cis de in...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem o apoio pelo NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

2

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dynabeads Proteína AInvitrogen10002D
Dynabeads Proteína GInvitrogen10004D
Anti-FLAG anticorpoSigmaF3165
Anti-FLAGSigmaF7425
Anti-RHA anticorpoVaxronPA-001
TRizol LS reagenteTecnologia devida10296-028
RNase HAmbionAM2292
ClorofórmioFisher ScientificBP1145-1
IsopropanolFisher ScientificBP26184
RNaeasy coluna de limpezaQiagen74204
Omniscript transcriptase reversaQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
Coquetel inibidor de proteaseRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GlicerolFisher Scientific17904
Primers hexâmeros aleatóriosInvitrogenN8080127
Oligo-dT primersInvitrogen
Primers de PCRIDTPrimers específicos para o gene para 
Oligonucleotídeo de amplificação de PCR para clivagem mediada por RNase HIDTPrimer anti-sentido para RNA alvo
TripsinaGibco Tecnologia de vida25300-054
Meio de cultura de tecidos DMEMTecnologia de vida GibcoTecnologia 11965-092
Soro bovino fetalTecnologia de vida Gibco Tecnologia10082-147
Base TrisFisher ScientificBP152-5
Cloreto de sódioFisher ScientificS642-212
Cloreto de magnésioFisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
SacaroseFisher ScientificBP220-212
Membrana de nitroceluloseBio-Rad1620112
Suporte magnéticoTubo de microcentrífuga de 1,7 ml segurando
CapuzPara cultura de tecidos animais
IncubadoraPara cultura de tecidos animais
Aparelhode proteínas Separação de amostras de proteínas
AparelhoTransferência de amostras de proteínas
Pronto para uso géis de proteína (4-15%)Separação de amostras de proteína
CentrífugaPellet abaixo do
rotadorMisture a amostra de ponta a ponta
VortexMisture as amostras
AM5730G laminar CO de gel de transferência de proteínas de mesa de mesa de amostra

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

RNA ImmunoprecipitationRNP IsolationFLAG tagged ProteinMagnetic Bead ConjugationCytoplasmic Lysate PreparationRNase H TreatmentRNA ExtractionWestern Blot AnalysisRT PCR Validation

Artigos relacionados