Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

Summary

Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.

Abstract

A pele é essencial para a nossa sobrevivência. A camada epidérmica exterior consiste da epiderme interfolicular, que é um epitélio escamoso estratificado que cobrem a maior parte do nosso corpo, e apêndices epidérmicos, como os folículos pilosos e glândulas sudoríparas. A epiderme é submetido a regeneração e ao longo da vida em resposta a lesão. Isso é ativado por K14-expressando populações / células progenitoras-tronco epidérmicas basais que são fortemente regulados por múltiplos mecanismos reguladores ativos dentro da epiderme e entre epiderme e derme. Este artigo descreve um método simples para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteína K14, Ki67 rotulados células em proliferação, Nile Red marcado sebócitos e rotulagem nuclear DAPI em resolução de uma única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa e quantificação da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados. O protocolo cúbica é the melhor método disponível no momento para investigar as interações moleculares e celulares em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula.

Introduction

A pele é essencial para a nossa sobrevivência. É composto por três camadas principais, a epiderme exterior, a derme e hipoderme. A epiderme é um tecido altamente regenerativa. É um epitélio escamoso estratificado, que consiste principalmente de queratinócitos. Queratinócitos nascem na camada basal, e mover-se para cima através das camadas suprabasais diferenciando, e, eventualmente, eles são eliminados na camada córnea exterior cerca de um mês após o seu nascimento. A epiderme se desenvolve uma série de apêndices, incluindo os folículos pilosos e glândulas sebáceas. Os folículos pilosos também regenerar de forma cíclica ao longo da vida ^1. A capacidade de regeneração da epiderme é activado pela presença de células estaminais e progenitoras que estão localizados na camada basal da epiderme e folículo capilar interfoliculares ^2.

Muitas das vias de sinalização têm sido implicados no desenvolvimento e regeneração epidérmica. Alguns destes ocorrem dentroapenas a epiderme, tais como a via hedgehog. Outros eventos de sinalização ocorrem entre derme e epiderme ^3. Por exemplo, os sinais de Wnt da derme são considerados como sendo importantes para o desenvolvimento do folículo de cabelo, e que são segregadas por a papila dérmica no início da fase anágena para activar a proliferação de células estaminais / progenitoras do folículo de cabelo e crescimento protuberância folículo piloso ^4. É importante compreender os mecanismos celulares e moleculares que controlam o desenvolvimento epidérmica e regeneração para entender melhor como eles podem ser perturbado na doença de pele regenerativa, como câncer de pele.

Este artigo descreve um lear C, U nobstructed B chuva Eu cocktails maging e C análise omputational protocolo de ^5-7 (cúbico) para esclarecer preparações para a pele de montagem integrais, e visualizar os padrões de expressão de proteína em 3 dimensões com resolução de uma única célula por microscopia confocal. O método envolve a imersão de CUBIC peletecido em dois cocktails químicos à base de aminoálcool. Estas soluções ajustar os índices de refracção da amostra da pele, deixando o tecido transparente e as proteínas intactas, permitindo a imunodetecção de resolução de célula única.

Usando este protocolo cúbicos, a proliferação basal e populações de queratinócitos na epiderme interfoliculares e no folículo de cabelo foram fotografadas em biópsias de pele de espessura total de ratinhos de tipo selvagem utilizando anticorpos anti-Keratin14 (K14) e anticorpos anti-Ki67. As glândulas sebáceas em biópsias de pele de tipo selvagem também foram visualizados usando Nile Red coloração. Por último, as populações de queratinócitos basais em tipo selvagem e biópsias de pele YAP2-5SA-Sc hiperplásicos foram comparados ^8.

Este protocolo permite CUBIC avaliação visual da expressão da proteína em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula, e é uma ferramenta importante para apreciar a anatomia da epiderme e defeitos morfológicos na pele de organismos geneticamente modificadosratos, e investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento da epiderme e regeneração.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) em UNSW Austrália sob protocolo aprovado ACEC 13 / 64B.

1. Preparação da Transparente tecido da pele do rato

Nota: Todos os ratos utilizados neste estudo eram de um C57BL / 6 fundo genético

1. Coleção de tecido da pele do rato.
   1. Humanamente eutanásia os ratos por deslocamento cervical.
   2. Remova cuidadosamente os pêlos da área relevante pele com um cuidar trimmer não ferir a pele.
   3. Lavar a pele para descontaminar com etanol 70% em tampão fosfato salino (PBS).
   4. Levante a pele do pescoço dorsal com uma pinça e fazer a incisão com uma tesoura.
   5. Dissecar uma grande área de pele do rato dorsal (aproximadamente 1,5 x 4 cm).
   6. Achatar pele derme-lado para baixo em um papel de filtro, e anote a orientação anterior-posterior da amostra.
   7. tripapel m de filtro em torno da pele dissecada, e coloque em um tubo de 15 ml cheio com recém-preparados paraformaldeído a 4% solução (PFA) em PBS.
   8. Fix durante 1 h à temperatura ambiente, ou durante a noite no frigorífico a 4 ° C.
   9. Lavar a pele 2 x 5 min em PBS em um tubo de 15 ml.
      Nota: O seguinte (1.1.10 - 1.1.12) são passos opcionais para armazenamento a longo prazo do tecido.
   10. Desidratar pele dissecados em PBS com o aumento da concentração de etanol (25%, 50%, 70%) num tubo de 15 ml durante os passos de lavagem de 1-hora à temperatura ambiente.
   11. Armazenar pele desidratadas em etanol a 70% em PBS num tubo de 15 ml a 4 ° C até uso posterior.
   12. 4 horas antes da limpeza, re-hidratar o tecido da pele em PBS com a diminuição da concentração de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) num tubo de 15 ml durante os passos de lavagem de 1-hora à temperatura ambiente.
2. Limpando as biópsias da pele do rato
   1. Preparar a solução de compensação CUBIC1 por dissolução de 3,85 g de ureia e 3,85 g de N, N, N ', N'tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina em 5,38 ml de água destilada em um aquecedor definido para 60 - 70 ° C. Use um agitador quente.
   2. Adicionar 2,31 g de polietileno-glicol mono-p-isooctylphenyl éter / Triton X-100 à solução, uma vez que é clara e foi arrefecida até à temperatura ambiente.
   3. Cortar a pele do rato com uma lâmina afiada em biópsias de dimensões aproximadas de 0,2 x 0,5 cm, e submergir em 5 ml de solução CUBIC1 clareira em um tubo de 15 ml. Para optimizar a visualização de folículos de cabelo, assegurar que o lado mais longo da biópsia é cortada ao longo da direcção ântero-posterior da amostra.
   4. Colocar numa plataforma rotativa num forno de hibridação a 37 ° C.
   5. Mudar a solução de compensação após 7 dias. Preparar solução fresca CUBIC1 antes da utilização.
   6. Verifique a transparência do tecido após 7 dias. Se necessário, deixe biópsias em solução compensação CUBIC1 até que o tecido é completamente transparente.
   7. Uma vez que a biópsia da pele é transparente,remover a solução CUBIC1, e adicionar 4 ml de 1 x PBS para lavar o tecido 4 vezes durante 6 h a 37 ° C.
   8. Lavar o tecido da pele em 20% w / v de sacarose em PBS num tubo de 15 ml durante 4 h a 37 ° C.
   9. Congelar o tecido em forma de montagem Composto temperatura óptima de corte (OCT) num tubo de 15 ml durante a noite num congelador a -80 ° C.
      Nota: Este passo irá aumentar a permeabilidade da biópsia para a penetração do anticorpo em passos subsequentes.

2. Imunofluorescência Coloração

1. Descongelar o tecido de 1.2.9) à temperatura ambiente durante 2-3 h.
2. tecido de lavagem no tubo de 15 ml com 5 ml de PBS durante 8 horas à temperatura ambiente para remover outubro Composto.
3. Transferência de biópsias para um tubo de 2 ml, e incuba-se o tecido em 1 ml de coelho anti-Keratin14 ou anticorpo anti-Ki67 de coelho, ambos diluídos 1: 100 em PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) durante 3 dias num agitador numa 37 multidão.
4. biópsias transferência para um tubo de 15 ml, umaND lavar o tecido 4 vezes durante 6 horas em 5 mL de PBST num agitador num forno de 37 ° C.
5. Transferência de biópsias para um tubo de 2 mL, mais 1 ml de coelho anti-Alexa594 anticorpo secundário diluído 1: 100 em PBST e incubar 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C.
6. Transferência de biópsias para um tubo de 15 mL e lavar tecidos 4 vezes durante 6 horas em 5 mL de PBST num agitador num forno de 37 ° C.
7. Transferência de biópsias para um tubo de 2 mL, adicionar 1 ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) solução contracoloração nuclear (1: 1000) em PBST e incubar durante a noite num agitador num forno de 37 ° C.
8. Remover solução contracoloração DAPI, e adicionar 1 ml de PBST para o tubo de 2 mL para lavar o tecido 4 vezes durante 6 horas num agitador num forno de 37 ° C.
   Nota: Passo opcional: Biopsias pode ser armazenada no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida de sódio durante pelo menos 3 semanas.

3. Coloração Vermelho do Nilo

1. Dissolve-se pó de Vermelho do Nilo em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 1 mg / ml
2. Adicionar uma solução de Vermelho do Nilo ul de 1 ml de PBS a uma concentração final de 1 ug / ml.
3. Descongelar o tecido a partir de 1.2.9) à temperatura ambiente durante 2-3 h, e lavar com 5 ml de PBS durante 8 horas à temperatura ambiente.
4. Transferir biópsias para um tubo de 2 mL, e submergir o tecido em 1 ml de solução corante Vermelho do Nilo durante 2,5 horas à temperatura ambiente.
5. Lavam-se as biópsias de pele em tubo 2 ml com 1 ml de PBST 4 vezes durante 30 min à temperatura ambiente.
6. Remoção da solução de PBST a partir do tubo de 2 mL, mais 1 ml de solução DAPI contracoloração nuclear (1: 1000) em PBST e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
7. Remover solução contracoloração DAPI, e adicionar 1 ml de PBST no tubo de 2 mL para lavar o tecido da pele 4 vezes durante 6 horas à temperatura ambiente.
   Nota: Passo opcional: Biopsias pode ser armazenada no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida de sódio durante pelo menos 3 semanas.

4. Criação de Imagens

1. Preparar a solução CUBIC2 compensação, que contém 50% De sacarose, 25% (w / v) de ureia, 10% (v / w) (w / v) de 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, e 0,1% (v / v) de Triton X-100.
2. Incubar o tecido da pele em 1 ml de solução CUBIC2 num tubo de 2 mL num agitador durante 24 horas num forno a 37 ° C. Este passo irá igualar o índice de refracção do tecido.
3. Verifique a clareza do tecido. Uma vez que é claro, posicionar toda a biópsia de pele (0,2 x 0,5 cm) no seu lado mais longo para uma lamela de vidro, de tal modo que a direcção do comprimento dos folículos pilosos é paralelo à superfície da lamela (# 1 24 x 60 mm)
   Nota: Passo opcional: biópsias Anticorpo-coradas podem ser guardadas em solução CUBIC2 durante cerca de 7 dias. biópsias Vermelho do Nilo-coradas só podem ser armazenados em solução CUBIC2 para até 1 dia, e deve ser trabalhada o mais rapidamente possível.
4. Prepare câmara de imagem (Figura 1)
   Nota: consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são: azul aderência, massa de modelar ou similar, e 2 lamelas (24 x 50 mm) (Figura 1A).
   1. Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro cerca de 1 mm x 2 cm), e duas lamelas (Figura 1B).
   2. Coloque aderência tiras azuis em um deslizamento de cobertura, permitindo espaço suficiente para biópsia da pele (Figura 1C). 4.4.3)
   3. Coloque biópsia da pele em tiras entre a lamela em uma gota de solução CUBIC2 (Figura 1C).
   4. Cubra biópsia da pele com a segunda lamela (Figura 1D).
5. Coloque a câmara de imagem com a biópsia da pele montada na plataforma de um microscópio confocal e mover o tecido para a via de luz.
6. Digitalizar a amostra usando uma fonte de luz de mercúrio ou de halogéneo e filtros de epifluorescência padrão (por exemplo, DAPI / GFP / CY3 / Cy5) para identificar regiões fluorescente manchadas de interesse.
7. Regiões imagem de interesse usando uma objetiva de 10X e 20X (NA 0,75) e técnicas padrão de imagem confocal de fluorescência (ex., Com DAPI manchado amostras iluminar com um laser de 405 nm e recolher sinal de fluorescência entre 425-475 nm, e com Alexa Fluor 594 ou amostras Nile manchado de vermelho iluminar com um laser de 561 nm e recolher sinal de fluorescência entre 570-620 nm).
8. Gerar imagem Z-pilhas de cada região de interesse usando microscópio Z-stack software de aquisição de imagem (por exemplo., Utilizando elementos NIS imaging software 4,13, conforme descrito abaixo).
   1. Garantir potência do laser ideal e PMT HV / Offset configurações foram selecionadas para recolher fluorescência da amostra.
   2. Abra a barra de ferramentas "ND Aquisição" de "Controles de Aquisição".
   3. Selecione a aba "Configuração série Z" (garantir que todas as outras abas são desmarcados).
   4. Durante a digitalização ao vivo, o foco para o topo da amostra e pressione o botão "Top".
   5. Concentre-se para a parte inferior da amostra e pressione o botão "Bottom".
   6. Input tamanho necessário passo (ou pressione otimizado botão de tamanho do passo).
   7. Préss "Executar agora".
   8. Salve Z-stacks resultante como pilhas de imagens TIFF individuais (1 fluorocromo por imagem Z-stack).
9. Use imagem Z-pilhas para reconstruir as regiões volume 3D de interesse usando o software de análise 3D (por exemplo., Usando Imaris x64 7.2.3 conforme descrito abaixo).
   1. Inicie o software de análise.
   2. Escolha o botão "Ultrapasse" na barra de ferramentas para a geração de volume 3D.
   3. Abrir primeira imagem colorida Z-stack (por exemplo., DAPI).
   4. Use o "adicionar canal 'ferramenta para adicionar canais de cores adicionais, um canal por fluorocromo. Assim, uma amostra contendo tanto DAPI e fluorocromos Alexa Fluor 594 irá requerer dois canais.
   5. Use o "Propriedades da imagem" ferramenta para definir as dimensões de pixel correta (voxel) (XYZ), conforme determinado no ponto 4.7 acima.
   6. Use a ferramenta de "Display de ajuste" para alterar as cores de canal, conforme necessário (por exemplo, ajustar o canal DAPI para azul, Alexa Fluor 594 canal a vermelho).
   7. para posição do volume 3D na janela de imagem, use o mouse para clicar e arrastar o volume conforme necessário.
   8. Use a ferramenta "Snapshot" na barra de ferramentas para gerar capturas de ecrã da imagem em 3D.
   9. Use a ferramenta "Animação" na barra de ferramentas para gerar filmes de rotação da amostra 3D.

Results

Espessura dorsal biopsias completas de pele de ratinhos de tipo selvagem adultos foram esclarecidas, coradas com uma ligação de queratinócitos basais marcador Keratin14 (K14) de anticorpo, e os núcleos foram contrastadas com solução de coloração de DAPI (Figura 2 e um filme).

Núcleos DAPI-positivos eram visíveis em toda a amostra (Figura 2A, C), e K14 coloração era visível exclusivamente na camada basal de espessura de uma célula da epiderme...

Discussion

Os mecanismos reguladores que controlam o desenvolvimento de pele e homeostase são mais comumente estudada em 2D usando o seccionamento de tecidos e coloração histológica ou rotulagem com anticorpos, que permite apenas uma apreciação restrito da morfologia da pele, populações de células ou a expressão da proteína. Um número de métodos foram desenvolvidos para melhorar a visualização da organização espacial das células e proteínas com uma resolução de uma única célula em 3 dimensões em peças inteiras epidérmicas ^10-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6418
Etanol 96% (não desnaturado)	Chem-supply	UN1170
Nile Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-hidroxipropil) etilenodiamina	Merck Millipore	821940
Polietilenoglicol mono-p-isooctilfenil éter	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT)	Anticorpo anti-Queratina14 Tecido-Tek	4583
	Anticorpo anti-Ki67 Covance	PRB-155P
	Abcam	ab16667
Burro anti-coelho Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650
Ureia	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-nitrilotrietanol	Merck Millipore	137002
Microscópio Confocal	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Microscópio Confocal
cruZer6 Face Trimmer	Braun Braun	cruZer6 Face
Azida de sódio	Sigma-Aldrich