Artigo de método

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

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DOI:

10.3791/54410

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5 de outubro de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve a aplicação de metabolômica irrelevantes, transcriptomics e análise estatística multivariada para transcrições baga da uva e metabolitos, a fim de ter uma visão sobre o conceito terroir, ou seja, o impacto do meio ambiente sobre características de qualidade de baga.

Resumo

Terroir refere-se à combinação de fatores ambientais que afetam as características das culturas como videira (Vitis vinifera) de acordo com determinados habitats e práticas de gestão. Este artigo mostra como certos assinaturas terroir pode ser detectado no metaboloma baga e transcriptoma do Corvina videira cultivar utilizando análise estatística multivariada. O método requer primeiro um plano de amostragem adequada. Neste estudo de caso, um clone específico da cultivar Corvina foi selecionado para minimizar as diferenças genéticas, e amostras foram coletadas em sete vinhas representando três diferentes macro-regiões durante as três estações de crescimento diferentes. Uma abordagem não segmentados metabolômica LC-MS é recomendado devido à sua alta sensibilidade, acompanhado de processamento de dados eficiente usando software MZmine e uma estratégia de identificação metabólito com base na análise da árvore de fragmentação. análise de transcriptoma global pode ser conseguido usando microarrayscontendo sondas cobrindo ~ 99% de todos os genes de videira preditos, permitindo a análise simultânea de todos os genes expressos diferencialmente no contexto de diferentes terrenos de. Finalmente, a análise de dados multivariados com base em métodos de projecção pode ser utilizado para ultrapassar o efeito forte específico da vindima, permitindo que os dados e metabolômicas transcriptômica a ser integrados e analisados ​​em pormenor, para identificar as correlações informativos.

Introdução

análise de dados em larga escala com base nos genomas, transcriptomes, proteomas e metabolomes de plantas oferece uma visão sem precedentes sobre o comportamento de sistemas complexos, tais como as características terroir do vinho que refletem as interações entre plantas de videira e seu ambiente. Porque o terroir de um vinho pode ser diferente, mesmo quando clones de videira idênticos são cultivadas em vinhedos diferentes, a análise genômica é de pouca utilidade, porque os genomas clonais são idênticos. Em vez disso, é necessário olhar para as correlações entre a expressão do gene e as propriedades metabólicas das bagas, que determinam os traços de vinho de qualidade. A análise da expressão do gene ao nível dos benefícios transcriptoma de as propriedades químicas semelhantes de todos os transcritos, o que facilita a análise quantitativa por exploração das características universais, tais como hibridação com sondas imobilizadas em microarrays. Em contraste, os métodos analíticos universais em proteômica umnd metabolômica são mais difíceis por causa da enorme diversidade física e química de proteínas e metabólitos individuais. No caso de metabolômica esta diversidade é ainda mais extrema, porque metabólitos individuais diferem muito em tamanho, polaridade, abundância e volatilidade, de forma que nenhum processo de extração única ou método analítico oferece uma abordagem holística.

Entre as plataformas de análise adequados para os metabolitos não voláteis, os baseados em cromatografia líquida de alto desempenho acoplada a espectrometria de massa (HPLC-MS) são muito mais sensíveis do que as alternativas, tais como a CLER com raios ultravioleta ou de diodos detectores de matriz (HPLC-UV, HPLC-DAD ) ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), mas a análise quantitativa por meio de HPLC-MS pode ser influenciado por fenómenos tais como o efeito da matriz e de supressão de iões / realce 1-3. A investigação de tais efeitos durante a análise dos bagos de uva Corvina por HPLC-MS usando uma fonte de ionização electrospray (HPLC-ESI-MS), mostrou que os açúcares e outras moléculas com as menores tempos de retenção foram fortemente subestimada, provavelmente reflectindo também o grande número de moléculas nesta zona, e que a abundância de outras moléculas pode ser subestimada, excessivas ou afectada pelo efeito matriz , mas a normalização de dados para o efeito de matriz parecia ter impacto limitado sobre o resultado de 4,5 global. O método aqui descrito é otimizado para a análise dos metabolitos média polaridade que se acumulam em níveis elevados em bagos de uva durante a maturação e que são significativamente impactados pelo terroir. Eles incluem antocianinas, flavonóis, flavan-3-ols, procianidinas, outros flavonóides, resveratrol, estilbenos, ácidos hidroxicinâmico e ácidos hidroxibenzóico, que, juntos, determinam a cor, sabor e propriedades relacionadas com a saúde de vinhos. Outros metabolitos, tais como os açúcares e os ácidos orgânicos alifáticos, são ignorados porque a quantificação por meio de HPLC-MS não é fiável devido à matriz effect e supressão de íons fenômenos 5. Dentro da gama de polaridade seleccionada por este método, a abordagem é não segmentado em que visa detectar como muitos metabolitos diferentes quanto possível 6.

Transcriptomics métodos que permitem que milhares de transcritos de videira para ser monitorizada simultaneamente são facilitado pela disponibilidade da sequência do genoma completo videira 7,8. métodos transcriptômica início com base em high-throughput seqüenciamento de cDNA evoluíram com o advento do sequenciamento de última geração em um conjunto de procedimentos descritos coletivamente como a tecnologia de RNA-Seq. Esta abordagem está se tornando rapidamente o método de escolha para estudos transcriptômica. No entanto, um grande corpo de literatura com base no micro-arranjo, o que permite milhares de transcritos para ser quantificada em paralelo por hibridização, tem acumulado para vinha. Na verdade, antes de RNA-Seq tornou-se uma tecnologia mainstream, muitas plataformas de microarrays comerciais dedicados tinha sidodesenvolvido permitindo transcriptoma vinha a ser inspeccionado em grande detalhe. Entre a grande variedade de plataformas, apenas dois permitiu a análise do transcriptoma do genoma 9. A matriz mais evoluído permitiu a hibridização de cerca de 12 amostras independentes de um único dispositivo, reduzindo assim os custos de cada experiência. As 12 sub-matrizes cada um composto 135.000 sondas 60-mer representando 29,549 transcrições de videira. Este dispositivo foi usado em um grande número de estudos 10-24. Estas duas plataformas já foram interrompidas, mas um novo microarray personalizado foi recentemente concebido e representa um desenvolvimento mais recente, já que contém um número ainda maior de sondas que representam genes de videira recém-descobertos mais 25.

Os conjuntos de dados de grande venda produzidas por transcriptomics e metabolômica análise requer métodos estatísticos adequados para a análise de dados, incluindo técnicas de análise multivariada para determinar correlações entre forma diferentes de dados. As técnicas de análise multivariada mais utilizados são aqueles com base em projeção, e estes podem ser sem supervisão, tais como análise de componentes principais (PCA), ou supervisionado, como projeção ortogonal bidirecional com estruturas latentes análise discriminante (O2PLS-DA) 26. O protocolo apresentado neste artigo utiliza PCA para análise exploratória de dados e O2PLS-DA para identificar diferenças entre grupos de amostras.

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Protocolo

1. Selecione os materiais apropriados e construir um plano de amostragem

  1. Comece a experiência através do desenvolvimento de um plano de amostragem adequada. Não há uma abordagem genérica e universal, de modo avaliar cada plano numa base caso-a-caso. Certifique-se de que o plano de amostragem indica os locais de amostragem, horários e o procedimento de amostragem precisa. Veja a Figura 1 para o plano de amostragem utilizado neste estudo de caso.
    NOTA: Neste estudo de caso, bagas de uva de um único clone (. Vitis vinifera cv Corvina, clone 48) foram coletadas de sete vinhedos comerciais em três diferentes macro-regiões da província de Verona (Lago de Garda, Valpolicella e Soave). As principais características de cada vinhedo estão resumidos na Tabela 1. Bagas foram coletados durante três estações de crescimento (2006, 2007 e 2008) em três momentos, correspondendo a veraison (o início da maturação), em meados de maturação e frutos maduros.
    1. Para cada um dos acessos (Vineyard / ano / estádio de maturação), colheita de 30 conjuntos de diferentes posições ao longo de duas linhas de videira, com alturas e locais na planta randomizados.
    2. Selecione três bagas aleatoriamente de cada cluster, evitando aqueles com danos e / ou sinais de infecção visível.
    3. Repita os passos 1.1.1 e 1.1.2 para obter três piscinas independentes.
    4. Deseed as bagas e congelar o pericarpo imediatamente em azoto líquido.
    5. Esmagar 10 bagas congeladas de cada piscina com um moedor moinho automático e dividir cada amostra em pó em duas partes iguais, uma para análise transcriptomics e um para análise metabolômica.
    6. Armazenar o pó a -80 ° C.
SOU BA BM CS FA MN PM
Macrozona Soave lago Garda Valpolicella lago Garda Valpolicella Valpolicella Soave
Altura (m) 250 120 450 100 130 250 130
rootstock 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
direcção da fila ai credo NS ai credo ai credo ai credo NS NS
sistema de formação Sistema de sobrecarga (Pergola) Sistema de sobrecarga (Pergola) Vertical Tiro Positioning (Guyot) Sistema de sobrecarga (Pergola) Overhead System (Pergola) Vertical Tiro Positioning (Guyot) Vertical Tiro Positioning (Guyot)
tipo de solo argiloso barro Argila barro argila Loam marga silt argiloso
Layout de plantio (m) 3.20 x 1.00 4.50 x 0.80 4.00 x 1.25 3.50 x 1.20 3,50 x 0,75 2.80 x 1.00 1,80 x 0,80
Total de cal% 3.9 19.3 18,3 14,4 31 5.9 27,9
Ativo cal% 0,5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
Areia % 15 47 66 42 29 13 36
marga% 43 36 21 37 39 67 36
Argila % 42 17 13 21 32 20 28
O pH do solo 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
Substância orgânica (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
Fósforo trocável (mg / kg) 26 73 73 68 48 47 64
Potássio trocável (mg / kg) 190 376 620 230 168 154 126
Magnésio trocável (mg / kg) 272 468 848 623 294 293 183
Cálcio trocável (mg / kg) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
Berry açúcares redutores 2006 211,25 ± 1,20 176,20 ± 0,42 187,40 ± 0,00 203,70 ± 1,13 212,55 ± 0,64 195,20 ± 0,00 211,65 ± 0,64
Berry açúcares redutores 2007 190,00 ± 1,27 165,25 ± 0,49 153,00 ± 0,42 203,60 ± 0,71 210,90 ± 0,71 192,25 ± 0,64 188,70 ± 1,84
Berry açúcares redutores 2008 191,35 ± 0,64 178,90 ± 0,57 170,05 ± 0,49 205,15 ± 1,48 188,70 ± 0,57 169,35 ± 0,49 108,05 ± 1,06
Berry pH 2006 3,01 ± 0,01 2,96 ± 0,01 2,84 ± 0,00 2,9 ± 0,00 2,98 ± 0,00 3,02 ± 0,00 3,06 ± 0,01
Berry pH 2007 2,97 ± 0,00 3,00 ± 0,00 2,74 ± 0,00 3,07 ± 0,01 2,98 ± 0,00 2,87 ± 0,01 3,09 ± 0,00
Berry pH 2008 2,83 ± 0,00 3,04 ± 0,01 2,71 ± 0,00 2,98 ± 0,01 2,98 ± 0,00 2,82 ± 0,00 3,11 ± 0,00
colheita Data 2006 2007 2008
Veraison 8-Aug 18-Jul 12-Ago
mid amadurecimento 4-Sep 8-Aug 2-Sep
Maduro 18-Sep 29-Ago 23-Sep

Tabela 1: Principais características de cada vinhedo ecolheita de amostras datas. m = metros, EW = Coma-Oeste, NS = Norte-Sul.
figure-protocol-1
Figura 1:. Representação esquemática do procedimento de amostragem Os três produção de vinho macro-zonas estão localizadas nos arredores da cidade de Verona, região de Veneto, na Itália. Os três pontos de tempo são veraison (V), que representa o início do amadurecimento na viticultura,-meados de maturação (MR) e frutos maduros (R). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Prepare Berry em pó Extractos, Analisar os metabolitos e processar os dados

  1. Preparar as amostras Berry em pó para análise.
    1. Prepara-se os extractos metabólicas das amostras baga à temperatura ambiente em três volumes (w / v) de metanol acidificado com 0,1% (v / v) duranteácido mic num banho de ultra-sons a 40 kHz durante 15 min. Use água LC-MS-grau e ácido fórmico, e metanol de grau HPLC.
    2. Centrifugar os extractos a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    3. Dilui-se o sobrenadante a partir do passo 2.1.2 em dois volumes (v / v) de água desionizada e passar através de um filtro de 0,2? M.
  2. Analisar os Berry Extractos por HPLC-ESI-MS.
    1. Configure o sistema de HPLC-ESI-MS de acordo com as recomendações do fornecedor.
      NOTA: Neste estudo de caso, a configuração composta por um sistema de HPLC equipado com um amostrador automático, conectado em linha com um espectrômetro de massa ion trap e fonte de ionização electrospray.
    2. Ligar o sistema de HPLC com uma coluna de guarda C18 (7,5 x 2,1 mm2) e uma coluna de fase reversa C18 (150 x 2,1 mm2, o tamanho de partícula 3 um).
    3. Preparar os solventes utilizados como a fase móvel. Use 5% (v / v) de acetonitrilo, 0,5% (v / v) de ácido fórmico em água, como solvente A e 100% acetonitrilo como solvent B. Utilização acetonitrilo-MS-LC grau, água e ácido fórmico.
    4. Executar a separação por HPLC com um gradiente linear de eluentes A e B a um caudal constante de 0,2 ml min -1 utilizando um volume de injecção de amostra de 30 ul.
      1. Inicialmente, equilibrar a coluna com 100% de solvente A. A seguir à injecção da amostra, estabelecer um gradiente de 0% a 10% de Solvente B em 5 min, de 10% a 20% de solvente B em 20 min, de 20% a 25% de Solvente B em 5 min, e desde 25% a 70% de solvente B em 15 min.
      2. Analisar cada amostra em duplicado. Randomize análise da amostra para evitar efeitos orientada por instrumentos. Permitir que 20 minutos para re-equilibração com 100% de solvente A entre cada análise.
    5. Adquirir espectros de massa nos modos de ionização negativas e positivas alternadas. Para os resultados descritos neste estudo de caso, defina os parâmetros como na Tabela 2. O ajuste preciso da máquina depende da plataforma específica.
      NOTA: Como alternativa, use outro naipemétodos capazes de acordo com a plataforma específica.
      1. Em todos os casos, como com qualquer plataforma de separação, certifique-se de usar um tempo de re-equilíbrio adequado, a fim de ter retenção de reprodutibilidade tempo. Quando o número de amostras é elevado (acima de dez amostras), analisá-los em lotes de amostras de 9-10, com os programas de limpeza de coluna cromatográfica (gradientes lentos entre os dois solventes de eluição) entre cada lote. Para ter suficiente reprodutibilidade tempo de retenção, garantir que a primeira análise cromatográfica de cada lote é uma análise em branco (ou seja, a análise do solvente).
    6. Também adquirir espectros de massa em fragmentados modos de íons negativos e positivos a definição das opções de fragmentação (dois precursores íon, MS 3). Anotar os metabolitos por análise da árvore de fragmentação (MS / MS e MS 3) de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Este é particularmente adequado para os metabolitos de plantas porque são muitas vezes glicosilada, terapntes a primeira fragmentação (MS / MS) tende a remover as porções de açúcar, deixando o ião aglicona livre, e subsequente fragmentação (MS 3) ajuda a identificar a aglicona contra uma biblioteca de padrões autênticos.
    7. Adquirir MS / MS e MS 3 espectros no intervalo de razões m / z 50-1,500 com uma amplitude de fragmentação de um V. Em alternativa, utilizar outros métodos adequados de acordo com a plataforma específica.
    8. Para cada sinal de m / z, comparar o MS / MS e MS 3 padrões de fragmentação e tempos de retenção para o autêntico biblioteca de padrões de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Muitos tipo de plataformas incluem software para construir este tipo de biblioteca através da análise de padrões autênticos. Isto deve identificar muitos dos sinais, mas nem todos os sinais serão anotados.
    9. Para os sinais anônimos restantes, comparar os MS / MS e MS padrões 3 de fragmentação com os publicados na literatura, searching para valores de m / z (ou seja, dígito "m / z 353" para procurar publicações em que as moléculas com essa m / z são mencionados) com qualquer um dos motores de busca comum livremente disponíveis, ou usar bancos de dados on-line, tais como MassBank (www .massbank.jp / en / database.html) e do metaboloma humano Banco de Dados (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Componentes espectrômetro de massa Função parâmetros
Ionização por Electrospray Fonte nebulizador Gas 50 psi, a 350 ° C
gás de secagem 10 L min -1
Ion trap e detector digitalização Modo de varredura completa, 13.000 m / z por segundo, range 50-1,500 m / z
Massa alvo 400 m / z
colisão Gas Hélio
pressão de vácuo 1,4 x 10 -5 mbar
fonte capilar 4000 V
Placa final compensado -500 V
escumadeira -40 V
saída Cap -121 V
01 de outubro DC -12 V
02 de outubro DC -1,7 V
Lens 1 +5 V
Lens 2 +60 V
ICC para o modo de ionização positiva 20.000
ICC para o modo de ionização negativa 7.000

Tabela 2: conjunto de parâmetros principal para a aquisição de espectros de massa.

Operação Seleção Função parâmetros valores
A detecção de picos detecção de massa centróide Nível de ruído 3.500
construtor cromatograma Ponto mais alto de dados min intervalo de tempo 0,15
min altura 4.000
m / z tolerância 0,3
A detecção de picos deconvolução Peak Pesquisa mínimo local limite cromatográfica 70
Pesquisa mínimo na gama de RT (min) 00:50
altura relativa mínima 15%
altura mínima absoluta 4.000
rácio min do pico superior / edge 2
faixa Duração (min) 0-10
isótopos picos isotópicos garoupa - m / z tolerância 1.2
tolerância RT 00:50
forma monótona Não
A carga máxima 3
isótopo representante Não
Alinhamento Junte-alinhador - m / z tolerância 1.2
Peso para m / z 10
Tempo de retenção tolerância 00:50
Peso para RT 5
Exigir mesmo estado de carga Não
Exigir mesmo ID Não
Compare padrão isótopo Não
preenchimento de lacunas localizador pico - tolerância intensidade 20%
m / z tolerância 0,9
Tempo de retenção tolerância 00:40
correção RT Não
filtragem Duplicar filtro Peak - m / z tolerância 1.2
tolerância RT 00:30
Exigir mesma identificação Não

Tabela 3: fluxo de trabalho Mzmine com valores específicos para processar os ficheiros de dados dos bagos de uva negativos de LC-MS.

  1. Processar os dados de LC-MS.
    1. de acesso oubaixar um pacote de software de processamento de dados que pode extrair a informação relevante a partir de muitas matérias-cromatogramas e construir uma matriz de dados, em que cada metabolito detectado é quantificada em cada amostra.
      NOTA: Os passos do Protocolo abaixo são adaptados para o v2.14 MZmine software de código aberto (http://mzmine.sourceforge.net). É um software de código aberto para processamento de dados espectrometria de massa, com o foco principal nos dados de LC-MS. 27
    2. Transformar os dados de cromatogramas LC-MS para o formato netCDF usando o software fornecido pelo fabricante do equipamento. Para os resultados descritos aqui, utilizar a v5.2 Bruker Daltonics Esquire e softwares v3.2 análise de dados e executar passos de acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: Podem ser utilizados outros conversores (vários conversores de livre-ware estão disponíveis).
    3. Importe os arquivos .cdf no software.
    4. Implementar os procedimentos de filtragem de detecção de pico, alinhamento, preenchimento de lacunas e de pico com a PARAMETERS relatada na Tabela 3.
      1. Como primeiro passo, selecione um arquivo .cdf importado, em seguida, ir para a visualização → TIC / XIC Visualizer. Coloque o cursor sobre a base do pico mais baixo do cromatograma e tomar nota sobre o sinal mínimo de intensidade do ião de base. Então vá para Raw Métodos Dados → Detecção de Pico.
      2. Selecione Detecção de Massa e preencha o nível de sinal para detectar íons individuais para cada varredura e criar uma lista de íons.
        NOTA: Verifique o algoritmo antes de realizar a detecção de massa - que depende do espectrômetro de massa. No nosso caso, nós selecionamos Centróide.
      3. Selecione Cromatograma Builder e encher com o nível de sinal para conectar os pontos de dados a partir da lista de iões e construir um cromatograma para cada valor de massa. Veja os parâmetros especificados no manual do espectrômetro de massa para ajustar o Min Intervalo de Tempo e tolerância m / z.
      4. Em seguida, vá para o pico Lista Métodos → Peak Detection → Cromatograma Deconvolução. Selecione o algoritmo apropriado (neste caso Local Search Mínimo) para permitir a separação de cada cromatograma em picos individuais.
      5. inspecionar manualmente os cromatogramas para descobrir os valores apropriados para os parâmetros a seguir. Definir o limite cromatográfica a 30% para remover o ruído e Search mínima na RT Range para 2 (min) para identificar a presença de moradores mínimos para discriminar dois picos.
      6. Conjunto mínimo Altura Relativa em 2,0. inspeccionar manualmente o cromatograma para identificar a altura absoluta mínima de sinal que corresponde a um pico e não ao fundo; definir esse valor como altura absoluta (por exemplo, 10.000 no experimento apresentado).
      7. Definir Rácio Min do Pico Top / Edge 1.1 afirmar a relação mínima entre o topo e as mais baixas intensidades de pontos de dados de um pico a ser reconhecido como um verdadeiro pico.
      8. inspecionar manualmente os cromatogramas para ver qual é a duração mínima dos vários picos na Chromat usadoographic condições (por exemplo, entre 0,2 e 2 min, dependendo do composto, nas experiências apresentadas), e, por conseguinte, utilizar estes valores como Pico Duração Intervalo (min) para definir a gama de comprimento de pico aceitável como duração.
      9. Então vá para Peak Lista Métodos → Isótopos → isotópica Peaks Grouper para agrupar os isótopos, em um pico, geralmente na mais intensa. Nota: Os parâmetros dependem da resolução do espectrómetro de massa e a reprodutibilidade dos tempos de retenção.
      10. Finalmente, vá para Peak Lista Métodos → Alinhamento → Junte-alinhador para alinhar picos em função da sua m / z e retenção de tempo usando uma pontuação jogo.
    5. Depois de alinhar os picos, preencher eventuais lacunas de dados, clicando em Peak Lista Métodos → Gap enchimento → Peak Finder. Finalmente, filtro de duplicar pontos de dados clicando no pico Lista Métodos → Filtragem → duplicado filtro Peak.
    6. Exportar o conjunto de dados resultante como um .csv arquivo.
    7. Alterar manualmente a. Extensão CSV para uma extensão txt.. Se há extensões de arquivo são visíveis, alterar as configurações do computador para revelar extensões de arquivo. Vá para File Explorer Opções → Ver → Configurações Avançadas e desmarque a caixa "Ocultar as extensões dos tipos de arquivo conhecidos".
    8. Importe os arquivos .txt em uma planilha. Isto produz uma matriz de dados em que todos os metabolitos detectados, reconhecidos por um número de identificação do tempo, m / z valor e de retenção, são quantificadas em todas as amostras em termos de seus valores de área de pico.

3. Prepare Berry Extractos pó para análise de transcriptoma e processar os dados

  1. Extrair RNA total das amostras Berry e determinar a qualidade RNA.
    1. Extrair o ARN total a partir de amostras de baga.
      NOTA: Neste estudo de caso, um kit proprietária e um procedimento modificado que garante a completa remoção de moléculas que a InterFere com a análise de ARN, tais como polissacáridos e polifenóis, foram usadas. As instruções abaixo são específicos para este kit 18.
      1. Pesar 400 mg de pó de baga para cada amostra, dividi-lo em duas partes e colocar 200 mg cada um em dois tubos de microcentrífuga.
      2. Adicionar 900 ul da solução de lise contendo β-mercaptoetanol (fornecido no kit) para cada 200 mg de pó e imediatamente vortex e vigorosamente durante pelo menos 30 seg. Aquece-se a amostra a 56 ° C durante 5 min com agitação a 800 rpm.
      3. Centrifugar as amostras a uma velocidade máxima numa microcentrifuga de bancada durante 10 min para sedimentar os detritos celulares.
      4. Pipetar 700 l de sobrenadante na coluna de filtração fornecido no kit (anel retentor azul) encaixado num tubo de recolha de 2 ml. Feche o tampão e centrifugação à velocidade máxima numa microcentrifuga de bancada durante 1 min para remover detritos residuais. Repetir este passo duas vezes utilizando a mesma coluna de filtração, mas um tubo de recolha de fresco, resultando em três tUBEs cada uma contendo ~ 700 mL do lisado clarificado.
      5. Pipeta de 750 ml de solução de ligação (fornecido no kit) em cada tubo de ligado clarificado e misture imediatamente pipetando cima e para baixo pelo menos cinco vezes. Transferir 700 ul desta mistura para a coluna de ligação fornecido no kit (anel retentor vermelho) encaixado num tubo de recolha de 2 ml. Feche a tampa e centrifugação à velocidade máxima numa microcentrífuga de bancada durante 1 minuto para ligar a RNA.
      6. Decantar a fração flow-through, inverter o tubo de coleta e toque brevemente em uma almofada limpa de papel absorvente para drenar o líquido residual.
      7. Retorno da coluna para o tubo de recolha e pipetar a mistura remanescente na mesma coluna e repetir a centrifugação e passos de decantação. Repetir até que toda a mistura foi filtrada para a mesma coluna de ligação vermelho.
      8. Agora siga as instruções restantes do kit e elui-se o ARN em tampão de eluição de 50 ul (fornecido no kit) e armazenar iT-se a -80 ° C prontas para as etapas de controlo de qualidade.
    2. Determinar a quantidade e a pureza do RNA utilizando um espectrofotómetro. Registam-se os índices de absorvância que revelam o grau de contaminação com proteínas (A) 260/280 e polifenóis / polissacarídeos (A) 260/230.
      NOTA: RNA adequado para hibridação microarray deve marcar pelo menos 1,8 para ambos os rácios.
    3. Determinar a integridade do ARN.
      NOTA: Vários sistemas podem ser usados. Um adquirente digital que executa uma corrida de electroforese capilar em combinação com um corante fluorescente foi utilizado neste estudo de caso. ARN adequado para hibridação microarray deve ter uma integridade de ARN Número (NIR) de pelo menos 8.
  2. Prepare amostras e hibridizar o RNA a um Microarray personalizado.
    1. Definir a quantidade de partida de ARN total para análise de micro-arranjo a 200 ng por diluição da solução de ARN obtida no passo 3.1.1.8 com água isenta de RNase desionizada. Adicione oquantidade apropriada de ARN a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml num volume final de 1,5 mL.
    2. Adicionar 2 mL de mistura diluída pico para cada amostra de RNA e seguir as instruções do fabricante para sintetizar ADNc de primeira cadeia, transcrever isso em ARNc e rotular o ARNc com 3CTP cianina.
    3. Purifica-se o ARNc marcado de acordo com as instruções do fabricante e elui-se em 30 de água isenta de RNase ul.
    4. Determinar o rendimento e a actividade específica de cada ARNc gravando-se três valores em um espectrofotómetro: cianina 3 concentração de corante (pmol mL -1), pureza de ARN (A 260/280) e de concentração de cRNA (ng mL -1). Use as fórmulas encontradas no manual de instruções do fabricante para calcular o rendimento de ARNc (ug) e a actividade específica (pmol Cy3 por cRNA ug).
      NOTA: Recomenda rendimentos e actividades específicas diferem em função do formato de microarray específico. Neste estudo de caso um formato 44K 4-pack foiescolhida, o rendimento recomendada foi de 1,65 e a actividade específica foi de 9.
    5. Projetar o microarray personalizado utilizando um software adequado para o projeto da sonda.
      1. Para os resultados descritos neste estudo de caso, prepare uma nova microarray costume, projetado sobre o formato 44K 4-pack usando um aplicativo baseado na Web para projetos de microarray personalizado e bibliotecas de oligonucleotídeos. Sondas de design para combinar 34,651 transcrições alvo, incluindo 29.971 previu transcrições da matriz V1 Pinot noir, 4.500 novos loci identificados na cultivar Pinot por Corvina reconstrução transcriptoma e 180 genes Corvina privadas 25.
        NOTA: Este envolveu a produção de 34,651 sondas específicas 60-mer, compreendendo 29.798 Pinot noir previu transcrições, 4.392 novos loci Pinot e 179 genes Corvina privadas.
    6. Prepare o conjunto de hibridação com base em especificações de formato 4-pack como segue.
      1. Coloque 1,65 ug de ARNc marcado com Cy3 em um volume final de 41,8mL de água livre de RNase deionizada. Adicionar 11 ul de agente de bloqueio de 10x e 25x 2,2 ul tampão de fragmentação. Incubar a 60 ° C durante 30 minutos em um banho termostático de um fragmento de ARN. Imediatamente fresco no gelo por 1min.
      2. Finalmente, adicionar 55 ul de 2x tampão de hibridização, misturar bem por pipetagem e centrifugação durante 1 min a 15.500 x g à temperatura ambiente. Prontamente colocar o tubo de microcentrifugadora em gelo. Utilizar imediatamente, não armazená-lo.
    7. Carregar o microarray personalizado como segue.
      1. Coloque um slide junta com a etiqueta virada para cima na base de uma câmara de hibridação. carregar lentamente 100 ul de amostra de hibridação obtidos no passo 3.2.6.2 para cada junta assim, a distribuição do líquido com a ponta da pipeta, evitando bolhas.
      2. Lentamente, coloque o microarray personalizado voltado para baixo, garantindo que o código de barras numérico é voltado para cima. Certifique-se que o par sanduíche é devidamente alinhados. Finalmente coloque a tampa da câmara de hibridação para o ensanduichadalâminas e mão-apertar a braçadeira para a câmara. Girar a câmara montada para avaliar a mobilidade de bolhas.
    8. Coloque câmara de corrediça montada num espeto rotativo num forno de hibridação ajustado para 65 ° C. Defina o rotator a rodar a 10 rpm. Permitir a hibridação a prosseguir durante 17 horas.
    9. Prosseguir com a lavagem de microarray slides como se segue.
      1. Em primeiro lugar, preparar três pratos à coloração de slides e enchê-los com os tampões de lavagem apropriadas: 2 pratos com tampão de lavagem 1 a RT e 1 prato com pré-aquecido (37 ° C) tampão de lavagem 2.
      2. Desmonte a câmara de hibridação e remova o sanduíche. Com o código de barras numérico microarray corrediça voltada para cima, submergir o sanduíche para o primeiro prato deslizante de coloração com um tampão de lavagem à RT e, com a ajuda de fórceps limpas, separar a junta da corrediça microarray. Transferir rapidamente o slide microarray em um porta-lâminas e colocá-lo no segundo prato slide-coloração encheu-se com tampão de lavagem 1à TA.
      3. Coloque o prato deslizante coloração sobre um agitador magnético e lave 1 min, com agitação moderada. Transferir rapidamente o porta-lâminas para o terceiro prato de coloração de slides enchido com pré-aquecido (37 ° C) Tampão de Lavagem 2 e lave 1 min, com agitação moderada.
      4. Remova lentamente o suporte do prato-coloração slide e retire cuidadosamente o slide do rack, evitando gotículas.
        NOTA: Não adicionar Triton X-102 para os tampões de lavagem e omitir a etapa de lavagem acetonitrilo.
    10. Armazenar o chip lavado no escuro à temperatura ambiente.
  3. Digitalizar o Microarray e extrair as principais características.
    1. Coloque o slide microarray em um scanner apropriado e digitalizar cada matriz usando as configurações dos parâmetros recomendados no manual de instruções do fabricante do microarray. Para os resultados descritos aqui, colocar cada slide microarray em um suporte de slides para facilitar o processo de digitalização.
    2. Importar a saída .shpficheiro de um software adequado que é capaz de converter um sinal digital em valores numéricos fluorescentes. Verificar o relatório de controlo da qualidade para assegurar que o processo de hibridação foi bem-sucedida.
      1. Para os resultados descritos aqui, use as configurações dos parâmetros recomendados no manual de instruções do software de extração de características e inspecionar o relatório de controle de qualidade para garantir que os parâmetros listados na Tabela 4 estão dentro da faixa normal dada pelo fabricante.
Nome Metric Limite superior Limite inferior Descrição
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 N / D Percentual de recursos que são apresentam valores atípicos não-uniformidade em qualquer canal
Limite de detecção 2,00 0,10 média mais 1 desvio padrão dos ins do ponto abaixo do intervalo de concentração linear
absGE1E1aSlope 1.20 0,90 Absoluto de inclinação de ajuste de sinal em função da concentração de sondas E1a
MedCVProcSignal 8,00 N / D % CV mediana para o sinal processado
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10,00 Média de fundo subtraído do sinal de todos os controles negativos inlier (BGSubSignal é calculado subtraindo um valor chamado BGUsed do recurso sinal de dizer)
gNegCtrlAveNetSig 40,00 N / D Médio do sinal líquido de todos os controlos negativos inlier
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 N / D desvio padrão defundo sinais de todos os controlos negativos inlier subtraído
gNonCntrlMedCVProcSignal 8,00 N / D % CV mediana para o sinal processado das sondas não-controle
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 N / D Residual de fundo detrending ajuste

Tabela 4: parâmetros principais a ser verificado para verificar a qualidade da hibridização microarray.

  1. Processar os dados de Microarray.
    1. Uma vez que todos os slides microarray foram digitalizados e o controle de qualidade foi avaliado positivamente, preparar uma matriz de dados delimitado por tabulação, selecionando os valores gProcessedSignal de cada arquivo de resultado single-subarray, representando as intensidades de fluorescência-prima de cada sonda.
    2. Em uma planilha, normalizar os dados sobre os percentil 75 dentro de cada array (valores de P) e calculComeram a média de todos os valores de p entre todos os diferentes sub-matrizes para calcular o rácio R.
    3. Em seguida, na mesma planilha, normalizar cada valor gProcessedSignal à razão R de seu próprio sub-array.

4. Cumprir a detalhada análise estatística dos Metabolomics e dados transcriptómica

  1. Prepare o Software Análise Estatística.
    NOTA: Neste estudo de caso, um software capaz de realizar PCA, foi usado PLS-DA e O2PLS-DA.
    1. Importe os metabolômica e dados transcriptômica. Vá em File → Projeto regular New → New Project regular para importar a matriz de dados obtida com software MZmine. Em seguida, clique em Editar → Transposição toda a matriz → Casa e atribuir o ID → Finish primário e secundário apropriado.
    2. Significa centralizar os dados e escalá-los usando a escala de Pareto. Na janela inicial, vá para Editar → M1 e mudar o parâme apropriadatros, dependendo dos dados. Para os resultados descritos aqui, mudar a escala da Unidade de desvio de Par.
    3. Escalar os dados transcriptômica usando a configuração Unidade de variância.
  2. Realizar a análise estatística multivariada.
    1. Implementar o PCA como mostrado na F igura 2. Neste estudo de caso, PCA revela as principais diferenças entre amostras, refletindo as diferentes fases de maturação e crescimento estações.
      1. Na janela Workset, selecione PCA-X como o tipo do modelo. Imprensa Autofit. Preste atenção ao R2X (cum) e Q2 (cum) valoriza como eles dão uma idéia sobre a qualidade do modelo.
        NOTA: Geralmente, quanto maior os valores melhor o modelo, mas modelos com muito alto R2X (cum) pode over-ajustar os dados. Como regra empírica, nós paramos de adição de componentes principais quando o valor Q2 (cum) começa a diminuir.
      2. Em seguida, selecione Scores → Scatter para ver a trama que mostra o possível agrupamento das amostras.
      3. Inspecione o PCAPontuação Plot. Se um bom modelo é obtido (Q2cum> 0,5), use as mesmas classes de amostras para construir um modelo O2PLS-DA (passo 4.2.2).
    2. Construir dois modelos O2PLS-DA, utilizando as amostras classificadas por macro-zona e validar os modelos usando um teste de permutação com 200 permutações.
      1. Atribuir as classes, indo para casa janela → Nova Como → M1 → Observações. Definir as classes desejadas. Em seguida, altere o tipo de modelo de PCA-X para O2PLS-DA. Imprensa Autofit. Certifique-se de que o número de componentes do modelo PLS-DA é a mesma que a do O2PLS-DA.
      2. Para validar o modelo O2PLS-DA, ir para Analisar CV-variância e ver o valor-p direita. Além disso, clique em Novo Como na janela Início → M2 e alterar o tipo de modelo de O2PLS-DA para PLS-DA. Imprensa Autofit.
      3. Ir para Analisar → permutações e prestar 200 permutações (de-seleccione a opção Recalcular permutações).
        Nota: O produto final apresenta uma janela em que o valor de R2 Should geralmente acertar o eixo Y em valores inferiores a 0,4, enquanto o Q2 deve bater a parte negativa do eixo Y. Se valores de R2 e / ou Q2 estão incorretas, reduzir o número de componentes tanto em modelos PLS-DA e O2PLS-DA.
      4. Prossiga para selecionar M2 na janela Projeto e clique em Índices → Scatter para ver a trama e a posição das classes de amostra. Para observar o que metabólitos caracterizar um ou mais específicos aulas, ir para Traçar / lista → Scatter.
      5. Alterar Selecionar tipo de dados a observações e Cargas → Adicionar Series e modificar o item no eixo X e série em pq (corr) e Pred Comp em 1 e 2 ou mais componentes quando presente, respectivamente.
      6. Com o botão direito do mouse pressionado sobre o enredo, ir para a Propriedade → Cor e selecione por Termos de distinguir os símbolos da trama entre moléculas e classes. Vá para Layout → Format Plot → Axis e / ou estilos para modificar o lote com as características desejadas.
    3. Com base nos resultados das análises metabolômicas O2PLS-DA, apresentam diferenças nos níveis relativos de metabolitos específicos ou classes de metabolitos como histogramas.
    4. Com base nos resultados da análise transcriptômica O2PLS-DA, recuperar e atribuir genes diferencialmente modulados com Gene ontologia (GO) Classificações 28.
    5. Identificar relações entre os níveis de metabolitos e expressão do gene manualmente.

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Resultados

O estudo de caso descrito neste artigo resultou em uma matriz de dados final com 552 sinais (m / z recursos), incluindo iões moleculares mais seus isótopos, adutos e alguns fragmentos, relativamente quantificados entre 189 amostras (7 vinhas x 3 estádios de maturação x 3 períodos de crescimento x 3 repetições biológicas). O número total de pontos de dados foi, portanto, 104.328. A análise da árvore fragmentação resultou na anotação de 282 características m / z, correspo...

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Discussão

Este artigo descreve os metabolômica, transcriptomics e protocolos de análise estatística utilizados para interpretar o conceito de terroir baga da uva. Metabolómica análise por meio de HPLC-ESI-MS é suficientemente sensível para detectar um grande número de metabolitos simultaneamente, mas a quantificação relativa é afectado pelo efeito da matriz e de iões de supressão / realce. No entanto, uma abordagem semelhante já foi usado para descrever o amadurecimento e fulminante pós-colheita de frutos Corvina, e a correção de...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho beneficiou das atividades de ligação em rede coordenadas no âmbito da AÇÃO COST FA1106 financiada pela UE "Uma abordagem de sistemas integrados para determinar os mecanismos de desenvolvimento que controlam a qualidade dos frutos carnudos em tomate e videira". Este trabalho foi apoiado pelo projeto «Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale», financiado pela Fundação CARIVERONA Bank, e pelo projeto «Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)», financiado pelo Ministério das Políticas Agrícolas e Florestais italiano. O SDS foi financiado pelo Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa FIRB RBFR13GHC5 projeto "A Plasticidade Epigenômica da Videira no Genótipo por Interações Ambientais".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Moedorde Moinho IKAIKA A11 amostrador
Beckman Coulter -System Gold 508 Autosampler
HPLC SystemBeckman Coulter -System Gold 127 Módulo de Solvente HPLC
C18 Guard ColumnGrace -Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μ m) Coluna de Guarda
C18 ColunaGrace -Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μ m)
Espectômetro de Massa em ColunaBruker Daltonics -Bruker Esquire 6000; O espectômetro de massa foi equipado com uma fonte ESI e o analisador era uma armadilha de íons.
Solventes de extração e tampões de HPLCSigma34966Metanol LC-MS grau
Sigma94318Ácido fórmico LC-MS grau
Sigma34967Acetonitrila LC-MS grau
Sigma39253Água  Filtros de
(0,2 μ m)Sartorius17764
Softwares para coleta de dados (a) e processamento (b)Bruker Daltonics-BrukerDaltonics Esquire 5.2 Controle (a); Esquire 3.2 Análise de Dados e MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kitSigma-AldrichSTRN250-1KTPara extrato total de RNA de pericarpos de uva
Nanodrop 1000Thermo Scientific1000
BioAnalyzer 2100Agilent TechnologiesG2939A
RNA 6000 Nano ReagentesAgilent Technologies5067-1511
Chips de RNAAgilent Technologies5067-1511
Agilent Tampão de Lavagem de Expressão Gênica 1Agilent Technologies5188-5325
Tampão de Lavagem de Expressão Gênica Agilent 2Agilent Technologies5188-5326
Kit de Rotulagem QuickAmp de Baixa Entrada One-ColorAgilent Technologies5190-2305
Kit RNA Spike In - One-ColorAgilent Tecnologias5188-5282
Kit de Hibridização de Expressão GênicaAgilent Technologies5188-5242
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104Para Purificação de cRNA
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer MicroarrayAgilent TechnologiesG2514F-048771 
eArrayAgilent Technologies-https://earray.chem.agilent.com/earray/
Lâminas de juntaAgilent TechnologiesG2534-60012Habilitar Agilent SurePrint Microarray 4-array Hibridização
Banho TermostáticoCâmara de Hibridização Julabo-Hybridization
Agilent TechnologiesG2534-60001
Forno de Hibridização de MicroarrayAgilent TechnologiesG2545A
Rack de Rotador de Forno de HibridizaçãoAgilent TechnologiesG2530-60029
Haste de Conversão de Rack de RotadorAgilent TechnologiesG2530-60030
Kit de coloraçãoBio-Optica10-2000Prato de coloração deslizante e rack de slides
Dispositivo de agitador magnéticoAREX Aquecedor Magnético Agitador MagnéticoF20540163 
Forno termostáticoThermo ScientificHeraeus - 6030
Agilent Microarray Scannerde scanner de G2565CAde Agilent Technologies
, 48 posiçõesAgilent TechnologiesG2505-60502
Suportes de slidesAgilent TechnologiesG2505-60525
Software de extração de recursos v11.5Agilent Tecnologiasdentro do scanner de microarray Agilent G2565CA
SIMCA + V13 SoftwareUmetrics
automático de HPLC básico seringa Minisart RC 4 de grau LC-MS Carrossel

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