Artigo de método

Síntese controlada e Fluorescência de rastreamento de Poly altamente uniforme ( N -isopropylacrylamide) microgéis

DOI:

10.3791/54419

⸱

8 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physical Chemistry, RWTH Aachen University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não agitada polimerização precipitação fornece uma abordagem de prototipagem rápida, reprodutível para a síntese de estímulos-Sensitive poli (N -isopropylacrylamide) microgéis de distribuição de tamanhos estreita. Nesta síntese protocolo, luz caracterização dispersão e rastreamento de partículas de fluorescência única dessas microg�s em uma configuração de microscopia de campo amplo são demonstrados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estímulos sensíveis poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microg�s têm várias aplicações práticas potenciais e usa na investigação fundamental. Neste trabalho, usamos única partícula de rastreamento microg�s PNIPAM de fluorescente etiquetado como uma vitrine para ajustar o tamanho da microgel por um procedimento de precipitação rápida polimerização não se mexeu. Esta abordagem é adequada para prototipagem novas composições e condições de reacção ou para aplicações que não necessitam de grandes quantidades de produto. síntese do microgel, tamanho de partícula e a determinação da estrutura por difusão de luz dinâmica e estática são detalhados no protocolo. Mostra-se que a adição de comonómeros funcionais pode ter uma grande influência sobre a nucleação e a estrutura das partículas. acompanhamento de uma única partícula por microscopia de fluorescência de campo amplo permite uma investigação sobre a difusão de microgéis tracer rotulados de uma matriz concentrada de microgéis não marcado, um sistema que não é facilmente investigado pelaoutros métodos, tais como dispersão de luz dinâmica.

Introdução

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Estímulos sensíveis poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microg�s 1,2 têm atraído o interesse contínuo sobre as últimas duas décadas devido ao seu potencial em várias aplicações inteligentes. Casos de uso demonstrados incluem estabilizadores comutáveis ​​emulsão 3-8, microlentes 9, substratos de cultura de células para facilitar a colheita de células 10,11 e transportadores inteligentes para compostos de baixo peso molecular e outros biomédica utiliza 12. De um ponto de pesquisa fundamental de vista estas partículas têm provado ser útil para investigar temas como interações coloidais 13-15 e interações polímero-solvente 16-18.

O uso bem sucedido de microgéis PNIPAM e seus derivados em qualquer dada aplicação, tipicamente requer o conhecimento sobre o tamanho de partícula médio e a largura da distribuição de tamanho de partícula. Para a correta interpretação dos resultados experimentais envolvendo PNIPAM microgeles, a estrutura da partícula, que pode ser afectada por comonómeros funcionais, tem de ser conhecida. Estática e dinâmica de espalhamento de luz (DLS e SLS, respectivamente) são excepcionalmente adequado para adquirir esta informação porque esses métodos são rápidos e relativamente fácil de usar; e eles sondar as propriedades de partícula de forma não invasiva no seu ambiente nativo (dispersão). DLS e SLS também coletar dados de grande número de partículas evitando o viés decorrente de pequenos tamanhos de amostra, típicos para métodos de microscopia. Portanto, o primeiro objetivo deste trabalho é apresentar boas práticas em matéria de dispersão de luz para os profissionais novos para a caracterização coloidal.

Tipicamente, a precipitação a polimerização é realizada em escala laboratorial e encontrando as condições de reacção adequadas para as propriedades específicas de partículas pode ser trabalhoso e requerem muitas repetições de síntese. Em contraste com a síntese do lote grande, a polimerização não é agitada precipitação 19,20 ARAPID procedimento no qual os lotes de composição reagente diferente pode ser polimerizado simultaneamente partículas rendimento de distribuição estreita de tamanhos. polimerização simultânea minimiza a variação experimental e grande produção significa que as condições de reação adequadas podem ser encontradas rápida para upscaling a reação. Por isso, o nosso objectivo é a segunda demonstrar a utilidade da polimerização não-precipitação agitada em prototipagem e em aplicações que não requerem uma grande quantidade de produto.

Diferentes aspectos da síntese e caracterização se reúnem no exemplo de aplicação da marcação fluorescente microgéis PNIPAM em investigação interacção coloidal. Aqui usamos rastreamento única partícula de alta precisão para investigar a difusão de microgéis tracer rotulados na dispersão de microgéis de matriz não marcados em uma ampla faixa de concentração da matriz e resolver o efeito gaiola em dispersão coloidal concentrado. microscopia de fluorescência de campo amplo é bem adequado for este propósito, uma vez que pode caracterizar o comportamento específico de algumas moléculas marcadoras entre um grande número de diferentes espécies potencialmente matriz. Isto está em contraste com técnicas tais como DLS, SLS e reologia, que medem as propriedades média do conjunto de sistemas e, portanto, não é possível resolver o comportamento de pequeno número de partículas de sonda num sistema de grande. Além disso, neste exemplo específico métodos de dispersão de luz convencionais não podem ser utilizados também, devido à alta concentração de partículas, o que leva a uma forte dispersão múltipla invalidando a análise standard. Uso de tratamento automatizado de dados e métodos estatísticos permitem a análise do comportamento do sistema geral também para rastreamento de uma única partícula, quando a média ao longo de grandes tamanhos de amostra.

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Protocolo

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1. Microgel Síntese

NOTA: -isopropylacrylamide N (NiPAM) foi recristalizado a partir de n-hexano. Outros reagentes foram utilizados como recebidos.

  1. Síntese descontínuos convencionais de poli (NiPAM) microgéis Matrix
    1. Dissolve-se 1,8 g de NiPAM e 24 mg de N, N '-bisacrylamide (BIS) em 245 ml de filtrado (0,2 um de celulose regenerada (RC) de filtro de membrana) de água bi-destilada em um 500 ml de três tubuladuras equipado balão de fundo redondo com um condensador de refluxo, um agitador e um septo de borracha.
    2. Inserir um termómetro e uma agulha 120 mm na entrada de azoto, através do septo.
    3. Aquece-se a solução a 60 ° C, enquanto se agitava. Desoxigena-se a solução por purga com azoto durante 40 min.
    4. Simultaneamente preparar uma solução de iniciador de persulfato de potássio 155 mg (KPS) em 5 ml de água filtrada bidestilada e bolha a solução com azoto para remover o oxigénio.
    5. Transfira os completos 5 ml KPS solução em uma seringa de azoto lavada equipada com uma agulha de 120 mm.
    6. Levantar a agulha de azoto acima do nível da solução no balão de três tubuladuras e adicionar a solução KPS rapidamente através do septo de borracha para dentro do reactor.
    7. Deixe a polimerização prosseguir durante 1 hora sob fluxo de azoto e agitação lenta a 60 ° C.
    8. Utilizando um funil de Buchner e o filtro de papel de filtrar a solução reaccional quente, a fim de desfazer agregados grandes. Deixe a dispersão arrefeça.
    9. Centrifugar a dispersão e redispersar três vezes durante 40 minutos a 257000 x g e finalmente redispersar o sedimento em uma quantidade mínima viável de água destilada duas vezes. Tipicamente, isto é 2-4 ml.
    10. Liofilizar a dispersão para o armazenamento.
  2. Não agitada Síntese de poli (NiPAM) microgéis marcado fluorescentemente
    1. Pesar 257,7 mg Nipam, 3,5 mg BIS, e 1,5 mg metacriloxietil tiocarbamo�o rodamina B (corante) em recipiente de vidro e adicione 10 ml de destilar dupla filtradaágua ed.
    2. Ultrasonicate a solução de corante-monómero durante 15 min para dissolver o corante na água.
    3. Preparar a mesma solução sem o corante para um recipiente de vidro separada.
    4. Prepare a várias diluições da solução de monómero com o corante utilizando a solução de monómero, sem o corante para se obter uma série de concentrações com várias concentrações de corantes. Neste trabalho, usar corante na gama de concentrações de 0,02-0,1 mmol / L.
    5. Dissolver 8,4 mg KPS em 10 ml de água filtrada duas vezes destilada, a fim de obter a solução de iniciador.
    6. Transferir 0,5 ml da série de concentrações e 0,5 ml da solução KPS a tubos de ensaio com 10 mm de diâmetro para obter as soluções de reacção finais e selá-los com septos de borracha.
    7. Pré-aqueça num banho de óleo num recipiente de vidro de parede dupla ligada a um circulador de aquecimento a 63 ° C.
    8. Deoxygenize as soluções de reacção por purga com azoto através de agulhas de 120 mm por 20 min.
    9. Inserir os tubos em afloating plataforma e mergulhe a plataforma para o banho de óleo pré-aquecido. Ajustar a temperatura para 60 ° C. Inicialmente, a temperatura mais elevada no banho é necessário que as soluções à temperatura ambiente arrefecer o banho. Para uma alta precisão de partícula tamanho de sintonia o controlo da temperatura durante a reacção inicial tem de ser rigorosa, tipicamente ± 0,1 ° C.
    10. Deixe que a reacção prossiga durante um tempo apropriado. Tipicamente 1 hora é suficiente.
    11. Transferir os tubos de reacção rápida para uma estufa a 60 ° C e colocar uma gota da dispersão quente para 10 ml de água destilada filtrada dupla pré-aquecido sobre o volume PNIPAM temperatura de transição de fase (VPTT, 32 -34 ° C) 1, para a caracterização de DLS na estado colapsado.
    12. Deixe o resto das dispersões de arrefecer até à temperatura ambiente e transferi-los para dentro de tubos de centrífuga.
    13. Centrifugar a solução três vezes durante 40 minutos a 257000 x g e diluir os microgéis, finalmente, em 2 ml de água destilada filtrada dupla foR utilização como partículas marcadoras.

2. Dispersão de Luz Caracterização

  1. Hidrodinâmica Radius Determinação no estado recolhido pela Dynamic dispersão de luz
    1. Lave cuvetes e copos com vapor de acetona.
    2. Calor 10 ml de água filtrada duas vezes destilada (por exemplo, 200 nm ou menor filtro RC) mais PNIPAM VPTT.
    3. Transferir uma gota de dispersão quente para a água filtrada usando uma agulha pré-aquecida (0,9 x 40 mm) e a seringa (1 ml).
    4. Temperar o DLS goniometer banho índice de jogo a 50 ° C e transferir a amostra para o aparelho sem deixá-lo esfriar.
    5. Encontrar o maior ângulo de dispersão onde a intensidade dispersa é suficiente para adquirir um correlogramas através da realização de medições de teste.
      1. Inserir a cuvete de amostra (tubo de vidro de 10 mm de diâmetro com 1 ml de dispersão de partículas). Mover o braço detector de ângulo de espalhamento pequeno (aqui 30 °).
      2. Verifique o perfil do feixe for espalhamento múltiplo: no brilho em torno do feixe primário, sem espalhamento múltiplo, etc. Verifique se a faixa de contagem é apropriado para a medição no ângulo de espalhamento menor (aproximadamente entre 30 e 600 kHz; canto superior direito da janela do software.).
      3. Mover o braço do goniômetro para o maior ângulo de espalhamento (escolher 120 ° aqui). Verificar que a taxa de contagem é ainda suficientemente elevada para a medição (entre 30 e 600 kHz). Se a intensidade é muito baixa, mover o braço para diminuir o ângulo de espalhamento.
    6. Verifique o feixe visualmente através do vidro banho de tolueno no ângulo de espalhamento menor, se brilho ao redor do feixe incidente é observado espalhamento múltiplo ocorre. Neste caso, reduzir a intensidade do laser ou usar uma maior diluição.
    7. Adquirir 20 correlogramas entre o ângulo de espalhamento mínimo e máximo (por exemplo, 30 ° - 140 °), com tempo mínimo de aquisição de 60 seg. Aumentar o tempo de aquisição de fraca intensidade grandes ângulos de espalhamentose necessário.
  2. Análise de Dados 37
    1. Calcular espalhamento magnitudes vector para o ângulo de dispersão de acordo com a figure-protocol-1 , Onde n é o índice de refracção da dispersão, figure-protocol-2 o comprimento de onda do laser e no vácuo figure-protocol-3 o ângulo de espalhamento.
    2. No caso de o software de medição proporciona a função de correlação de intensidade figure-protocol-4 , Transformá-lo em função de correlação campo elétrico figure-protocol-5 de acordo com figure-protocol-6 . Parâmetro figure-protocol-7 é um parâmetro fundamental desinteressante relacionada com o grau de coerência espacial da luz dispersa over área do detector.
    3. Realizar análise cumulant em correlogramas, ou seja, se encaixam polinômio de segunda ordem ao logaritmo de cada função de correlação campo elétrico figure-protocol-8 por mínimos quadrados lineares. figure-protocol-9 aparece como a intercepção da forma e seu valor exato não é importante no que diz respeito à análise de dados. Restringir o ajuste de um valor τ tempo de atraso significativo, por exemplo, de modo que a amplitude de correlação é de 10 - 20% da amplitude máxima. O coeficiente do primeiro termo de ordem é a taxa de decaimento médio da função de correlação, figure-protocol-10 .
    4. Encontre o valor mais provável para o coeficiente de difusão médio figure-protocol-11 das partículas por mínimos quadrados lineares caber em figure-protocol-12 . E sefigure-protocol-13 contra figure-protocol-14 não parece linear e percorrer a origem dentro do erro, a distribuição de tamanho de partícula é amplo e hidrodinâmico raio será mal definida.
    5. Calcular o raio hidrodinâmico de a relação de Stokes-Einstein figure-protocol-15 , onde figure-protocol-16 é o coeficiente de Boltzmann, figure-protocol-17 a temperatura absoluta e figure-protocol-18 a viscosidade da dispersão em figure-protocol-19 . Propagar o desvio padrão de figure-protocol-20 para figure-protocol-21 .
  3. Determinação Estrutura de partículas por dispersão de luz estática
    1. Lave cuvetes e copos com vapor de acetona. Use 20 mm de diâmetro ou maiores cuvetes para minimizar o efeito da lente cilíndrica.
    2. Filtro (200 nm, filtro RC ou menor) a cerca de 20 ml de água duplamente destilada para um frasco de vidro e transferir uma gota de dispersão purificado ao frasco. Lavar o filtro com 10 ml de água antes de o utilizar para a preparação da amostra para remover impurezas restantes do processo de fabrico.
    3. Verifique amostra contra qualquer fonte de luz ambiente. Se for observado azul de matiz, a amostra é susceptível de ser demasiado concentrada. Dilui-se em conformidade.
    4. Prepare a amostra de água de lavagem do fundo da cuvete várias vezes com água e filtrou-se em seguida encher-se o volume adequado da amostra, dependendo da cuvete e a posição do laser no instrumento. O laser tem de passar através da amostra sem ser refractada do menisco.
    5. Calibrar o instrument utilizando uma amostra de tolueno.
    6. Medir a dispersão de água (fundo) em toda a gama angular disponível.
    7. Medir a intensidade de dispersão da amostra em toda a gama angular disponível em vários comprimentos de onda de um modo preferido. O padrão de dispersão normalizados para a intensidade de dispersão para a frente é conhecido como o factor de forma.
    8. Se a estrutura da partícula é conhecido, use a expressão modelo adequado para calcular o ajuste global sobre os conjuntos de dados medidos em diferentes comprimentos de onda.
    9. Para uso estrutura da partícula desconhecida regularizada direta (como FitIt! 33) ou um inversa indireta mais geral transformada de Fourier 21,22 rotina em conjunto com deconvolução da função de distribuição par distância (apenas para partículas esféricas) 23,24 para a classificação aproximada de partículas digitar.
    10. No caso de a rotina de ajuste ou inversão fornece uma estimativa da função de distribuição de raio de partícula, calcular a polidispersidadeíndice (desvio-padrão da distribuição dividido por sua média).

3. Rastreamento de Partículas pelo Largo-campo microscopia de fluorescência

NOTA: Tracer e matriz de partículas de 465 ± 7 nm e 405 ± 7 nm raio hidrodinâmico a 20 ° C, respectivamente, foram usados ​​para o rastreamento de partícula.

  1. Preparação de amostra
    1. Prepare dispersão microgel matriz concentrada por redispersão quantidade conhecida de microgel sem rótulo liofilizado a quantidade conhecida de água bidestilada. Adicionar um volume pequeno de partículas marcadoras marcadas.
    2. Confirmar a concentração do traçador microgel apropriada no microscópio. A concentração óptima é um compromisso entre as aquisições simultâneas de número máximo de faixas, ao mesmo tempo que a concentração do traçador suficientemente baixo de modo que a probabilidade de que as faixas de traçador de partículas cruzada durante a aquisição é negligenciável.
    3. Preparar dispersões concentradas por evaporaçãoágua num forno. Determinar a concentração de peso por comparação ao peso da dispersão para o peso original da amostra antes da evaporação.
  2. Aquisição de Dados e Análise
    1. Usar uma lente objectiva adequado da ampliação desejada e a abertura para a excitação dos marcadores de fluorescência simultânea e recolha da amostra. Neste trabalho, use uma 100X / 1.3 NA imersão em óleo lente objetiva.
    2. Coloque a câmara de umidade sobre uma mesa xyz-piezo, que se encaixa em um microscópio comercial.
    3. Para evitar que a amostra de secagem, coloque um plasma limpo lamela de cobertura para dentro da câmara de humidade e pipeta de 10 uL de poli (NiPAM) dispersão da concentração desejada para o deslizamento.
    4. Dependendo da excitação e emissão de espectros de o corante fluorescente, utilizar um laser adequado para excitação e ajustar a potência de laser de forma adequada. A intensidade deve ser suficientemente baixa para evitar a fotodegradação rápida dos corantes, mas aao mesmo tempo forte o suficiente para o posicionamento preciso única partícula (ver abaixo). Neste trabalho, utilizar um laser de estado sólido bombeado-diodo 561 nm e manter constante a potência do laser a 16 mW (cerca de 0,5 kW cm-2 no exemplo) para todas as medições.
    5. Para obter a iluminação da amostra homogénea, utilize a configuração de iluminação crítica descrita aqui. Para isso, par o laser em uma fibra multimodo (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 mm de diâmetro do núcleo), agitar a fibra utilizando um agitador, a fim de temporalmente médios para fora manchas de laser, e projetar a fibra termina no plano da amostra.
    6. Calibrar a distância z a partir da reflexão de trás da lâmina de cobertura e se concentrar vários micrômetros na amostra movendo o objetivo ligeiramente para cima e corrigir o z-position usando um z-compensador. Isto evita quaisquer efeitos de interface com a lamela.
    7. Ajustar os parâmetros do detector, tais como o tempo de exposição, com a força do sinal de fluorescência. Neste caso, usar uma câmera EMCCDcom tempo de exposição de 0,1 segundos, o elétron de modo e ganho de 50 multiplicando.
    8. Adquirir vários filmes com o número apropriado de quadros para obter intervalo de tempo adequado para calcular o deslocamento quadrático médio dos microgéis em diferentes regiões da amostra. Neste trabalho, use aquisição números de quadro de 500 ou 1.000 quadros.
    9. Analisar os dados posicionando as partículas em cada quadro usando encaixe Gaussian 25 e usar um algoritmo de rastreamento de partícula apropriado 26 para obter o deslocamento quadrático médio. 27 Calcular os valores médios e desvio padrão pela média sobre todas as faixas em todos os filmes. Calcule as longas coeficientes de difusão tempo de atraso por meio de regressão linear de figure-protocol-22 , Onde figure-protocol-23 é o deslocamento quadrático médio, D o coeficiente de difusão média e τ o tempo de atraso.
    10. HusaImate o γ parâmetro anomalia da equação de difusão anômala figure-protocol-24 por transformação dos dados para escala logarítmica, obtendo-se figure-protocol-25 . O parâmetro anomalia figure-protocol-26 é dada pela derivada da trama. O derivado pode ser estimado pelas diferenças finitas dos pontos de dados, ou ajustando os pontos de dados por funções polinomiais e diferenciar analiticamente. Determinar o grau suficiente de as funções de ajuste polinomial plotando os resíduos em forma e norma residual para o aumento da ordem polinomial.
    11. Repetir o mesmo procedimento para as diferentes concentrações de matrizes de microgel.

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Resultados

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O número de partículas de microgel PNIPAM no lote e, assim, o volume de partículas final, é determinado no início da reacção, durante a fase de nucleação 20 Hidrofóbica metacriloxietil corante de co-monómero tiocarbamoilo rodamina B influencia a nucleação, reduzindo a densidade do número de partículas no lote. A diminuição da concentração de partículas para duas concentrações Nipam iniciais diferentes podem ser visto...

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Discussão

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A adição de pequenas quantidades de co-monómero funcional pode ter um efeito significativo sobre o tamanho das partículas e da estrutura dos microgéis PNIPAM derivado. Simultânea em pequena escala tubo de ensaio de polimerização é um bom método para contabilizar tais mudanças, e ajuda a localizar rapidamente as composições de reagentes adequados para o tamanho de partícula alvo para redimensionar o reacção conforme necessário. A massa da...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) é reconhecida pelo apoio financeiro no âmbito do Sonderforschungsbereich SFB 985 "Microgéis Funcionais e Sistemas de Microgel".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonaVWR ChemicalsKRAF13455
BisacrylamidAppliChemA3636
n-hexanoMerck104374
N-isopropilacrilamidaFisher ScientificAC412785000recristalizado a partir de n-hexano
Metacriloxietil tiocarbamoil rodamina BPolysciences23591
Peroxodissulfato de potássioMerck105091
Óleo de silicone 47 V 350VWR Chemicals83851
ToluenoSigma Aldrich244511
F12 Termostato refrigerado/aquecedorJulabo9116612
MicroscópioOlympusIX83
XY(Z) Sistema PiezoPhysik InstrumenteP-545.3R7
100X Objetiva de imersão em óleoOlympusUPLSAPO
QuadLine BeamsplitterAHF AnalysentechnikF68-556T
Cobolt Jive 150 laserCobolt0561-04-01-0150-300
Fibra multimodoThorlabsUM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD câmeraAndorDU-897U-CS0-BV
Goniômetro a laserSLS SystemtechnikMark III
CF40 Circulador criocompactoJulabo9400340
Sistema de goniômetro a laser ALV GmbHALV / CGS-8F
Corretor multi-tauALV GmbHALV-7004
Eletrônica de espalhamento de luzALV GmbHALV / LSE 5004
Módulo de contagem de fótonsPerkinElmerSPCM-CD29692 unidades em modo de pseudo-correlação cruzada
633 nm HeNe LaserJDS Uniphase1145P
F32 Refrigerado/aquecimento circuladorJulabo9312632

Referências

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