Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

Resumo

Apresentamos um protocolo para identificação e quantificação dos componentes em misturas de espécies que possuem proteínas semelhantes. A espectrometria de massa detecta peptídeos para identificação e fornece quantificação relativa por proporções de áreas de pico. Como alimento de ferramenta para detecção de fraudes, o método pode detectar 1% de cavalo na carne bovina.

Resumo

Descrevemos um protocolo simples para identificar e quantificar os dois componentes em misturas binárias de espécies que possuem uma ou mais proteínas semelhantes. Central para o método é a identificação de 'proteínas correspondentes' nas espécies de interesse, em outras palavras, proteínas que são nominalmente as mesmas, mas possuem diferenças de sequência específicas da espécie. Quando sujeitas a proteólise, as proteínas correspondentes darão origem a alguns peptídeos que são igualmente semelhantes, mas com variantes específicas da espécie. Estes são 'peptídeos correspondentes'. Peptídeos específicos de espécies podem ser usados como marcadores para determinação de espécies, enquanto pares de peptídeos correspondentes permitem a quantificação relativa de duas espécies em uma mistura. Os peptídeos são detectados usando espectrometria de massa de monitoramento de reação múltipla (MRM), uma técnica altamente específica que permite a determinação de espécies baseadas em peptídeos mesmo em sistemas complexos. Além disso, a proporção de áreas de pico de MRM derivadas de peptídeos correspondentes suporta quantificação relativa. Uma vez que as proteínas e peptídeos correspondentes irão, em geral, se comportar de maneira semelhante tanto no processamento quanto na extração experimental e preparação da amostra, a quantificação relativa deve permanecer comparativamente robusta. Além disso, essa abordagem não precisa dos padrões e calibrações exigidos pelos métodos de quantificação absoluta. O protocolo é descrito no contexto de carnes vermelhas, que possuem proteínas correspondentes convenientes na forma de suas respectivas mioglobinas. Esta aplicação é relevante para a detecção de fraude alimentar: o método pode detectar 1% peso por peso de carne de cavalo na carne bovina. A proteína correspondente, a quantificação relativa do peptídeo correspondente (CPCP) usando as proporções da área de pico do MRM fornece boas estimativas da composição peso por peso de uma mistura de cavalo e carne bovina.

Introdução

O escândalo europeu da carne de cavalo de 2013, no qual foi encontrada carne de cavalo não declarada em vários produtos de carne bovina de supermercado¹, destaca a necessidade de métodos de teste capazes de detectar e medir a fraude alimentar na carne. Várias tecnologias têm sido exploradas, especialmente ensaio imunoenzimático (ELISA) e métodos baseados em DNA². Uma rota alternativa, baseada em espectrometria de massa, tem como alvo peptídeos específicos da espécie que, por sua vez, surgem de proteínas específicas da espécie. Aqui, descrevemos uma dessas abordagens baseadas em peptídeos que oferece identificação e quantificação relativa das espécies adulterantes em uma mistura de carne³.

O protocolo é enquadrado no contexto de carnes vermelhas e o desejo de determinar a presença de uma na outra no nível de 1% em peso, o nível considerado por alguns como representando adulteração fraudulenta de alimentos em oposição à contaminação⁴. O método baseia-se, em primeira instância, na identificação de uma proteína que é nominalmente "a mesma" em todas as carnes-alvo. A mioglobina, proteína responsável pela cor vermelha da carne, é uma boa candidata, pois é abundante, relativamente tolerante ao calor e solúvel em água, e tem sido usada para determinação de espécies de carne anteriormente^5,6. As mioglobinas para carne bovina (Bos Taurus), suína (Sus scrofa), cavalo (Equus caballus) e cordeiro (Ovis aries)³, por exemplo, são nominalmente as mesmas, conforme necessário, mas suas sequências não são idênticas. Tais grupos de proteínas "semelhantes, mas diferentes", como essas quatro mioglobinas, podem ser convenientemente descritos como "proteínas correspondentes". As diferenças de sequência nessas quatro mioglobinas são específicas da espécie: por exemplo, as proteínas completas da mioglobina para carne bovina e equina, P02192 e P68082, respectivamente, cada uma compreende 154 aminoácidos com 18 diferenças de sequência entre os dois. Sujeitas à proteólise usando tripsina, essas proteínas produzem dois conjuntos de peptídeos, alguns dos quais são idênticos e outros que mostram uma ou mais diferenças de aminoácidos específicas da espécie: as proteínas correspondentes, portanto, dão origem a peptídeos correspondentes.

A abordagem CPCP, portanto, busca primeiro identificar proteínas de duas ou mais espécies onde essas proteínas exibem variantes de sequência específicas de espécies limitadas. Estas são proteínas correspondentes. Após a proteólise, as proteínas correspondentes dão origem a peptídeos, alguns dos quais também exibem variantes de sequência específicas da espécie herdadas da proteína original. Estes são peptídeos correspondentes. A abordagem CPCP pode ser usada para comparar os níveis de duas proteínas correspondentes em uma amostra de espécies mistas, monitorando os níveis de peptídeos correspondentes.

A tecnologia natural para a detecção de peptídeos conhecidos é a espectrometria de massa de monitoramento de reação múltipla, ou MRM-MS⁷. Peptídeos específicos da espécie produzem íons precursores, que, juntamente com seus íons fragmentos de espectrometria de massa, são facilmente discriminados com antecedência por ferramentas de software. Essas listas são então usadas para instruir o espectrômetro de massa a registrar apenas pares específicos de íons precursores e fragmentos, chamados de transições. Um peptídeo alvo específico é, portanto, identificado não apenas por seu tempo de retenção na cromatografia que precede o espectrômetro de massa, mas também por um conjunto de transições que compartilham um íon precursor comum. Este é um meio altamente seletivo de detectar peptídeos conhecidos que faz uso eficiente do recurso do espectrômetro de massa.

Outros autores usaram espectrometria de massa para testar a adulteração da carne por meio de marcadores peptídicos, mas de proteínas díspares^8-14. O uso do esquema de proteínas correspondentes, peptídeos correspondentes (CPCP), no entanto, significa que as condições experimentais podem ser otimizadas, auxiliando na identificação das espécies na mistura a partir de transições específicas de espécies conhecidas. Além disso, as proteínas e peptídeos correspondentes geralmente se comportam de maneira semelhante nos estágios de extração, proteólise e detecção. Como as áreas de pico de transição são quantitativas e reprodutíveis, as proporções de áreas de pico decorrentes de pares de peptídeos correspondentes de diferentes espécies fornecem uma estimativa direta das quantidades relativas de duas carnes em uma mistura. Em contraste, as rotas de quantificação mais tradicionais exploram calibrações baseadas em materiais de referência para estabelecer quantificação absoluta^14,15.

Embora o protocolo seja descrito no contexto da mioglobina e da carne, outras proteínas além da mioglobina podem ser usadas para identificação e quantificação relativa por meio da estratégia CPCP em misturas de carne, embora potencialmente com modificações no protocolo. Além disso, a estratégia também é aplicável a misturas binárias de outras espécies que compartilham uma ou mais proteínas correspondentes.

O ponto de partida para o protocolo é a mioglobina de 'referência' purificada, que para algumas espécies pode ser adquirida, mas que para outras deve ser preparada por cromatografia convencional de exclusão de tamanho. O procedimento para preparar a mioglobina de referência não está incluído no protocolo, mas é descrito em outro artigo³. As ferramentas de software¹⁶ são usadas para listar peptídeos candidatos e transições decorrentes de mioglobinas de interesse. Cada mioglobina de referência é submetida a proteólise e os peptídeos resultantes são analisados por espectrometria de massa em tandem de ionização por eletrospray por cromatografia líquida (LC-ESI-MS / MS) para descobrir quais dos íons precursores e transições candidatos são mais úteis e para determinar os tempos de retenção de peptídeos correspondentes. O resultado desta etapa é uma lista revisada de peptídeos-alvo com suas transições, adequada para determinação de espécies, e uma lista de pares de CPCP, adequada para quantificação relativa. Para testar carnes reais, extrações de amostras são preparadas e submetidas a proteólise para gerar peptídeos a partir da mioglobina e de outras proteínas estranhas. Os peptídeos baseados em mioglobina são então monitorados por LC-ESI-MS/MS com base em suas transições listadas. As espécies presentes em uma mistura são identificadas pelos picos de transição associados aos peptídeos marcadores. As estimativas das quantidades relativas de duas carnes em uma mistura binária são calculadas usando proporções de áreas de pico de transição. Um conjunto de misturas de pares de carnes de ensaio permitirá verificar e calibrar a relação entre as áreas dos picos de um determinado par de transições e a relação com as misturas reais.

Protocolo

1. A proteólise e Análise de Referência mioglobinas

1. A proteólise de referência mioglobinas
   1. Preparar soluções de referência as mioglobinas purificadas (intervalo de 0,2-0,5 mg / ml em bicarbonato de amónio 25 mM) ^3.
   2. Transferir alíquotas de 1 ml de cada amostra para tubos de centrífuga de 2 ml.
   3. Termicamente desnaturar as proteínas extraídas por aquecimento da amostra num bloco quente a 95 ° C durante 30 min. Arrefece-se a amostra durante aproximadamente 15 min, até atingir a temperatura ambiente. Adicionar 30 mg de ureia (concentração final 0,5 M) para melhorar a digestão, em seguida homogeneizar.
2. proteólise tríptico
   1. Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de tripsina em bicarbonato de amónio 25 mM e armazenar em gelo conforme necessário. Adicionar um volume suficiente de tripsina de modo a que a actividade final da enzima é de 420 BAEE (benzoil-L-arginina N-acetato de cloridrato do éster) unidades / mg de proteína extraída, em seguida, misturar em vortex suave e permitir a proteolyze durante a noite a 37 ° C.
   2. Realizar dodecil de sódio eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ¹⁷ para demonstrar a integridade da proteólise.
3. Dessalinização da amostra pós-proteólise
   1. Dilui-se a amostra 1: 2 v: v de água.
   2. Activa um de fase inversa polimérico (RP) do cartucho cheio com material de RP de 30 mg por adição de 1 ml de metanol, em seguida equilibrar o cartucho através da adição de 1 ml de 1% de ácido fórmico.
   3. Carregar a amostra para o cartucho sob a gravidade.
   4. Lava-se com 1 ml de ácido fórmico a 5% de metanol / 1% sob a gravidade.
   5. Elui-se os péptidos com 1 ml de acetonitrilo / água (90:10 v: v; 0,1% de ácido fórmico) sob gravidade em 2 ml de tubos de microcentrífuga pré-preenchido com 5 ul de dimetilsulfóxido (DMSO).
   6. Remover o solvente sob vácuo a 50 ° C utilizando um evaporador centrífugo durante 120 min, em seguida, redissolver o resíduo em 250 ul de acetonitrilo / água (3:97, v: v; 0,1% de ácido fórmico).
   7. Transferira solução para um volume baixo auto amostrador frasco.
      Nota: As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C até estar pronto para espectrometria de massa de análise de cromatografia líquida (LC / MS).
4. Geração de listas de transição para MRM
   1. Localize as sequências de mioglobina para as diferentes carnes do banco de dados UniProt.
   2. Digite as sequências de mioglobina na caixa de 'Target' do software de previsão de péptidos e de transição (por exemplo, Horizonte). Se necessário, passar o mouse sobre um peptídeo para revelar a sua lista de fragmento.
   3. Clique em "Configurações" e selecione "Peptide Configurações '. Entrada as preferências para a digestão (isto é, tripsina) e o número de clivagens perdidas (0). Introduza a selecção pretendida para os parâmetros adicionais, em particular, o comprimento do péptido (6-25), exclusões de terminal-N (0) e assumiu modificações de aminoácidos (nenhum).
   4. Clique em "Configurações" e selecione "Configurações de transição". Selecione as preferências parao tipo de aparelho utilizado para a análise por LC / MS.
   5. Clique em "Export" e selecione "Lista de Transição" para criar uma planilha contendo as transições de MRM gerados e parâmetros.
5. Análise por LC / MS
   1. Defina-se um sistema de gradiente binário (água (A) e acetonitrilo (B), cada uma com 0,1% de ácido fórmico, v: v) cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com automático de amostras, a coluna central do escudo de HPLC C18 (10 cm x 2,1 mm , 2,6? M de tamanho de partícula) ligado a um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo operado no modo de electrospray positivo com detecção MRM.
   2. No software de coleta de dados (por exemplo, Analyst), selecione 'File' e 'New' e clique em 'método de aquisição "na caixa de pop-up, em seguida, clique em' OK '.
      Nota: Isso abre o editor de método de instrumento, que contém uma lista dos dispositivos conectados que permitirão a instalação de um novo método LC / MS.
   3. Clique em 'Binary Bomba' e iNput o valor da taxa de fluxo (300 ul / min) e os tempos de gradiente na tabela, estabelecendo um perfil de gradiente binário de 3% de B até 30% de B durante 22 min, aumentando para 100% de B em 23 min, durante 5 minutos de lavar antes de voltar às condições iniciais e re-equilíbrio durante mais 6 min.
   4. Clique em 'Autosampler "e insira o volume de injecção (5 mL). Ativar o "Needle ciclos de lavagem" e digite o "Wash Time '(30 seg) e selecione' Porto Resplendor '.
   5. Clique em "Controlador Coluna termostato 'e em' Coluna Forno Propriedades 'definir o' Temperature Esquerda" e "Temperatura Right '(40 ° C).
   6. Clique em 'Mass Spectrometer "e, em seguida, clique em' Editar Parâmetros" para introduzir as condições de gás de origem. Selecione a opção "Tipo de digitalização" como "MRM (MRM) 'eo' polaridade 'como' Positivo '. Ir para 'Resumo Período' e introduza o 'Tempo de Duração ", o tempo total para a análise de uma LCd de equilíbrio (35 minutos).
   7. Na tabela, clique direito e selecione "declustering potencial (DP)" e "Collision Energia (CP) 'para adicionar essas colunas para a tabela. Digite os Q1, Q3, Tempo (ms), ID, valores DP e CE para todas as transições, por uma única espécie de carne, criados na lista de transição (veja o passo 1.4.5).
      Nota: Tempo (mseg) refere-se ao tempo de espera, o tempo passa o espectrómetro de massa de varrimento de cada transição, o somatório de que não deverá exceder 3 seg.
   8. Salve o arquivo método de aquisição (arquivo de extensão .dam).
      Nota: Os passos 1.5.2 - 1.5.8 ter de ser repetido para cada espécie de carne. Isto irá criar um único arquivo método para cada espécie de carne no modo de tela em preparação para análise abaixo.
   9. No software de coleta de dados, clique em 'Adquirir' e selecione 'Equilibrar'. Na caixa que se abre, selecione o método de aquisição necessária para começar o equilíbrio instrumento.
   10. Coloque os frascos de amostra no arack no amostrador automático.
   11. Clique em "Arquivo" e selecione "Novo", em seguida, "a aquisição do lote '. No separador 'Sample' selecionar 'Adicionar Conjunto de' então 'Adicionar Amostras'. Insira o número de amostras a serem analisadas e clique em 'OK'. Na caixa "Aquisição" selecione o arquivo método que será utilizado para a análise do menu drop-down.
   12. Na tabela, selecione 'Código Placa' e selecione a configuração da bandeja apropriada a partir do menu suspenso. clique esquerdo no 'Placa Code' cabeçalho da coluna, em seguida, clique direito e selecione "Fill Down '. Em 'Vial Position' introduzir a posição de cada amostra no amostrador automático nas linhas.
   13. Em "Arquivo de Dados" introduzir o nome do arquivo para a aquisição, clique em seguida, à esquerda no cabeçalho da coluna seguido pelo botão direito e selecione "Fill Down '. Em 'Amostra Nome' inserir a identidade de cada uma das amostras a ser analisadas. Salvar como um arquivo de lote de aquisição (arquivo extension .dab).
   14. Clique na guia "Enviar", em seguida, destacar as amostras que precisam ser analisados ​​na LC / MS. Clique em "Enviar". Clique em 'Adquirir' e 'Iniciar Sample' para iniciar a análise.
       Nota: Cada método de aquisição irá procurar as transições MRM ao longo de todo o comprimento do cromatógrafo para uma única espécie de carne. configurações espectrômetro de massa para uma aquisição MRM variam de acordo com tipo de instrumento e peptídeo.
   15. Ver os arquivos de dados gerados usando software de visualização de dados. Clique em XIC (íons extraídos) e na lista suspensa destacar todos os fragmentos (valores Q3) para um único precursor (Q1). Um novo painel será aberta, que mostra apenas as transições selecionadas.
   16. Gravar o tempo de retenção _(Rt) para grupos de transições simultâneas uma vez que estes correspondem a um único peptídeo.
   17. Repita as duas etapas anteriores para cada conjunto de transições de modo a atribuir os picos para os seus respectivos péptidos de cadadas espécies de carne.
   18. Registam-se os péptidos marcadores que sejam adequados para fornecer a identificação da espécie (por exemplo, HPGDFGADAQGAMTK péptido, um precursor de m / z = 752, _Rt = 12,0 min, para o cavalo), em conjunto com os seus tempos de retenção, e, note que formam pares adequados para a quantificação relativa correspondente .
       Nota: Por exemplo, o péptido marcador de cavalo (precursor de m / z = 752) tem uma carne correspondente péptido, HPSDFGADAQAAMSK (precursor de m / z = 767, _Rt = 13,2 min).
   19. A fim de criar um único método dinâmico que abraça todas as espécies de carne, no software de visualização de dados, para cada uma das espécies de carne, por sua vez, abrir os dados de transição XIC para cada precursor (atribuído a um péptido particular, 1.5.8).
   20. Zoom sobre o cluster de pico no tempo de retenção selecionado clicando com o botão esquerdo e arrastando o cursor por baixo do cluster. Identificar as transições mais intensos (clicando com o botão direito do mouse sobre o rótulo de pico).
   21. registar manualmente as transiçõese tempos de retenção em uma planilha.
   22. Para inserir os parâmetros como um novo método dinâmico no software / MS LC, clique em 'Mass Spectrometer "e, em seguida, clique em" Editar Parâmetros "para introduzir as condições de gás de origem. Selecione a opção "Tipo de digitalização" como "MRM (MRM) 'eo' polaridade 'como' Positivo '.
   23. Ir para 'Resumo Período' e introduza o tempo de duração (definido como o tempo total para a análise LC e equilibração). Na tabela, clique direito e selecione "declustering potencial (DP)" e "Collision Energia (CP) 'para adicionar essas colunas para a tabela.
       Nota: A coluna 'Time' agora refere-se ao tempo de retenção esperado (min) para cada transição.
   24. Na seção do / MS software de coleta de dados de LC 'Editar Parâmetros ", marque a caixa' Programado MRM '. Introduza o Q1, Q3, Tempo (min), ID, valores DP e CE para as transições criadas na planilha (1.5.21) e salve o método de aquisição (file extensão .dam).
       Nota: Este método reduz tipicamente o número de transições MRM para o 4 mais intensos para cada péptido e é executada apenas ao longo da janela de tempo a retenção de cada pico de péptido, dando uma sensibilidade melhorada e qualidade dos dados. Um método "dinâmico" é um método de "retenção guiada tempo de janelas ', às vezes chamado de agendamento.

2. Elaboração e análise de amostras de calibração

1. Extracção de misturas à base de carne
   1. Usando a carne previamente congelados, em seguida, moído em um pó, preparar uma série de misturas à base de carne por pesagem respectivos valores de carne (massa total de cerca de 300 mg) em 15 ml de tubos de centrífuga de plástico.
   2. Adicionar 4 ml de tampão de extracção (cloreto de potássio 0,15 M + M de tampão de fosfato de 0,15 a pH 6,5). Vortex durante 30 seg. Extrair num agitador de laboratório à temperatura ambiente durante 2 h a 250 ciclos / min.
      Nota: ciclos / min refere-se a um movimento oscilatório.
   3. Transferir 2 ml daextracto para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C a 17000 x g.
   4. Transferir alíquotas de 200 ul do sobrenadante (reservando uma pequena quantidade para o ensaio de proteína, ver 2.2) em 2 ml de tubos de centrífuga e secam-se utilizando um evaporador centrífugo (programa pré-estabelecido: 50 ° C, sem ventilação e 120 minutos de duração).
2. ensaio de Proteínas
   1. Transferência 7 mL alíquotas do sobrenadante reservado (ver 2.1.4) em triplicado nos poços de uma placa de 96 poços.
   2. Transferência 7 mL alíquotas de uma série de padrões de proteína, em triplicado, gama 0-1,0 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA), com a mesma placa de 96 poços.
   3. Adicionar 200 ul de Coomassie, mais reagente de ensaio de proteína a cada poço.
   4. Comparar visualmente a cor dos poços de amostra com os padrões de proteína para verificar as amostras são na gama de padrões de calibração. Se necessário, repita com a amostra diluída por isso torna-se no intervalo.
   5. Deixar a placa ste durante 3 min.
   6. Estourar as bolhas que se formaram com uma agulha hipodérmica.
   7. Analisar a placa no leitor de placas utilizando um protocolo padrão de ponto de extremidade a um comprimento de onda de 595 nm.
   8. Determinar a concentração de proteína das amostras utilizando dados de calibração a partir dos padrões de proteína.
      Nota: Isto é necessário para o cálculo da quantidade de tripsina usada na digestão tríptica.
3. A proteólise de misturas à base de carne
   1. Redissolve-se o resíduo seco a partir do passo 2.1.4 em 1 ml de solução de bicarbonato de amónio 25 mM. Misturar bem em um rotamixer.
   2. Siga o protocolo do passo 1.1.3 a 1.3.7.
4. Análise por LC / MS
   1. Configure o LC / MS como anteriormente (passo 1.5.1).
   2. Criar um novo lote de aquisição tal como descrito anteriormente (passos 1.5.9 - 1.5.14), seleccionando o método de aquisição criado no passo de 1.5.24, que utiliza um método / LC MS dinâmica da combinação de todas as espécies de carne, e adquirir os dados para os Digesamostras de carne de ted.
   3. Mostrar a cromatograma completo no software de visualização de dados. Mostrar a XIC para cada transição definido por sua vez. Confirmar visualmente cada conjunto contém o número exigido de picos em forma de sino no tempo de retenção esperado, confirmando, assim, a existência do péptido seleccionado.
   4. Realizar a quantificação utilizando os dados de visualização software para integrar as áreas dos picos para cada uma das transições de interesse com um duplo clique em "Criar Método quantificação 'na barra de navegação.
   5. No painel 'Select Sample' selecione a opção 'arquivo de dados' e 'Exemplo' a ser analisado para gerar uma tabela 'analitos'.
   6. Clique no separador 'Integração' para exibir a primeira das transições (analitos) para ser integrado.
   7. Clique na caixa "Analito 'para exibir a lista suspensa de transições para baixo. Selecione cada transição por sua vez, para exibi-la e confirmar visualmente o pico correto está selecionado para a integração. para modify ou forçar a integração, clique esquerdo e arraste o cursor sobre o pico alvo (isso será destacado em verde). Clique no botão "Select Peak" e clique em "Aplicar".
   8. Salvar o espaço de trabalho como um arquivo método (.qmf).
      Nota: Isso cria um arquivo Método quantificação para posterior cálculo das áreas dos picos da amostra.
   9. 'Assistente de quantificação "Dê um duplo clique na barra de navegação. Na janela "Seleccione Samples 'criar' quantificação Set ', selecionando um único" arquivo de dados', em seguida, um ou mais 'Amostras disponíveis ". Selecione 'Next' para exibir 'Selecione Configurações e consulta' box. Deixar com defaults, selecione "Avançar" para exibir 'Select Method'. A partir da caixa suspensa 'método' selecione o arquivo do "método de integração", criada no passo 2.4.8, em seguida, selecione "Concluir".
      Nota: Isso cria um 'Resultados da Mesa', incluindo áreas de pico de transição decorrentes das misturas de carne.
   10. Salve o «Resultados Table '(arquivo de extensão .rdb), a exportação como um arquivo de texto (.txt) e abri-lo na folha de cálculo para avaliar os dados.
   11. gráficos enredo do percentual (por área de pico de transição) de uma carne em outro versus a porcentagem medida (w / w) das duas carnes para o MRM selecionado para transições selecionadas de peptídeos correspondentes, centrando-se nos casos em que os dois fragmentos contêm o mesmo número de aminoácidos, como contado a partir da extremidade C-terminal.
       Nota: fragmentos idênticos com sites de fragmentação idênticos dar os melhores resultados.
   12. Examine as parcelas de 2.4.11 acima. Quer visualmente ou utilizando uma ferramenta de linha de tendência no pacote de trama, identificar um grupo de tramas que são lineares e de gradiente semelhante. Use qualquer uma ou mais destas combinações CPCP mais fragmentos de calibração em amostras de carne real.
       Nota: Um gráfico que mostra uma inclinação anormal pode indicar qualquer um dos péptidos ou supressão fragmento com uma consequente redução no stre sinalngth. parcelas não lineares podem indicar má detecção de pico ou outros problemas.

3. As amostras de carne

1. Extracção de proteínas a partir de amostras de carne alvo
   1. Onde, consumo estranha material não-carne aplicável a partir da amostra, utilizando uma espátula. Por exemplo, raspar o molho e massa de uma lasanha refrigerada.
   2. Pesar 20 g de carne num balão de metal.
   3. Adiciona-se 100 ml de cloreto de potássio 0,15 M / tampão de monofosfato de potássio 0,15 M a pH 6,5.
   4. Extrair as proteínas através da mistura de carne num homogeneizador de alta velocidade durante 1 minuto.
   5. Siga o protocolo do passo 2.1.4 - 2.3.2.
2. Análise de amostras por LC / MS
   1. Repita o passo 2.4.2 para adquirir dados usando o método LC / MS dinâmico.
   2. Identificar os peptídeos de cada mioglobina carne como foi executado no passo 2.4.3.
   3. Para quantificação, utilizar software de quantificação para integrar as áreas dos picos para cada transição de interesse,conforme descrito no passo 2.4.9.
   4. Para a identificação de espécies em uma mistura, gravar os péptidos marcadores que cumpra os critérios acordados para os números de transições e sinalizar ao ruído para as transições.
   5. Para quantificação, use áreas de pico de transição integradas, tal como acordado a partir do passo 2.4.12 e, usando percentagem em área de pico de transição, calcular a percentagem de mioglobina das duas espécies na mistura.
   6. Use o conhecimento prévio da literatura ¹⁸ dos níveis de mioglobina prováveis ​​nas carnes para estimar os montantes w / w relativos de duas carnes presentes na amostra.

Resultados

Em um único experimento MRM-modo dinâmico cada transição programada é tratada separadamente (como contagens por segundo detector, cps) mais de uma janela de tempo de retenção especificado. Portanto, a partir de todos os dados coletados em um experimento, o pico de intensidade para cada transição pode ser extraído individualmente. Em seguida, o único sinal finito é para a janela de tempo de retenção definido para essa transição. Do lado de fora da janela, o sinal é zero por definição. O sinal para qualquer um transição, por exemplo, 752 → 1269 de cavalo (péptido monoisotópico massa 1,501.66 daltons, um precursor de ião m / z 751.84 daltons, cobrar Estado = 2, fragmento ião Y ¹³⁾ tem tipicamente a competir apenas com ruído de medição e não de outros picos de transição que podem, talvez, ser a partir de outras espécies. A saída é, portanto, um conjunto de picos limpas, uma por transição, a um tempo de retenção comum para essas transições que compartilham de um íon precursor comum.

A Figura 1 mostra a saída para o conjunto de quatro transições → 752 (1269, 706, 248, 1366) para uma mistura de 1% w / w cavalo em carne bovina. Uma vez que os quatro transições exibidos estão associados com o cavalo, e estão ausentes em amostras de carne pura, cordeiro ou de porco, estes picos significar a presença de cavalo. Dependendo dos critérios de robustez, um conjunto de dois ou mais transições cada superior a algum sinal especificado ao nível de ruído estabelece identificação. Por conseguinte, esta figura estabelece a presença de cavalo na mistura de 1% w / w em carne de cavalo.

Ocasionalmente, uma única transição isolado é detectado. Isto indica uma correspondência possibilidade de ião precursor e um único fragmento, possivelmente a partir de uma proteína estranha, com os esperados a partir do sistema e programado no espectrómetro de massa. A singularidade do pico, e a sua ocorrência em um tempo de retenção inesperada, é o Signature de uma transição acidental que pode ser ignorado.

A área sob cada pico de transição pode ser calculado individualmente. Com base em um fragmento adequado, a proporção de cavalo para áreas de pico de transição da carne, por exemplo, 752 → 1269 (cavalo) a 767 → 1299 (carne), irá ser proporcional à razão de carnes reais na mistura. A Figura 2 mostra um lote de percentagem em área de pico para estas duas transições em relação ao peso percentual para peso do cavalo em uma mistura de cavalo com carne bovina. Se as áreas de pico percentual de transição coincidir com o peso percentual de peso de carne, em seguida, a inclinação é 1. A inclinação neste enredo é de 1,03, indicando que, para estas transições e par CPCP, as áreas de pico de transição dar uma medida confiável das quantidades relativas das duas carnes na mistura. Se a carne de cavalo na amostra foi duas vezes mais rico em mioglobina como a carne, em seguida, com outros factores inalterada, a inclinação da A linha seria maior do que um.

Figura 1. intensidades de transição MRM em função do tempo de retenção de 1% w / w cavalo em carne bovina. As transições são 752 → (1269, 706, 248, 1366), mostrado em laranja, preto, azul e verde, respectivamente. O péptido marcador é HPGDFGADAQGAMTK. Os quatro fragmentos de transição pode ser denotado Y ^13, Y ^7, Y ² e Y ^14, respectivamente, onde Y ^N indica a contagem em aminoácidos a partir da extremidade n péptido C-terminal. O sinal de ruído varia entre 23 e 53 ao longo dos quatro transições. Uma linha vermelha adicional denota a transição 752 → 1269 para o cavalo 0%, 100% de carne para comparação. Apenas a região não-zero do tempo de retenção é exibido. Esta figura foi modificado a partir de Watson et al. ^3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Lote de cavalo em carne, como o peso por cento do peso, contra cavalo em carne como área do pico por cento de transição. O enredo usa o par de peptídeos de carne (767) e cavalo (752) e o ião fragmento y ¹³ para ambos. Se A indica a área do pico, em seguida, a ordenada é _H 100 A / (A + A _{H B).} A inclinação da linha de melhor ajuste (R ² = 0,99) é 1,03. Este valor foi modificado a partir de Watson et al. ^3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A selecção de uma proteína alvo adequado é importante. Uma boa proteína alvo precisa ter formas correspondentes em espécies de interesse, suficiente variação de sequência dependente da espécie, especificidade das espécies, e existem em quantidades acessíveis dentro dos organismos. Para avaliar a misturas que tenham sido submetidas a tratamento (por exemplo, tratamento de calor), uma proteína que tem uma sequência relativamente imune a que o processamento é desejável. A mioglobina é um bom candidato para carnes vermelhas, incluindo carnes vermelhas cozidas, mas não é a única possibilidade. Uma vez que a proteína alvo é decidido, a parte mais crítica do protocolo é a proteólise da proteína. Uma proteína diferente da mioglobina pode também exigir um protocolo de proteólise alternativa.

O protocolo como descrito inclui um segmento com base em proteína de referência purificado. O objectivo é descobrir janelas de tempo de retenção e íons precursores e fragmento adequados. Este segmento é muito útil, mas não essencial.

Apesar de pares de peptídeos correspondentes de duas espécies de interesse podem ser listados, mesmo sem experiência, às vezes é o caso que uma diferença sequência tem consequências dramáticas para o perfil de digestão. Por exemplo, o par de péptido VLGFHG (carne) e ELGFQG (cavalo) dá um resultado anómalo quantificação (manifestam-se como uma inclinação inferior a um na Figura 2). Isto é porque este péptido resulta de uma clivagem KE relativamente suprimida, fazendo uma sub-estimativa do nível de cavalo na mistura. péptidos de partida correspondente com aminoácidos diferentes são, por conseguinte, melhor evitado. Muitas vezes, os fragmentos a partir de dois péptidos correspondentes têm sequências de aminoácidos idênticas e são bem comportado, mas este não é sempre o caso, e necessita de ser verificada durante o desenvolvimento do método. A identificação das espécies é muito menos sensível a estas questões do que quantificação relativa.

O protocolo foi demonstrada durante quatro carne vermelhas ^3. espécies de carne adicionais podem ser incluídos, embora a qualidade da forma do pico de transição pode deteriorar-se muitos péptidos marcadores co-eluir, reduzindo eficazmente o tempo de permanência e, finalmente, degradando estimativas quantificação relativa. A instrumentação, já disponível, vai melhorar isso. Um problema relacionado é que nem todas as carnes têm diferentes myoglobins. Por exemplo, cavalo, burro e myoglobins zebra são idênticos e, portanto, estritamente falando, o método só é capaz de detectar a cavalo ou de burro ou zebra na carne de bovino. Em alguns casos, mesmo que mioglobinas não são idênticos, alguns péptidos-chave pode ser. Por exemplo, alguns péptidos marcadores derivados de mioglobina de cordeiro também aparecem na cabra.

Uma complicação de frente para este e qualquer outro método de quantificação baseado em proteínas é que o nível de proteína deve ser assumida constante para todas as espécies, se os níveis de proteínas ou péptidos são trivialmente a igualar a níveis de carnes em uma mistura. Para a mioglobina e quatro m vermelhocome isso não é uma verdade universal. Os níveis em geral, são espécies dependentes, com carne de porco que exibem o nível mais baixo dos quatro. Além disso, o nível de mioglobina varia com carne cortada e idade dos animais. Assim, embora proporções de áreas de pico de transição mapear de forma confiável para os rácios de mioglobina, o mapeamento a proporção de carnes reais é um desenho estimativa sobre os pressupostos relativos aos prováveis ​​fontes de carnes na mistura.

A abordagem descrita neste trabalho difere em um número de maneiras de outras contribuições publicadas. Uma via mais típico é a utilização de métodos de proteómica para identificar vários péptidos marcadores dependente de espécies diferentes, caso em que os marcadores de espécies diferentes possuem nenhuma relação particular com um outro ^8-12,14,19. Por outro lado, nós selecionamos proteínas comuns a todas as espécies de interesse até espécies dependentes de sequência de variantes ^3. Para além de ser essencial para a nossa estratégia quantificação relativa, isto tem a vantagem que a amostraestratégias de preparação pode ser optimizada. Além disso, essas proteínas correspondentes pode ser esperado comportar-se de forma semelhante, por exemplo, na extracção ou no processamento comercial de amostras, tais como cozinhar ou conservas. A identificação das espécies, então, normalmente procede através da detecção de peptídeos marcadores diferentes, enquanto que nos abordagem CPCP identificação de espécies procede via detecção de peptídeos estreitamente relacionados que possuem normalmente um ou dois diferenças de sequência. Finalmente, a quantificação de proteínas para calcular a percentagem em peso de uma espécie na outra pode prosseguir através convencionalmente quantificação absoluta de cada proteína baseada separadamente em padrões conhecidos ^7,14,15. No entanto, utilizando o método de CPCP não há necessidade de métodos de calibração. Em vez disso, os níveis relativos são estimados através da comparação de intensidades de sinal de dois péptidos correspondentes a partir das duas espécies, contornando a fase de medição absoluta no seu conjunto. Uma vez que o objetivo final é uma percentagem em peso de uma espécie em another, uma quantificação relativa, então o CPCP é tanto mais direta e mais simples do que comparar duas medidas quantificação absoluta. Estas características traduzem em tempos experimentais curtos, previstos para ser cerca de duas horas usando protocolos refinados, tornando a técnica útil como uma ferramenta de vigilância rápida no campo da detecção de fraudes alimentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Banco de dados Uniprot	www.uniprot.org		Banco de dados de sequências de proteínas de acesso gratuito
Skyline software	www.skyline.gs.washington.edu		Software gratuito para download que permite a criação de métodos direcionados para estudos proteômicos, peptídeos e fragmentos Previsão
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com	O9830
Metanol, grau HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Reino Unido www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitrila, grau HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Reino Unido www. fisher.co.uk	10010010
Ureia	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com	U5378
Tripsina (de pâncreas bovino tratado com TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com	T1426
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Reagente de Ensaio de Proteína	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Padrão de proteína	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Reino Unido www.sigmaaldrich.com	P0914
Homogeneizador Ultra Turrax T25	Fisher Scientific, Loughoborough, Reino Unido www. fisher.co.uk	13190693
			laboratório Edmund and Buhler KS10
Centrífuga Heraeus Fresco 17	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Centrífuga a vácuo RC 1022	Leitor
		8B-S100-UBJ
4000 QTrap espectrômetro de massa triplo-quadrupolo	AB Sciex, Warrington, Reino Unido www.sciex.com
Sistema LC de resolução rápida 1200 Agilent	, Stockport, Reino Unido
XB C18 coluna capilar de fase reversa (100 mm x 2,1 mm, 2,6 µ m tamanho de partícula)	Phenomenex, Macclesfield, Reino Unido www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software	AB Sciex, Warrington, Reino Unido www.sciex.com		Aquisição e análise de dados QTrap, incluindo integração de área de pico
Frascos