Artigo de método

Trabalhando com células auditivas HEI-OC1

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

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House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos atualmente disponíveis para fins de pesquisa. Este protocolo descreve como trabalhar com células HEI-OC1 para investigar os efeitos citotóxicos de drogas farmacológicas, bem como as propriedades funcionais das proteínas da orelha interna.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEI-OC1 é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos disponíveis para fins de pesquisa. Originalmente propostas como um sistema in vitro para triagem de drogas ototóxicas, essas células têm sido usadas para investigar vias apoptóticas ativadas por drogas, autofagia, senescência, mecanismo de proteção celular, respostas inflamatórias, diferenciação celular, efeitos genéticos e epigenéticos de drogas farmacológicas, efeitos de hipóxia, estresse oxidativo e do retículo endoplasmático e expressão de canais moleculares e receptores. Entre outros marcadores importantes das células ciliadas da cóclea, as células HEI-OC1 expressam endogenamente a prestina, a proteína motora paradigmática das células ciliadas externas. Assim, eles podem ser muito úteis para elucidar novos aspectos funcionais dessa importante proteína auditiva. As células HEI-OC1 são muito robustas, e sua cultura geralmente não apresenta grandes complicações. No entanto, eles exigem algumas condições especiais, como evitar o uso de coquetéis antibacterianos comuns contendo estreptomicina ou outros antibióticos, bem como incubação a 33 ° C para estimular a proliferação celular e incubação a 39 ° C para desencadear a diferenciação celular. Aqui, descrevemos como cultivar células HEI-OC1 e como usá-las em alguns ensaios típicos, como proliferação celular, viabilidade, morte, autofagia e senescência, bem como realizar medições de patch-clamp e capacitância não linear.

Introdução

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House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3.

células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e os estudos iniciais indicaram que eles expressam marcadores específicos de células ciliadas da cóclea, como prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, mas também marcadores de apoio células como da conexina 26 e o receptor do factor de crescimento de fibroblastos (FGF-R) 2. Portanto, foi sugerido que HEI-OC1 poderia representar uma common progenitor de células sensoriais e de sustentação do órgão de Corti 2. Estudos paralelos fornecido forte evidência de que arquetípica drogas ototóxicas como cisplatina, gentamicina e estreptomicina induzida ativação da caspase-3 nestas células, enquanto que drogas consideradas não-ototóxicas, como a penicilina, não 2,3. Portanto, esta linha de células foi proposto como um sistema in vitro para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na ototoxicidade e para o rastreio do potencial ototoxicidade ou propriedades otoprotetoras de novas drogas farmacológicas. Estima-se que as células HEI-OC1 ter sido utilizada em mais de cento e cinquenta estudos publicados nos últimos dez anos.

Considerando a olhar para o potencial efeito pró-apoptótica de diferentes drogas foi o principal objetivo da maioria dos estudos envolvendo esta linha celular, outros processos celulares importantes como autofagia e senescência estão apenas começando a ser investigado em células HEI-OC1 4-7. Eund estudo recente do nosso laboratório 8, usamos células HEI-OC1 para recolher um conjunto abrangente de dados sobre a morte celular, sobrevivência, proliferação, senescência e autofagia induzida por diferentes drogas farmacológicas frequentemente utilizadas na clínica. Também em comparação algumas das respostas de células HEI-OC1 com as de células HEK-293 (células de rim embrionário humano) e células HeLa (células epiteliais humanas) que receberam tratamento idêntico. Os nossos resultados indicaram que as células HEI-OC1 responder a cada droga de uma forma característica, com uma dose distinta e sensibilidade dependente do tempo, pelo menos, um dos mecanismos em estudo. Nós também enfatizou nesse estudo que uma correcta interpretação dos resultados experimentais será necessário realizar estudos paralelos com mais de uma técnica 8.

Em outro estudo que investigou o uso de células HEI-OC1 para avaliar a resposta funcional do prestin, a proteína do motor de células ciliadas externas da cóclea (CCE) 9 . Nós relatamos citometria de fluxo e estudos de microscopia confocal de varredura a laser sobre o padrão de expressão prestin, bem como capacitância não-linear (NLC) e os estudos de fixação de células-remendo inteiros em células HEI-OC1 cultivadas na permissiva (P-HEI-OC1) e não permissivas (NP-HEI-OC1) condições. Os nossos resultados indicaram que tanto o aumento total de localização expressão prestin e membrana de plasma de uma maneira dependente do tempo em células NP-Hei-OC1. Curiosamente, também descobrimos que o aumento na localização prestin na membrana plasmática de células NP-Hei-OC1 correlacionada com uma diminuição em Na + K + ATPase, que translocados a partir da membrana plasmática para o citoplasma sem alterações significativas na expressão de células totais. Além disso, foi demonstrado que as células P-Hei-OC1 tem uma NLC robusta associada a prestin função motora, que diminuiu quando a densidade de moléculas Prestin presentes na membrana plasmática aumentada. Ao todo, estes resultados suportam fortemente a utilidade do HEI-OC1 células para investigar proteínas auditivas.

Neste artigo de vídeo que descrevem como a cultura de células HEI-OC1, por isso é conveniente a utilização de células crescendo em condições permissivas (P-Hei-OC1) para estudos de citotoxicidade, como avaliar o mecanismo / s de citotoxicidade induzida pela droga e como para realizar estudos electrofisiológicos (por exemplo, de patch-clamp, capacitância não-linear (NLC)) para se investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs cocleares.

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Protocolo

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Cultura 1. celular

Nota: Todos os protocolos de cultura celular deve ser realizada utilizando técnicas de cultura de células adequadas (para referência ver os 3 primeiros capítulos de Biologia Celular: Um Manual de Laboratório, Volume I 10). células HEI-OC1 não requerem qualquer revestimento adicional ou tratamento dos pratos de cultura de células para a aderência adequada e crescimento. Muito importante: não use pratos de vidro para fins de cultura de células; e o fenótipo da resposta biológica das células às drogas farmacológicas mudará (L Kalinec & F Kalinec, não publicado); convencionais placas de cultura de células de plástico são recomendadas (ver Tabela de Materiais / Equipamentos). Preste especial atenção às técnicas assépticas para evitar contaminações, mas nunca usar antibióticos (por exemplo, ampicilina ou à estreptomicina) com células HEI-OC1. Se necessário, usar anfotericina B. Enquanto HeLa e células HEK-293 foram usadas como controle em estudos anteriores com o IES-OC1 8, qualquer outra linha celular podeser aceitável para esta finalidade.

  1. Reanimação de células congeladas HEI-OC1
    Nota: Este protocolo pode também ser usado com outras linhas de células a partir do mesmo ratinho transgénico desenvolvido no nosso laboratório, tais como OC-K3, a partir de órgãos de Corti 11,12, e SV-K1, a partir de estria vascular 13,14.
    1. Remover um frasco de células criopreservadas OC1-IES de N2 líquido, e colocá-lo num banho de água a 37 ° C. Submerge apenas a metade inferior do frasco, e permitir que a descongelar até que apenas uma pequena quantidade de gelo permanece no frasco. Limpar o exterior de um frasco com álcool a 70%.
    2. Pipetar as células do frasco e entregar todo o volume (~ 1,5 x 10 5 culas / ml) lentamente, gota a gota, num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de um meio de crescimento pré-aquecido, como Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ( DMEM), suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS).
    3. Remover DMSO por centrifugação do tubo a 300-500 x g durante 5 minutos, rejeitando tele sobrenadante e re-suspender as células em 9 ml de meio de crescimento fresco (DMEM + 10% FBS). Desagregar aglomerados ou folhas de células de fluxo e refluxo das células em suspensão, a partir da pipeta para a forma e vice-versa, de três a quatro vezes com a ponta da pipeta tocar no fundo do tubo.
    4. Colocar o volume total de células suspensas em meio de crescimento em mm de diâmetro 100 não tratados, placas de cultura de células de plástico.
    5. Incubar as células a 33 ° C com 10% de CO 2 (condições permissivas).
  2. Subcultura de células HEI-OC1
    Nota: Antes até à confluência (~ 80%) as células devem ser postas em suspensão e sub-cultivadas a fim de impedir que a cultura morrer. Este protocolo pode também ser usado com outras linhas de células desenvolvidas no nosso laboratório a partir do mesmo ratinho transgénico, tais como OC-K3, a partir de órgão de Corti 11,12, e SV-K1, a partir de estria vascular 13,14.
    1. Remover o meio velho e lavar as células com 2 ml de PBS.
    2. Cobrir a monocamada de células com uma solução de tripsina a 0,25%, utilizando 1 mL por cada 25 cm2 de área de superfície. Para passar para a próxima etapa mais do que 40% das células devem ser separadas. Examinar as células utilizando um microscópio invertido e, se necessário, "tapa ou toque" das placas de cultura suavemente para libertar quaisquer células ligadas remanescentes.
      Nota: Tome cuidado como tripsinização por longos períodos pode causar morte celular; não é suficiente e as células transferidas serão insuficientes para os estudos planeados.
    3. Ressuspender as células, seguindo o procedimento descrito em 1.1.3, e transferi-los para um tubo cónico de 15 ml.
    4. Centrifugar durante 5 minutos a 300-500 xg, descartar a forma, recolher as células com meio de crescimento fresco e semear-los em, pelo menos, quatro de 100 mm de diâmetro pratos de cultura de células. O número de células por placa vai depender da quantidade de células recuperadas. Incubar as células a 33 ° C com 10% de CO 2 (P-Hei-OC1) e dividem-se novamente quantas vezes for necessário paraas experiências planejadas ou para gerar um novo estoque.
    5. Para a preparação de ações, substituir 100 mm de diâmetro pratos de 250-550 ml frascos de cultura celular; para experiências, pequenos pratos ou placas multi-poços pode ser mais adequada.
    6. Para a diferenciação, incubar células HEI-OC1 em condições permissivas, até que eles atinjam ~ 80% de confluência; em seguida, mover os pratos a 39 ° C com 5% de CO 2 (NP-Hei-OC1) de 2 a 3 semanas.
      Nota: As células irá parar progressivamente proliferando e morrer. Mudar o meio todos os dias para remover as células mortas. Dependendo do número original de células, normalmente depois de ~ 4 semanas não há mais células estarão disponíveis para as experiências. A diferenciação começa assim que as células são colocadas em condições NP, mas não todas as células diferenciar no mesmo ritmo. Importante, prestin expressão e localização da membrana aumenta durante o processo de diferenciação (ver Resultados representativos, Figura 4), ​​proporcionando um qualitativae indicação quantitativa do nível de diferenciação.

2. Drogas citotoxicidade Estudos

Nota: células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas (P-HEI-OC1) são recomendados para estes estudos (ver resultados representativos, Figura 1).

  1. A viabilidade das células (MTT)
    1. Coletar células P-HEI-OC1, seguindo o procedimento descrito em 1.2, e contá-los com qualquer um contador de células automático ou hemocitômetro. Ajustar a concentração de 2,0 x 10 5 culas / ml.
    2. Semear as células em placas de 96 poços de fundo plano claros (100 ul por poço), incubar durante a noite para fixação ao substrato, e em seguida tratá-los com os fármacos de interesse. Não se esqueça de incluir espaços em branco e células tratadas não (controle)!
    3. Após o tratamento de drogas (usualmente 24 ou 48 h a 33 ° C), realizar o ensaio de MTT seguindo o protocolo do fabricante. Em geral, Os protocolos para este ensaio têm os seguintes passos:
      1. Adicionar 10 ul de reagente MTT a cada poço.
      2. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 a 4 horas até corante roxo é visível, e, em seguida, adiciona-se 100 ul de Reagente MTT detergente a cada poço. Não agite a placa.
      3. Cobrir a placa e deixá-lo no escuro durante 2-4 horas a 37 ° C.
      4. Use um leitor de placas de microplacas para medir a absorvância a 570 nm em cada poço, incluindo os espaços em branco (médio crescimento por si só). Normalizar os dados usando o OD média de células de controlo como 100% de viabilidade.
  2. Caspase Assay 3/7 Activation
    Nota: células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas (P-HEI-OC1) são recomendados para estes estudos.
    1. Recolhe células HEI-OC1, seguindo o procedimento descrito em 1.2, e contá-las quer com um contador automático de células ou um hemocitómetro. Ajustar a concentração de 2,0 x 10 5 culas / ml.
    2. Semear as células no white de paredes placas de 96 poços (100 ul por poço), incubar durante a noite para fixação ao substrato, e em seguida tratá-los com os fármacos de interesse. Não se esqueça de incluir espaços em branco e células tratadas não (controle)!
    3. Após o tratamento de drogas (usualmente 24 ou 48 h a 33 ° C), realizar o ensaio da caspase seguindo o protocolo do fabricante respectivo. Em geral, os protocolos para este ensaio têm os seguintes passos:
      1. Prepare os reagentes, mistura-los bem, e permitir que eles atinjam a temperatura ambiente.
      2. Remover as células a partir do incubador e permitir que as placas a equilibrar à temperatura ambiente.
      3. Adicionar a quantidade indicada de reagente a cada poço, tomando cuidado para evitar a contaminação cruzada por não tocar em poços contendo amostras diferentes com as mesmas pontas de pipeta.
      4. Cobrir a placa e misturar durante 30 segundos utilizando um agitador de placas de 300-500 rpm.
      5. Incubar a placa a temperatura ambiente durante um período de, pelo menos, 30 min. determinÊ O período de incubação ideal empiricamente. Se a temperatura ambiente varia usar uma incubadora de temperatura constante, porque as flutuações de temperatura irá afectar leitura de luminescência.
      6. Medir luminescência em cada poço, e normalizar valores usando luminescência médio de células de controlo como 100% da activação da caspase.
  3. Divisão celular (proliferação)
    1. Recolhe células HEI-OC1, seguindo o procedimento descrito em 1.2, e contá-las quer com um contador automático de células ou um hemocitómetro. Ajustar a concentração de 2,0 x 10 5 culas / ml.
    2. Semear as células em placas de 96 poços de fundo plano claros (100 ul por poço), incubar durante a noite a condições permissivas para fixação ao substrato, e em seguida tratá-los com os fármacos de interesse. Não se esqueça de incluir espaços em branco e células tratadas não (controle)!
    3. Uma hora após o tratamento, adicionar a cada cavidade 1 uL de BrdU 100x preparada (5-bromo-2'-deoxyurijantar) solução, e retornar as placas ao incubador a 33 ° C.
    4. Após 12, 24 e 48 h, remover o meio existente das placas correspondentes e lavar cada poço uma vez com PBS.
    5. Realizar o ensaio de proliferação de célula seguindo o protocolo do fabricante. Em geral, os protocolos para este ensaio têm os seguintes passos:
      1. Prepare os reagentes, incluindo a fixação / solução desnaturante, tampão de lavagem, a solução de primário de detecção de anticorpos, detecção de solução de anticorpo secundário, e solução de BrdU tal como indicado no protocolo do fabricante.
      2. Adicionar a solução de fixação / desnaturação a cada poço, nos montantes indicados no protocolo do fabricante, e manter a placa à temperatura ambiente durante 30 min.
      3. Remover a solução de fixação / desnaturação e adicionar o anticorpo primário a concentração indicada no protocolo do fabricante. Manter a placa à temperatura ambiente durante 1 h.
      4. Remover a solução com a formiga primáriaibody, lavar a placa 3 vezes com tampão de lavagem, e depois adicionar o anticorpo secundário na concentração indicada no protocolo do fabricante. Manter a placa com o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 30 min.
      5. Remover a solução com o anticorpo secundário, lavar a placa 3 vezes com tampão de lavagem, e adicionar o substrato. Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, adicionar a solução STOP. Tenha cuidado: Controlar a mudança de cor; Se a solução torna-se muito escura, parar a reacção antes de o tempo de desenvolvimento de padrão 10 min.
      6. Ler a absorvância a 450 nm dentro de 30 min após a adição da solução de parada.
  4. citotoxicidade
    Nota: células HEI-OC1 cultivadas em condições permissivas (P-HEI-OC1) são recomendados para estes estudos.
    1. Incubar em condições permissivas, geralmente durante 24-48 horas, as células HEI-OC1 em meio de cultura de células (controlo) ou meio mais os fármacos de interesse.
    2. No final do tratamento, Lavar as células três vezes com PBS, e separar utilizando 1 mL por cada 25 cm2 de área de superfície de uma solução de dissociação de células não enzimática durante 3 min.
    3. Depois de retirar, recolher e peletizar as células por centrifugação a 3000 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e corar as células durante 15 min no escuro com o reagente incluído no teste de citotoxicidade.
    4. Determinar o número de células HEI-OC1 vivo por citometria de fluxo, tal como indicado pelo fabricante do citómetro de fluxo.
  5. Senescência
    1. Incubar em condições permissivas, geralmente durante 24-48 horas, as células HEI-OC1 em meio de cultura de células (controlo) ou meio mais os fármacos de interesse.
    2. Determinar o número de células positivas para SA-beta-gal utilizando citometria de fluxo com o protocolo descrito por Debacq-Chainiaux et al. 15 ou outro método conhecido para proporcionar resultados fiáveis. Uma breve protocolo de citometria de fluxo é o seguinte:
      1. No final dos tratamentos experimentais, lavar as células três vezes com PBS e depois incubar com 100 nM bafilomicina A1 em meio de cultura de células durante 1 hora em condições permissivas.
      2. Adicionar C12FDG a uma concentração final de 33 ~ ^ M, e continuar a incubação das células durante 1-2 horas.
      3. Lavar as células duas vezes com PBS, colhem-los utilizando 1 mL por cada 25 cm2 de área de superfície de uma solução de dissociação de células não enzimática durante 3 min, e o pellet-los por centrifugação a 3000 xg durante 5 min.
      4. Ressuspender as células em PBS arrefecido em gelo e determinar o número de células HEI-OC1 positivos por citometria de fluxo, tal como indicado pelo fabricante do citómetro de fluxo.
  6. autofagia
    1. Recolhe células HEI-OC1 controlar e fome (privadas de soro durante 48 horas), seguindo o procedimento descrito em 1.2, e processá-los por Western blot seguindo protocolos convencionais. Em geral, os protocolos de Western blot têm a seguinte Steps:
      1. Semente células HEI-OC1 em placas de 6 poços a uma concentração de 1,0 x 10 5 culas / ml. Depois de 24 e / ou 48 h, lavar as células com PBS gelado.
      2. Lyse com 200 ul de tampão TNESV (1% de NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1 mM de Na 3 VO 4 mM PMSF) com o cocktail inibidor de protease e um para 5 min em gelo.
      3. Recolher as células (por raspagem da parte inferior de cada cavidade), transferir para tubos de microcentrifugação e centrifugar a 16800 xg durante 5 min a 4 ° C.
      4. Recolhe-se os sobrenadantes e quantificar a concentração de proteína utilizando o BCA de Ensaio.
      5. Adicionar 5x tampão de carga e DTT 1 mM a cada amostra e fervura durante 5 min para desnaturar as proteínas.
      6. Executar as amostras utilizando SDS-PAGE num gel de 4-12%, e transferidos para membranas de PVDF.
      7. Bloquear as membranas com 5% de leite desnatado seco em TBS-T com 0,1% de Tween 20, durante 60 min à TA.
      8. Incubam-se as membranas durante a noite a 4 ° C com formiga primáriaibodies.
      9. No dia seguinte, lavam as membranas exaustivamente com TBS-T, e incubar com um anticorpo IgG secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (1: 1500) durante 1 h.
      10. Detecção imuno-reactividade com um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL). Normalizar os níveis de expressão de proteínas utilizando GAPDH (1: 2000 em TBS-T com 10% de leite magro seco) como padrão.
    2. Em transferências de Western investigar a expressão de, pelo menos, dois marcadores diferentes de autofagia como beclin-1 e LC3B (normalmente de 1: 1000 de diluição em TBS-T com 2,5% de BSA). Não se esqueça de olhar para um controle da expressão da proteína tais como GAPDH ou actina.
    3. Avaliar a expressão da proteína de interesse por densitometria usando um scanner Blot digital ou software de computador, tal como o domínio público NIH Imagem ou ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Experimentos Eletrofisiologia com células HEI-OC1

  1. células colheita
    Nota: utilização de células em crescimento em placas de cultura de 100 mm de diâmetro a 50% -80% de confluência. Tripsina, Accutase, solução livre de enzima, ou p hosphate- b uffered s aline + e thylene d iamine t Etra um ácido cetic (PBS-EDTA) podem ser utilizados para o levantamento das células, sem efeitos significativos sobre o número ea qualidade dos gigaseals . Em alguns casos, no entanto, o tratamento com tripsina torna as células mais frágil. Nestes casos, permitir que as células recuperar durante aproximadamente 30 minutos antes de começar as experiências.
    1. Lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS sem Ca 2+ e Mg 2+.
    2. Adicionar 2 ml de uma solução desacoplador isento de enzimas, tais como a solução de dissociação de células não enzimática, e incubar os pratos durante 3 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
    3. Usar um microscópio invertido para verificar a separação das células. Se necessário, mova o cell cultura prato destacar mais células, mas fazê-lo com cuidado.
      Nota: Não agite o prato.
    4. Adicionar 10 ml de DMEM + 10% de FBS e pipeta as células suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de 10 ml.
    5. Olhe para as células sob um microscópio. Se> 80% das células já estão separados (single), não é necessário prosseguir pipetagem. Se as células ainda estão em clusters, repita o cuidado pipetando até mais de 80% das células são solteiros.
    6. Coloque as ~ 10 ml de células em suspensão em um tubo cónico de 15 ml, de centrifugação durante 2 minutos a 100 xg, e desprezar o sobrenadante.
    7. Use ~ 200 mL de solução de gravação externa (meio L-15 de Leibovitz ajustada para 305-310 mOsm com água destilada) para voltar a suspender as células. Um controle óptico das células deve mostrar muitas células individuais, redondas com bordas membrana lisa.
  2. Patch-clamp e Medidas NLC
    1. Execute patch-clamp e as medições de capacitância não-linear dependente de voltagem (NLC) usando umdequate amplificadores e software, bem como técnicas electrofisiológicas padrão. Como o uso de solução interna (intrapipette) KCl 150 mM, MgCl 2 1 mM, EGTA 0,1 mM, 2 mM de ATP-Mg, 0,1 mM de GTP-Na, e 10 mM de HEPES; ajustar o pH para 7,2 com Tris.
    2. Sob o microscópio, selecionar um único, célula saudável, com rodada e as bordas da membrana lisas. Prenda a ponta da pipeta de vidro para a superfície celular e verificar a resistência da membrana. Isto deve ser de cerca de 3-6 megaohms, correspondendo a um diâmetro interno (ID) da ponta da pipeta de ~ 2 ^ m.
    3. Pressione suavemente a ponta micropipeta contra a membrana plasmática da célula e, em seguida, aplicar o vácuo. Uma porção da membrana celular serão aspiradas para a pipeta, gerando uma resistência eléctrica da ordem dos 10 - 100 (gigaOhms gigaseal).
    4. Estabelecer a condição de célula inteira por disrupção da membrana de plasma com pulsos de sucção.
    5. Utilização de células que não expressam prestin, tais como células HEK-293, como um controlo 9.
      Nota: as respostas atuais deve ser filtrado a 5 kHz, e as correções feitas para os efeitos da resistência série residual. Toda a coleta de dados e a maioria das análises podem ser realizadas usando o software incluído geralmente com os amplificadores lock-in. Função de capacitância pode ser montado com o primeiro derivado de uma função de dois estados de Boltzmann relativa carga não-linear de tensão da membrana 16.

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Resultados

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Em um par de publicações recentes já relatado um conjunto abrangente de estudos destinados a avaliar a resposta das células HEI-OC1 a vários medicamentos farmacológicos comumente utilizados, bem como investigar a função prestin 8,9. Nestes estudos, fizemos uso de todos os protocolos descritos nas secções anteriores.

Um dos resultados destes estudos anteriores foi que as células HEI-OC1 cultivadas em condições não pe...

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Discussão

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Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos.

Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outra linha ...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesse existente ou potencial.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01-DC010146 e R01-DC010397. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
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Microscópio invertidoZeissAxiovert 25EXEMPLOS, E QUALQUER OUTRO
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Placas de cultura de células, PS, 100 mm x 20 mm com aberturasGreinier Bio-One664-160
, PS,  60 mm x 15 mm com aberturas Greiner Bio-One628160
Cellstar 250 mlGreiner Bio-One658-175
Frascos de cultura de tecidos Cellstar 550 mlGreiner Bio-One660-175
Placa de cultura de células de 6 poços, com tampa-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Placa de cultura de tecidos, 96 poços, fundo plano com tampaBecton Dickinson353072
Placa de Micro-Ensaio, Chimmey, 96 poços branco, fundo transparenteGreiner Bio-One655098
Tubo cônico de polipropileno de 50 ml com tampa CellstarsBecton Dickinson 352070
Tubos cônicos de polipropileno de 15 ml com tampa-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7.4 (1x) Tecnologias de Vida10010-023
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Soro fetal bovino (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, sem vermelho de fenolGibco/Invitrogen21083-027
Tripsina, 0,25% Life Technologies25200-056
TACS Kit de Ensaio de Proliferação de Células MTTTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 kitde ensaio Promega  G8091 
Kit de Ensaio de Proliferação Celular BrdU Cell Signaling6813
Solução de dissociação celular não enzimática Sigma-AldrichC5789
Cell-Tox Green Kit de Ensaio de CitotoxicidadePromega  G8741 
Instrumento FACSAriaIIIBD Biosciences FACSAriaIIICom excitação de 488 nm (laser azul)
Scanner Digital BlotLI-CORC-DiGit
Unidade de Eletroforese e BlottingHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Leitor de Placas com Software Soft Max Pro 5.2Molecular DevicesSpectraMax 5
Amplificador Patch-clampHEKAEPC-10
Extrator para preparação eletrodos de remendoSutter InstrumentsP-97
Células Placas de cultura de células Frascos de cultura de tecidos

Referências

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