House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos atualmente disponíveis para fins de pesquisa. Este protocolo descreve como trabalhar com células HEI-OC1 para investigar os efeitos citotóxicos de drogas farmacológicas, bem como as propriedades funcionais das proteínas da orelha interna.
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Artigo de método
Trabalhando com células auditivas HEI-OC1
Neste artigo
Resumo
Resumo
HEI-OC1 é uma das poucas linhagens de células auditivas de camundongos disponíveis para fins de pesquisa. Originalmente propostas como um sistema in vitro para triagem de drogas ototóxicas, essas células têm sido usadas para investigar vias apoptóticas ativadas por drogas, autofagia, senescência, mecanismo de proteção celular, respostas inflamatórias, diferenciação celular, efeitos genéticos e epigenéticos de drogas farmacológicas, efeitos de hipóxia, estresse oxidativo e do retículo endoplasmático e expressão de canais moleculares e receptores. Entre outros marcadores importantes das células ciliadas da cóclea, as células HEI-OC1 expressam endogenamente a prestina, a proteína motora paradigmática das células ciliadas externas. Assim, eles podem ser muito úteis para elucidar novos aspectos funcionais dessa importante proteína auditiva. As células HEI-OC1 são muito robustas, e sua cultura geralmente não apresenta grandes complicações. No entanto, eles exigem algumas condições especiais, como evitar o uso de coquetéis antibacterianos comuns contendo estreptomicina ou outros antibióticos, bem como incubação a 33 ° C para estimular a proliferação celular e incubação a 39 ° C para desencadear a diferenciação celular. Aqui, descrevemos como cultivar células HEI-OC1 e como usá-las em alguns ensaios típicos, como proliferação celular, viabilidade, morte, autofagia e senescência, bem como realizar medições de patch-clamp e capacitância não linear.
Introdução
House Ear Instituto-Órgão de Corti 1 células (IES-OC1) são derivadas do órgão auditivo de um ratinho transgénico 1,2. A incubação de uma célula a partir deste ratinho transgénico a 33 ° C / 10% de CO 2 (condições permissivas) induz a expressão de um gene de imortalização que desencadeia-de diferenciação e proliferação acelerada; movendo-se as células a 39 ° C / 5% de CO 2 (condições não permissivas) levam à diminuição da proliferação, diferenciação e, pelo menos no caso de IES-OC1, morte celular 2,3.
células HEI-OC1 foram clonados e caracterizados em nosso laboratório mais de uma década atrás, e....
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Protocolo
Cultura 1. celular
Nota: Todos os protocolos de cultura celular deve ser realizada utilizando técnicas de cultura de células adequadas (para referência ver os 3 primeiros capítulos de Biologia Celular: Um Manual de Laboratório, Volume I 10). células HEI-OC1 não requerem qualquer revestimento adicional ou tratamento dos pratos de cultura de células para a aderência adequada e crescimento. Muito importante: não use pratos de vidro para fins de cultura de células; e o fenótipo da resposta biológica das células às drogas farmacológicas mudará (L Kalinec & F Kalinec, não publicado); convencionais placas de cultura de células de plásti....
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Resultados
Em um par de publicações recentes já relatado um conjunto abrangente de estudos destinados a avaliar a resposta das células HEI-OC1 a vários medicamentos farmacológicos comumente utilizados, bem como investigar a função prestin 8,9. Nestes estudos, fizemos uso de todos os protocolos descritos nas secções anteriores.
Um dos resultados destes estudos anteriores foi que as células HEI-OC1 cultivadas em condições não pe.......
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Discussão
Neste relatório nós descrevemos como cultura de células HEI-OC1 e usá-los para avaliar mecanismos de citotoxicidade induzida por drogas e investigar as propriedades funcionais de prestin, o motor molecular de CCEs coclear. Os procedimentos técnicos, no entanto, são em geral suficiente para ser facilmente adaptado a diferentes estudos.
Todos os protocolos descritos aqui requerem o uso correto de técnicas de cultura de células bem estabelecidos 10. Tal como com qualquer outra linha .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesse existente ou potencial.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos NIH Grants R01-DC010146 e R01-DC010397. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HEI-OC1 | TODOS OS KITS DE ENSAIO, EQUIPAMENTOS | ||
| Gabinete de Segurança Biológica Classe II | A Baker Company | Sterilgard | III E AS EMPRESAS INDICADAS NA |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 5810R | AS COLUNAS ANTERIORES SÃO APENAS |
| Microscópio invertido | Zeiss | Axiovert 25 | EXEMPLOS, E QUALQUER OUTRO |
| PRODUTO SEMELHANTE Waterbath | Stovall | HWB115 | PODE SER USADO. |
| Contador de células | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Duas (2) incubadoras de células, uma a 33 ° C / 10% CO2< / sub> e outro a 39 > C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Placas de cultura de células, PS, 100 mm x 20 mm com aberturas | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| , PS, 60 mm x 15 mm com aberturas | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Frascos de cultura de tecidos Cellstar 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| Placa de cultura de células de 6 poços, com tampa-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Placa de cultura de tecidos, 96 poços, fundo plano com tampa | Becton Dickinson | 353072 | |
| Placa de Micro-Ensaio, Chimmey, 96 poços branco, fundo transparente | Greiner Bio-One | 655098 | |
| Tubo cônico de polipropileno de 50 ml com tampa Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| Tubos cônicos de polipropileno de 15 ml com tampa-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Tecnologias de Vida | 10010-023 | |
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, sem vermelho de fenol | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Tripsina, 0,25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS Kit de Ensaio de Proliferação de Células MTT | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 kit | de ensaio Promega | G8091 | |
| Kit de Ensaio de Proliferação Celular BrdU | Cell Signaling | 6813 | |
| Solução de dissociação celular não enzimática | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Kit de Ensaio de Citotoxicidade | Promega | G8741 | |
| Instrumento FACSAriaIII | BD Biosciences | FACSAriaIII | Com excitação de 488 nm (laser azul) |
| Scanner Digital Blot | LI-COR | C-DiGit | |
| Unidade de Eletroforese e Blotting | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Leitor de Placas com Software Soft Max Pro 5.2 | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Amplificador Patch-clamp | HEKA | EPC-10 | |
| Extrator para preparação eletrodos de remendo | Sutter Instruments | P-97 |
Referências
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....
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Reimpressões e permissões
