Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.
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Artigo de método
Captura e libertação de viáveis circulantes células tumorais do sangue
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós demonstramos um método para captura com base tamanho de células de tumor circulantes viável (CTC) a partir de sangue total, juntamente com a libertação destas células a partir de chip para análise e / ou a jusante cultura. A estratégia emprega o uso de um novo Parylene C microfiltro ranhura membrana de poros para capturar CTC e um revestimento de poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) para thermoresponsive libertação viável do CTC capturado. A captura de células vivas é activado, aproveitando a concepção de uma geometria de abertura de poros com dimensões específicas para reduzir a tensão de cisalhamento tipicamente associados com o processo de filtração. Enquanto o microfiltro exibe uma elevada eficiência de captura, a libertação destas células não é trivial. Tipicamente, apenas uma pequena percentagem de células são libertadas quando as técnicas tais como o fluxo reverso ou raspagem célula são utilizados. A forte adesão destas células de cancro epitelial da membrana Parylene C é atribuível à interacção electrostática não específica. Para contrariar thé efeito, aplicou-se o uso de revestimento PIPAAm e exploradas as suas propriedades interfaciais responsivos térmica para libertar as células do filtro. O sangue é filtrado em primeiro lugar, à temperatura ambiente. Abaixo de 32 ° C, PIPAAm é hidrofílica. Depois disso, o filtro é colocado em qualquer meio de cultura ou um tampão mantida a 37 ° C, o que resulta na PIPAAm transformando hidrófobo, e, subsequentemente, libertando as células electrostaticamente ligados.
Introdução
A doença metastática é responsável pela maioria das mortes por câncer. Desenvolvimento de biomarcador de diagnóstico e prognóstico companheiro para metástase é crucial na gestão e tratamento do câncer. As células tumorais em circulação (CTC) desempenham um papel central na disseminação de tumores e metástases. Além disso, sendo facilmente acessível como uma "biópsia líquida" biomarcador, CTC em pacientes com câncer 'sangue periférico tem vindo a aumentar como um "viveiro" para pesquisa com biomarcadores de câncer. CTC têm sido bem validado como um biomarcador prognóstico em várias configurações de câncer, incluindo mama, próstata e cancro colorectal 1-3. No entanto, avanços recentes no campo CTC indicou que a simples enumeração dessas células raras tem utilidade clínica limitada, como demonstrado em ensaios clínicos de intervenção 4. Assim, existe uma necessidade emergente para as tecnologias que permitem a caracterização molecular e funcional do CTC. Atualmente, existem apenas algumas tecnologias que permitem for não-antigénio tendenciosa, captura viável e lançamento do CTC, permitindo robusta 5,6 análise molecular e funcional jusante. A maioria destes dispositivos microfabricados são acoplados às plataformas de microfluidos e, assim, têm um factor limitante na quantidade de sangue que esta pode ser processado, o que varia de 2-4 ml 7-10. CTC são eventos raros em um único tubo de coleta de sangue (7,5 ml), portanto, reduzindo ainda mais a quantidade de sangue que pode ser processado, dificulta enormemente a possibilidade de capturar e isolar estas células de interesse.
Nós desenvolvemos dois tipos de dispositivos microfiltro de membrana Parylene C para a captura de CTC que exploram as diferenças de tamanho entre as células tumorais maiores e as células sanguíneas normais menores 11,12. Temos relatado anteriormente no filtro de poros enumeração rodada e comparou-o com uma plataforma de aprovado pela FDA, onde o micro filtro mostrou-se superior em CTC eficiência de capturapara amostras de cancro do sangue do paciente 13,14. No entanto, uma limitação do filtro redondo é a necessidade de usar um fixador à base de formaldeído antes da filtração. Este processo preserva a morfologia de células, permitindo-lhes resistir a tensão de cisalhamento e a pressão durante o processo de filtração. Enquanto enumeração e estudos moleculares podem ser realizados no chip 13, o fixador prejudica a capacidade de realizar uma caracterização funcional. Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um filtro de poro de ranhura que nega a necessidade de fixar as células antes da filtração (Figura 1). A geometria da ranhura de poro (6 uM de largura x 40 ^ m de entalhe comprimento poros) permite que as células tumor a ser capturado quando a oclusão apenas parcialmente uma poro e, portanto, ainda permitindo a passagem livre para outras células de sangue e aliviar o aumento da pressão, que poderia levar a danos nas células e eventual rebentamento 15,16 O cartucho de slot de poros é composto por 2 peças de acrílico que sandwicho filtro de entalhe de poro entre a parte superior e na parte inferior com polidimetilsiloxano (PDMS), que actua como um vedante para proporcionar uma vedação à prova de fugas 14,15 (Figura 1).
Embora a eficiência da captação do filtro de entalhe de poro é alta, (Tabela 1), o CTC capturado estão ligadas à membrana Parylene C por fortes interacções electrostáticas não-específicos, em vez de matriz extracelular (ECM) 15 adesão mediada. Métodos tais como o fluxo inverso ou a utilização de raspadores de células não conseguem libertar eficazmente as células do filtro, ou resultar em danos celulares e a morte celular. Nós exploramos um uso não convencional de PIPAAm para formular uma estratégia de liberação 15. PIPAAm é um polímero que sofre uma transição de fase reversível temperatura crítica inferior de solução (TCIS), a uma temperatura de solução de 32 ° C 17. Tradicionalmente, esta propriedade de PIPAAm tem sido amplamente explorada para aplicações de engenharia de tecidos. Tipicamente, as células sãosuperfícies cultivadas em PIPAAm revestidos a 37 ° C quando PIPAAm é hidrofóbico. As células podem então ser separado como uma folha, quando a temperatura da cultura é deslocada para abaixo de 32 ° C, onde a superfície revestida PIPAAm torna-se hidratado 17,18. Nós explorou essa propriedade térmica através da realização do processo de filtração à temperatura ambiente (inferior a 32 ° C) e, em seguida, permitindo libertação de células, colocando o filtro em meios de cultura mantida a 37 ° C. A esta temperatura, a camada de polímero se torna hidrofóbica PIPAAm, libertando assim a células electrostaticamente ligados 15 (Figura 1).
Embora o método sensível à temperatura, bem como outros métodos têm sido aplicadas com sucesso para atingir captação CTC viável e libertar 19-21, uma desvantagem potencial chave partilhada por estas tecnologias relatados é que todos eles empregam um princípio dependente de antigénio para a captura do CTC. Antigen baseada captura de CTC, p, como mostradoreviously, pode levar a tendenciosa análise 11,14 CTC. Por exemplo, muitas tecnologias baseadas em afinidade empregar anticorpo que se liga EpCAM para a captura do CTC. No entanto, tem sido demonstrado CTC para expressar vários níveis de EpCAM, levando a omissão de EpCAM e EpCAM baixo CTC negativa por estas tecnologias. Além disso, as limitações podem ocorrer quando CTC de origem não epitelial é de interesse, tais como CTC em ambientes de melanoma e sarcoma. Assim, uma tecnologia que permite a captura viável CTC e liberação sem potencial viés introduzido por captura com base antígeno é altamente desejável.
Importantemente, o dispositivo de captura é puramente microfiltro dimensionada com base e a estratégia de liberação é agnóstico à presença de certos marcadores de superfície. Acreditamos que o emprego do microfiltro revestido PIPAAm vai ajudar a expandir a nossa compreensão do processo metastático, através do fornecimento a capacidade de capturar e liberar CTC para as análises a jusante de forma eficaz e eficiente. Isto pode potenteei ra me expor novas moléculas para as quais novas terapias direcionadas sistêmicas pode ser dirigidas, bem como fornecer um biomarcador que pode ser monitorado de forma fácil e ajuda na gestão do paciente com câncer.
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Protocolo
Declaração de Ética: Para proteger os direitos dos seres humanos, amostras de sangue foram obtidas na sequência de um consentimento informado ao abrigo de protocolos aprovados pela Universidade de Miami conselhos de revisão institucional sob IRB 20.150.020.
NOTA: Sangue a ser filtrada para captura de CTC deve ser coletado em um tubo de EDTA para impedir a coagulação.
1. Revestimento do microfiltro com poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm)
- Pesar PIPAAm para preparar uma solução a 10% w / v em butanol. Misturar utilizando um vortex até a solução ficar clara.
- microscópio de corte de plástico desliza em cerca de 12 mm x 12 mm quadrados ou com uma tesoura ou lâmina afiada. Como alternativa, use uma guilhotina.
NOTA: Estes quadrados irá servir como um suporte para os filtros, durante o processo de revestimento por centrifugação. - Usando uma tesoura afiada borda reta, cortar o slot poros microfiltro wafer em 8 milímetros x 8 quadrados mm.
- Utilizando uma fita de filme de poliimida proteger os filtros de corte na Squa plásticores previamente cortado no passo 1.3. Aplicar a película apenas para a borda e o canto do filtro de modo a que pelo menos, 7 mm x 7 mm de área de filtragem é un-coberta pela fita.
Figura 2:. Ilustração Representante da Microfilter Set-up para PIPAAm Coating 8 mm x 8 milímetros micro-filtro é posicionado sobre o 12 mm x 12 mm plástico corte quadrado de uma lâmina de microscópio de plástico. Poliimida fita é usada para fixar o micro-filtro no lugar para girar o revestimento do PIPAAm.Reproduced com a permissão de referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque o micro-filtro que é garantido na praça de plástico, para o mandril de vácuo do spin-coater.
- Programar o spin-coater com a seguinte receita: Iniciar, 500 rpm por 10 segundos, 6.000 rpm para 60 seg, 500 rpm por 10 segundos, em Parar.
- Dispensar suficiente 10% w / v solução PIPAAm (preparado em 1.1) para cobrir completamente a superfície do microfiltro usando uma pipeta de transferência de plástico padrão e iniciar o revestidor de rotação.
- Remover o microfiltro PIPAAm revestido do spin-coater após o processo de revestimento está concluído. Deixe o filtro ligado ao quadrado de plástico durante o armazenamento.
NOTA: O revestido-filtro pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até 3 meses.
2. Montagem de Filtração cassete com Microfilter PIPAAm Revestido
- Rehidratar PIPAAm microfiltro revestidos à temperatura ambiente colocando o micro-filtro ainda fixada ao quadrado de plástico para uma placa de Petri. Adicionar 1x PBS até que o micro-filtro está totalmente submersa e deixe descansar por 5 min.
- Após o passo de hidratação, libertar o filtro do quadrado de plástico cortando a fita de película de poliimida usando um par de tesoura.
NOTA: Tome nota de que lado do filtro temo revestimento PIPAAm. - Montar o micro filtro na cassete de filtração, imprensando o microfiltro entre a peça de acrílico superior e inferior, juntamente com as peças 2 polidimetilsiloxano (PDMS) atuando como uma junta / vedação. Fixar o cassete de acrílico com grampos para fixar o filtro e fornecer um selo apertado.
NOTA: O revestimento PIPAAm deve ser virada para cima, de modo que a amostra é filtrada através de, as células serão capturados no PIPAAm superfície revestida do filtro (Figura 1).
3. A filtração da amostra de sangue com a captura e libertação de CTC do Microfilter
- Como cada marca bomba de seringa tem sua própria interface de usuário, consulte o manual do usuário da bomba e programar a bomba de seringa a fluir a uma taxa de 75 ml / hr e ajustar o volume para 20 ml.
- Aqueça 3 ml de meio (disponível comercialmente) de cultura de células de McCoy (preparada por adição de 10% de Soro fetal bovino e 1% de penicilina e estreptomicina) a 37 ° C.
NOTA:. A escolha da mídia será baseada no tipo de câncer do paciente, ou então se este é um experimento sistema modelo em que as células cultivadas são a ser cravado em sangue de dadores saudáveis, utilizar os meios de comunicação as células são normalmente cultivadas em caso de dúvida, consulte a guia de cultura / método fornecido pela empresa, as células foram adquiridos. - Adicionar 7,5 mL de Solução Salina Equilibrada de Hank comercialmente disponível (HBSS) à amostra 7,5 ml de sangue e aspire o sangue diluído em uma seringa de 25 ml.
NOTA: Ajustar o volume de HBSS a fim de que a amostra de sangue é diluída com igual volume de 1: 1 com HBSS Por exemplo, se 10 ml de sangue é usado, em seguida misturar com um volume igual de 10 ml de HBSS para atingir o 1:. Diluição 1. - Envolver a cassete de filtração com a seringa e coloque-a na bomba de seringa. Coloque um tubo de 50 ml, no fundo, para recolher o fluxo através de e ligar a bomba.
NOTA: A filtração deve levar cerca de 10 a 12 min. Todas as etapas de filtração devem ser executadasà temperatura ambiente normal (20-25 ° C), incluindo a etapa 3.8 - Após a filtração é completa, desengatar a tomar nota cassete filtração qual lado é o topo que tem as células capturadas na superfície PIPAAm-revestido. Aspirar 1 ml de meio de cultura quente para uma nova seringa.
- Re-engatar a cassete de filtração com a seringa que contém os meios de comunicação, mas, desta vez se engatar na extremidade inferior da cassete de forma a que o PIPAAm revestidos na superfície do filtro está virada para fora da seringa.
NOTA: Esta será a liberar quaisquer células que podem ser incorporados nos poros de fenda através da aplicação de fluxo reverso suave. - Coloque a seringa de volta para a bomba de seringa e mantenha uma pequena placa de Petri ou placa de 6 poços direito sob a cassete de filtração. Definir a taxa de fluxo de 100 ml / hr e ligar a bomba.
- Passe todos os meios de comunicação através do filtro e recolher o flow-through na placa de Petri. Aguarde até que todos os meios de comunicação para passar e, em seguida, parar a bomba e retire a seringa umND cassete de filtração a partir da bomba.
- Desengatar a cassete de filtração a partir da seringa e abri-lo para recuperar o filtro a partir da cassete. Colocar o filtro com a superfície da PIPAAm virado para baixo na mesma placa de Petri utilizada para recolher o fluxo inverso ao liberar as células dos poros. Adicionar o resto dos meios de comunicação quentes e colocar a placa de petri em uma incubadora de cultura ajustado a 37 ° C.
- Depois de 30 minutos todas as células irão ser libertados a partir do filtro. No entanto, deixar de filtro na caixa de Petri durante 24 horas para assegurar que todas as células separar.
NOTA: Como alternativa, as células libertadas pode ser recolhido para um tubo de microcentrífuga para efectuar mais análises a jusante, tais como PCR, ELISA, Western Blot para nomear alguns exemplos. - Depois de 24 horas em cultura, remova cuidadosamente o micro filtro usando uma pinça.
NOTA: O filtro pode ser descartada neste momento, como as células foram liberados a partir dele. - Pipeta suavemente o meio de cultura para cima e para baixo, usando um 1000 & #181; l pipeta, para voltar a suspender os eritrócitos e células mononucleares do sangue periférico (PBMC) que são capturados no filtro e liberado para a placa com o CTC. Executar essa ação com cuidado e com cuidado para não separar as células cancerosas fracamente ligados. Remova cuidadosamente o meio inteiro contendo os eritrócitos ressuspensas e PBMC, deixando para trás as células cancerosas em anexo e substituir com meio fresco pré-aquecido a 37 ° C.
NOTA: Este passo pode ser repetido uma vez se eritrócitos excessivas estão presentes após uma lavagem.
4. Avaliação Viabilidade CTC
- Avaliar a viabilidade CTC cultivadas utilizando um / Dead Ensaio Live 8.
Observação: Vários ensaios Vivo / Morto estão disponíveis comercialmente. Seguindo o protocolo do fabricante é altamente recomendado. Por favor, consulte a lista de materiais / reagentes para o kit de ensaio comercial utilizado para esta experiência.
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Resultados
Usando sangue de dadores saudáveis (obtido no âmbito de um protocolo aprovado pela Universidade de Miami IRB 20.150.020 sequência de um consentimento informado) enriquecida com células cancerígenas cultivadas, a técnica thermoresponsive para a liberação de células viáveis circulantes do tumor (CTC), a captura alcançado, liberação e eficiência na recuperação de 94% ± 9%, 82% ± 5% e 77% ± 5%, respectivamente (Tabela 1) 15. Por comparação, a eficiência de rec...
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Discussão
O processo de captura CTC viável do sangue total e liberando-os do microfiltro é relativamente simples; no entanto alguns pontos críticos são dignos de menção. É imperativo, como com toda a cultura de células que uma condição estéril é mantido através de todo o processo. O passo inicial de revestimento do filtro com PIPAAm é crítico, como a base para a técnica de libertar as células do filtro se baseia na exploração de temperatura propriedades interfaciais responsivos do PIPAAm. Para assegurar o filtro foi revestida de ...
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Divulgações
Parte deste trabalho foi protegida pelo Pedido Provisório de Patente dos EUA nº 62/219.808. Siddarth Rawal é um acionista da Circulogix Inc. que produz comercialmente os filtros e/cartuchos de filtro usados neste artigo.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os pacientes que doaram amostras de sangue para apoiar este trabalho. Agradecemos aos Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli e Marc E. Lippman por sua assistência na aquisição de amostras clínicas, e aos Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez por suas discussões perspicazes. Zheng Ao agradece apoio parcial e assistência do Programa de Pós-Graduação em Biologia do Câncer Sheila e David Fuente, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de ranhura | Circulogix Inc. | MSF-01 | Filtros de tamanhos diferentes disponíveis com base na filtração para CTC de sangue ou urina (www.circulogixinc.com) |
| poli(N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Não perigoso. Armazene em temperatura ambiente. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use em áreas bem ventiladas |
| Lâminas de microscópio de plástico | Cole-Parmer | 48510-30 | Qualquer lâmina de plástico ou alternativamente qualquer tipo de quadrado (Metal, Acrílico etc.) pode ser usado se for fardo para segurar o quadrado do filtro de 8mmx8mm |
| Revestimento Especial | Spin Coater SCS G3 Spin Coater | Instrumento | |
| Fita de Poliimida | Uline | S-7595 | Poliimida é o nome genérico da fita Kapton que pode ser adquirida de vários fornecedores (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petri plates 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | estão disponíveis com base na filtração para CTC do sangue ou urina |
| Seringa 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Seringa Bomba | KD scientific | 78-0100V | Qualquer bomba de seringa capaz de conter uma seringa de 25 ml pode ser usada |
| Tubo de centrífuga Cellstar 50 ml | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One placa de 6 poços | VWR | 89131-688 | Qualquer marca pode ser usada, desde que a superfície seja compatível com adesion celular e não repelente |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Ensaio de Mortos Vivos | Life Technologies | L3224 | Qualquer ensaio que possa fornecer uma análise razoável para avaliar células vivas funcionará |
| Incubadora de cultura celular | VWR | 98000-368 | Qualquer incubadora que possa ser usada para cultura de células será suficiente |
Referências
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Reimpressões e permissões
