Artigo de método

Transplantação no Pad Mouse ovário Fat

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DOI:

10.3791/54444

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7 de setembro de 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um ensaio transplante moda pad ovário adequado para estudos de epitélios normais e transformadas do trato reprodutivo feminino. A almofada de gordura mouse permite que o transplante de grandes fragmentos de tecido, é facilmente acessível para a cirurgia e de imagem, e fornece o ambiente nativo mais favorável para tecidos de origem de Müller.

Resumo

Ensaios de transplante ortotópico em camundongos são inestimáveis para estudos de regeneração celular e transformação neoplásica. As abordagens comuns para transplante ortotópico de superfície ovariana e epitélio tubário incluem administração intraperitoneal e intrabursal de células. As respectivas limitações desses métodos incluem localização mal definida das células injetadas e volume de espaço limitado. Além disso, eles são pouco adequados para a preservação estrutural a longo prazo de órgãos transplantados. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos uma abordagem alternativa, baseada na introdução de células e fragmentos de tecido na almofada de gordura do camundongo. A almofada de gordura ovariana de camundongo está localizada nas imediações do ovário e da tuba uterina (também conhecida como oviduto, trompa de Falópio) e fornece um microambiente familiar para células e tecidos desses órgãos. Em nossa abordagem, células de camundongos e humanos marcadas com fluorescência e fragmentos da tuba uterina são enxertados usando cirurgia de incisão dorsal minimamente traumática. As células transplantadas e suas conseqüências são facilmente localizadas na almofada de gordura ovariana por mais de 40 dias. O transplante de longo prazo de toda a tuba uterina permite a preservação correta de todos os principais componentes do tecido e não resulta em efeitos colaterais adversos, como fibrose e inflamação. Nossa abordagem deve ser aplicável exclusivamente para responder a questões biológicas importantes, como diferenciação, potencial regenerativo e neoplásico de populações de células específicas. Além disso, deve ser adequado para estudos de fatores microambientais no desenvolvimento normal e câncer.

Introdução

Os ensaios de transplante, as quais envolvem a introdução de células e tecidos em locais específicos do corpo em ratos, representam uma abordagem essencial para os estudos de regeneração de tecidos e a carcinogénese. ortotópico transplantes de células, isto é, a sua colocação num meio nativo, são particularmente importantes para a caracterização de células estaminais adultas. A existência de células estaminais mamários foi sugerida primeiro pela transplantação de fragmentos epiteliais da glândula mamária em almofadas de gordura mamaria glândula-livre de ratos 1. Ensaios de enxerto para rato humanizado gordura pad 2 foram usadas para recapitular o desenvolvimento potencial e normal regenerativo das células epiteliais mamárias humanas primárias. Além disso, transplantes de diluição em série e limitantes de tipos de células fenotipicamente distintas para a almofada de gordura mamária apuradas foram cruciais para testar a capacidade de auto-renovação e diferenciação multilinhagens de células-tronco mamárias 3-5. ensaios de transplante em combination com linhagem genética rastreamento forneceram evidências da célula de origem na carcinogênese mamária 5. Transplantes cápsula renal são comumente usados ​​para testar as propriedades de próstata putativo células-tronco 6. Transplante ortotópico de camundongo normal e neoplásico e Organóides pancreáticas humanas revelou genes e caminhos alterados na progressão do cancro 7. A importância do ambiente nativo também tem sido apoiado pela demonstração de regeneração diversificada após engraftments de glândulas sudoríparas em diferentes locais, como almofadas de mamárias de gordura, ombro bolsas de gordura e pele para trás 8.

A cavidade peritoneal e da bursa ovariana são geralmente usados ​​como locais para transplante ortotópico de células epiteliais do trato reprodutivo feminino 9-12. Ambos estes métodos apresentam um número de limitações. A injecção intraperitoneal de células leva a suas implantações em diferentes áreas da cavidade peritoneal, assim, complicating acompanhamento do crescimento celular. Além disso, as variações no microambiente, tais como a extensão da vascularização, inervação e representação de células imunitárias, pode ser muito significativa em diferentes áreas da cavidade peritoneal. A bolsa do ovário tem um volume muito limitada, permitindo que a injecção de não mais de 10 ul de líquido. Isto limita significativamente a quantidade de células que pode ser administrada. Além disso, injecções na bolsa do ovário pode ser bastante tecnicamente desafiante e o processo requer uma quantidade significativa de tempo.

Para resolver estas limitações, temos aproveitado as propriedades almofada de gordura ovarianos. O mouse ovário almofada de gordura tem um tamanho grande, fica ao lado do ovário e da tuba uterina, e é facilmente acessível por cirurgia. Tem sido relatado que o trofoblasto equina podem ser transplantadas para a almofada de gordura do ovário do rato 13. No entanto, os detalhes deste método não foram descritos. Ele também não foi informado se este meTHOD pode ser aplicada a células adultas e tecidos. Aqui, nós descrevemos um método de confiança para o transplante de células humanas do tracto reprodutor feminino e rato e mostram que este método é também aplicável para a transplantação de órgãos a longo prazo.

Protocolo

Todo o trabalho in vivo descrito é aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Cornell.

1. Preparações de exemplo para o ovário Fat Pad Ensaios

  1. Isolamento e Cultura Primária Tubal Epitélio Cells (TE)
    1. Eutanásia dador com 6 a 8 semanas de idade virgem β-actina-Proteína Fluorescente Verde melhorada (EFGP) ou Proteína Fluorescente Vermelha (DsRed) ratinhos β-actina Discosoma-CO 2 por administração seguido por deslocamento cervical. Verifique a eutanásia bem sucedida por uma pitada dedo do pé.
    2. Coloque um ratinho individual em uma cortina absorvente, ventral lateral-se, em seguida, limpe o abdômen com etanol 70%. Abrir a pele, fazendo uma incisão lateral à linha média do corpo e com a ponta dos dedos puxar a pele acima e abaixo da incisão na direcção da cabeça e cauda do rato.
    3. Segure o peritônio usando uma pinça sem corte e fazer um corte com uma tesoura fina para abrir a cavidade do corpo. Com cuidado, empurre a bobina do intestinum e de lado e localizar os órgãos reprodutores.
    4. Com uma pinça fina pegar um corno uterino e corte de 0,5 cm acima do ponto onde os cornos uterinos separar. Enquanto mantém o corno uterino, dissecar o tecido conjuntivo anexado ao corno uterino, tubas uterinas, almofada de gordura ovário e ovariano. Coloque trato reprodutivo dissecado em um prato com 6 ml estéril salina tamponada com fosfato (PBS). Prosseguir com a segunda trato reprodutivo.
    5. Colocar a cápsula para uma cabine de segurança biológica e lavar os tecidos 3 vezes em 6 ml de PBS estéril. Continuar o trabalho sob um microscópio de dissecação localizado no armário de Biossegurança. Agarre o corno uterino com uma pinça fina e desligue o corno uterino da tuba uterina, cortando na junção útero-tubária. Cortar a bursa ovariana em torno do ovário usando uma agulha 25 G.
      Nota: Após a bolsa do ovário foi removido, a dissecção está completa e o tubo uterino indivíduo permanece na solução de PBS.
    6. Transferir um single tuba uterina em uma queda de 50 ul de PBS a um 3,5 cm de placa e pique em pedaços de 0,1 mm utilizando 28 agulhas de calibre. Transferir para 200 tampão de digestão ul 1 (Modificado (DMEM) F12 de Eagle da Dulbecco () meio de Ham suplementado com 300 unidades de ml-1 de colagenase e 100 unidades de ml-1 de hialuronidase) e incubar durante 1 hora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora.
    7. Após a incubação, adicionar 1 ml de 0,25% Tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e suspender a solução com a ajuda de uma pipeta de 1 ml de ponta (aka ponta azul) 20 vezes durante 3 minutos. Adicionar 5 ml de + 4 ° C DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 2%.
    8. Recolha de tecidos por centrifugação (600 rcf, 5 min, temperatura ambiente (RT)), e adicionar 1 ml de tampão de digestão de 2 (DMEM F12 () meio de Ham suplementado com 7 mg mL -1 Dispase II e 10 ug mL-1 desoxirribonuclease I ( ADNase I)). Suspender sedimento de tecido de 20 vezes com a ajuda de uma pipeta de 1 ml de TIp.
    9. Adicionar meio completo livre 5 ml de soro de crescimento de camundongo tubária epitélio (M-TE-GM, Tabela 1).
    10. Recolher as células por centrifugação (600 RCF, 5 min, RT). Adicione 1 ml M-TE-GM, suspender e contagem de células por hemocitômetro. Semente 1 x 10 5 células em 1 ml por poço numa placa de 24 poços e incubar baixo fixação em M-Te-GM a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 4 dias.
    11. Mudar o meio todos os dias.
    12. Preparar suspensões de células únicas de células TE suspensão primárias cultivadas a partir de murganhos p-actina-EGFP ou β-actina-DsRed.
      1. Recolhe culturas em suspensão de TE de placas de 24 cavidades de fixação de baixo. Centrífuga (600 rcf, 5 min, temperatura ambiente), e suspendê-peletes de células com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar durante 10 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
      2. Pare a actividade da tripsina por adição de 5 ml de DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 5%. Recolher os sedimentos celulares por centrifugação (600 rcf, 5 min, RT).
    13. Lavar os sedimentos celulares duas vezes com 4 ml de PBS frio (4 ° C), juntar 1 mL de PBS por cada pelete de células, e de suspensão. Contagem de células pelo hemocitómetro e transferir para tubos de 1,7 ml de centrifugação. Trabalhar em gelo, adicionar 1 x 10 5 células a 10 uL de PBS, em seguida, adicionar matriz de membrana basal de 10 ul. Suspender e transportar no gelo para a sala de animal.
      Nota: Execute todas dissecção e tecido trabalho de cultura em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis.
  2. Preparação de Linha de Células humanas imortalizadas
    1. Separadamente crescer lentivírus-EGFP e -mCherry marcado humana imortalizada lineHIO118 celular do epitélio da superfície do ovário, até 80-90% de confluência em placas de 10 cm a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
    2. Lavar pratos duas vezes com 10 ml de PBS, adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por placa e incubar durante 10 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Parar a reacção por adição de 10 ml de DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 5%. coletaros sedimentos celulares por centrifugação (600 RCF, 5 min, RT).
    3. Lavar os sedimentos celulares duas vezes com 10 ml de PBS frio (4 ° C), juntar 1 mL de PBS por cada pelete de células, e de suspensão. Contagem de células pelo hemocitómetro e transferir para tubos de 1,7 ml de centrifugação.
    4. Trabalhar em gelo, adicionar 1,0 X 10 6 células Lenti-mCherry rotulados + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP células marcadas com 10 ul de PBS. Adicionar matriz de membrana basal de 10 ul. Suspender e transportar no gelo para a sala de animal.
  3. Preparação da tuba uterina
    1. Dissecar tubos uterinos individuais a partir de 6 a 8 semanas de idade os ratinhos virgens β-actina-DsRed em PBS como descrito nos passos 1.1.1-1.1.5. Transferir tubos uterinos individuais em uma gota 200 ul de PBS sob um microscópio de dissecção. Suavemente desenrole tubos uterinos com a ajuda de pinças e agulhas de calibre 28 através da remoção do mesossalpinge, uma porção do ligamento largo que é compatível com os segmentos do tubo uterino. Coloque individuais tubas uterinas desenroladas em uma queda de 200 ul PBS gelado até ovário almofada de gordura do destinatário está exposta e preparado para receber o transplante.

2. ovário Fat Pad Transplantation

Nota: Desinfetar instrumentos entre cada cirurgia animal. Preparar e organizar todos os equipamentos com antecedência. transplantes dorsal para a almofada de gordura ovário direito são preferenciais, pois isso evita o baço. No entanto, os destinatários podem ter transplantes em ambas as bolsas de gordura ovarianos.

  1. Use ratinhos singénicos ou camundongos Imunodeficiência Combinada Grave (SCID / NCR) como receptores de células primárias. Para as células humanas, tais como HIO118 células, / SCID / gama ratos uso Nod (NSG) ou SCID.
  2. Anestesiar rato destinatário com uma única injecção intra-peritoneal de 2,2,2-tribromoetanol a uma dosagem de 0,15 ml / 10 g de peso corporal. Colocar o animal numa almofada de aquecimento, na capa de animais anestesiados e confirmar adequada pela perda de reflexo do pedal (aperto do dedo do pé). Aplicar vet pomada nos olhos para evitar a secura, enquanto oanimal está sob anestesia. Injectar o subcutaneamente animal com o Cetoprofeno analgésico a uma dosagem de 4 mg / g de peso corporal para o tratamento de dor pós-cirúrgica.
    Nota: Como alternativa, use o isoflurano para a anestesia. Colocar o animal na câmara de indução e ajustar o medidor de fluxo de oxigénio para 0,8-1,5 L / min e o vaporizador de isoflurano para 2-3%. Remover o animal anestesiado da câmara, deixá-lo respirar isoflurano a partir de uma máscara e definir o medidor de fluxo de oxigênio para 0,4-0,8 L / min e o vaporizador isoflurano a 1,5%, em seguida, iniciar a cirurgia.
  3. Raspar a área cirúrgica com # 40 clippers; remover o cabelo de uma área de 2 vezes a área cirúrgica, preparar a pele raspada com três esfrega anti-séptico de iodo-povidona, seguido por 70% de etanol, e cobrir com uma cortina estéril.
  4. Mova o animal sob um microscópio de dissecação localizado em uma cabine de segurança biológica. Expor o tracto reprodutor por uma incisão na posição dorsomedial directamente por cima da almofada de gordura do ovário.
    Nota: Critetapa ica: incisão da pele preciso facilita a cura de feridas, a utilização de um bisturi é recomendada na etapa 2.4.
  5. Usando uma pinça fina sem corte puxar a almofada de gordura ovário cuidadosamente através da incisão em direção à linha média, minimizando danos aos nervos e vasos sanguíneos principais.
    Passo Crítico: Se ocorrer sangramento, pare a cirurgia e considerar o transplante de um animal hospedeiro diferente.
  6. Sob o controlo do microscópio de dissecção com a ajuda de uma agulha de calibre 28 chanfrada fazer uma incisão de 2-4 mm de profundidade dentro da almofada de gordura dos ovários, 3-4 mm acima do ovário.
    passo crítico: Certifique-se que a incisão única atravessa metade da camada de gordura; perfurando todo o caminho até a parte inferior faz com que o vazamento. Seja rápido e proceder sem demora após esta etapa.
  7. Para transplantes de células, encher uma seringa (agulha de calibre 30) com 10-20 ul da membrana matriz de mistura de células-cave e injetar na incisão almofada de gordura. Para transplante tuba uterina, pegar a sagacidade tuba uterinah pinça fina e coloque em 10 - matriz de membrana basal 20 l mantido em gelo. Usando um 0,1-10 / 20 l XL formou ponta de filtro (encurtado em 3 mm) pegar a suspensão matriz de tecido e membrana basal e solte na incisão almofada de gordura.
  8. Esperar 5 minutos para a matriz da membrana basal para solidificar e colocar o aparelho reprodutor de volta para o peritoneu. Feche os músculos com 2 stiches de sutura cirúrgica e a pele com dois clipes pequena ferida ou sutura cirúrgica.
  9. Repita os passos de 2,4-2,8 para transplantar uma matriz de mistura de membrana PBS-cave na almofada de gordura contra-lateral do animal que servirá como controle.
    passo crítico: Após a cirurgia colocar o animal numa almofada de aquecimento, porque a perda de calor é rápida, em ratos anestesiados.
  10. Vamos animais recuperar em uma almofada de aquecimento na gaiola nativa e observar o animal até totalmente acordado da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter esternosl decúbito. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
  11. Coloque um punhado de peletes alimentares pré-molhados no interior da gaiola para além secar os alimentos na gaiola após a cirurgia. Aplicar analgésicos pós-cirúrgicas, se necessário para os próximos dias e examinar a ferida diariamente. Aplicar antibióticos de acordo com o protocolo de animais aprovados se infecção da ferida ocorre. Remover grampos de feridas 10 dias após a cirurgia, quando a ferida foi totalmente fechada.

3. Histologia e Aquisição de Imagem

  1. Coleção do enxerto e Preservação
    1. Preparar solução de paraformaldeído a 4% por mistura de 26 ml ddH2O com 4 ml de PBS 10X e 10 ml de solução de paraformaldeído a 16%.
    2. Dissecar em um bloco, o bloco enxertados ovário gordura, ovário, trompa uterina, 0,5 centímetros útero, tal como descrito nos passos 1.1.1-1.1.4. Colocar imediatamente em 2 ml de 4% de paraformaldeído e fixar durante 2 h, à TA. A partir do mesmo animal, dissecar o não-enxertadoscontralateral sistema de almofada de gordura ovário transplantado com a mistura de matriz de membrana PBS-cave como um controle (veja o passo 2.9). Fix e processo da mesma forma.
    3. Após lavagem fixação tecidos três vezes com PBS durante 5 min e incubar durante a noite em PBS a 4 ° C.
    4. Para todo o monte a imagem da camada de gordura ovário avançar para o passo 3.2.1.
      Nota: Depois de os tecidos de aquisição de imagem pode ser congelada (3.3.1) ou processados ​​para inclusão em parafina (3.3.2). incubação durante a noite em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C melhora a qualidade de tecidos congelados.
  2. Aquisição de imagem
    1. O lugar todo-montar sistemas de almofada de gordura ovarianos em pratos PBS cheios e imagem usando um microscópio invertido equipado com o acessório de epi-fluorescência e câmera colorida de alta definição, com 4, 10x objetivos e um estereomicroscópio equipado com um acessório de fluorescência, câmera colorida e Plano Apo 1xWD70, objectivos ED Plano 1.5xWD45.
  3. Histologia
    1. Segueaquisição de imagem todo-mount (3.2.1) coloque uma gota 200-500 mL de incorporar meio de amostras de tecidos congelados em um pedaço 2 x 1 cm de filme de laboratório e usando uma pinça, transferir o tecido para a queda. Pegar o filme em uma borda e transferir a gota tecido de médio para um frasco criogênico ml 1.8. Feche o frasco e mergulhar em azoto líquido. Armazenar tecidos congelados a -80 ° C.
    2. Como alternativa, proceder à inclusão em parafina padrão. Use 20-40 volumes de volume de tecido, para cada passo.
      1. Imergir tecidos uma vez em etanol a 65% durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      2. Imergir tecidos uma vez em etanol a 70% durante 30 min, agitando suavemente à TA. Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas durante meses à TA.
      3. Imergir tecidos uma vez em etanol a 90% durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      4. Imergir tecidos uma vez em etanol a 95% durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      5. Imergir tecidos duas vezes em etanol absoluto (200 prova) durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      6. Imergir tecidos duas vezes em clorofórmio, durante 30 min, agitando suavemente à TA.
      7. Mergulhar uma vez que os tecidos em parafina, durante 30 min, agitando suavemente a 58 ° C.
      8. Mergulhe tecidos vez em parafina para 12 horas, agitando a 58 ° C.
      9. Mergulhar uma vez que os tecidos em parafina, durante 3 h, a 58 ° C.
      10. Coloque tecidos em moldes de histologia de metal e encher moldes com 58 ° C de parafina. Adicionar uma cassete de histologia de plástico no topo da parafina arrefecer e parafina para 4 ° C. Extraia bloco de parafina de tecido e armazenar a RT.
        Nota: Parafina temperatura não deve exceder os 58 ° C durante a preservação óptima de tecido adequado para coloração imuno-histoquímica.
    3. Alternativamente, Prepare-se para o Parafina com Gel processamento das amostras.
      1. Aspirar o PBS e transferir tecidos Todo-mount a 70% de etanol. Incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Em um banho de água, a amostra de pré-aquecimento para o processamento de gel de 60 ° C.
      2. pipetae 200 ul de gel de processamento de espécimes sobre uma placa de Petri de laboratório filme forrado. Utilizando uma pinça de dissecção fina transferir o sistema de tecido todo-mount à queda espécime de gel de processamento.
      3. Permitir que a amostra tampão de gel de processamento a solidificar à temperatura ambiente, ou solidificar o tampão durante 10 min a 4 ° C.
      4. Colocar o tecido embebido em gel de processamento de espécimes em cassetes de tecido ensanduichada entre a histologia de biópsia almofadas de espuma. Incorporar em parafina como nos passos 3.3.2-3.3.2.10.
        Nota: Specimen processamento incorporação gel evita a perda e permite a preservação de amostras de tecidos frágeis pequenas.
        Nota: Os tecidos congelados ou inclusão em parafina são adequados para coloração imuno-histoquímica 14,15.

Resultados

As células experimentais e tecidos podem ser transplantadas com precisão na almofada de gordura do ovário sob um microscópio de dissecção (Figura 1). Os exemplos incluem o mouse células primárias de epitélio tubário derivadas de ratinhos que expressam EGFP ubiquamente (Figura 2A) ou DsRed (Figura 2B) e as células humanas imortalizadas superfície do epitélio do ovário HIO118 16,17 células marcadas com mCherry EGFP e lentivírus (Figura 2C - F). A abordagem é também aplicável para a transplantação de longo prazo de órgãos, tais como o tubo uterino do rato (Figura 3). De acordo com a coloração imuno-histoquímica, tanto ciliadas (Foxj1 positiva 14) e células secretoras (PAX8 positiva 15) são preservados no epitélio das trompas de tecidos transplantados (Figura 3D e E).

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Figura 1:. Do ovário do rato gordo Transplantation (A) área exposta do transplante (seta). (B) Uma incisão é feita por uma agulha G 28 (seta). (C) UT / cave matriz da membrana enxerto mistura pela ponta da pipeta (seta). (D) UT enxertada (seta, vermelho brilhante, UT de ratos-DsRed β-actina). FP, almofada de gordura; Ov, ovário; UT, tuba uterina. Barra de escala = 2 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Detecção de Transplantado. Mouse células primárias de epitélio e Tubal humanas imortalizadas superfície do ovário Epitélio células (A, B) para fora tumores de rato primária células epitélio tubário (setas) de ratinhos β-actina-EGFP (A, verde) e de p-actina-DsRed (B, vermelho) 8 dias após o transplante num ratinho singeneico. (C, D) Engraftments de células mistas HIO118 (setas) marcada ou com Lenti-EGFP (verde) ou Lenti-mCherry (vermelho) 10 dias após o transplante em ratos NSG. (D) Área ampliada a partir de (C, seta). (E, F) de enxerto desenvolvida 43 dias após a transplantação de células os mesmos como em C, D de ratinho SCID (setas). AD, F, fluorescência; E, campo claro, FP, almofada de gordura; Ov, ovário; UT, tuba uterina. (A, B, DF) Barra de escala = 500 mm; (C) Scale bar = 1.600 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Caracterização de Transplante uterina Tube. (A) tuba uterina completa (seta) de β-actina-DsRed rato 6 dias após o transplante na almofada de gordura do ovário (seta, vermelho brilhante). (B) secção congelada fluorescente da almofada de gordura com transplante mostrado em (A). Vermelho, DsRed; Azul, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) contracoloração nuclear. (C) tuba uterina enxerto (seta) 40 dias após o transplante em NSG rato destinatário (seta). seção de parafina. Nota preservação correta de todos os componentes tubário princípio, ea falta de fibrose associada ao transplante e inflamação. Hematoxilina e eosina. (D, E) A detecção de genes marcadores epitélio tubário-box Emparelhado 8 (PAX8) e caixa de forkhead J1 (Foxj1; cor nuclear marrom, pontas de seta) em células do enxerto (setas) mostrados na ( C). sistema de imunoperoxidase. Contracoloração com verde de metilo. FP, almofada de gordura; Ov, ovário; UT, tuba uterina. (A) Barra de escala = 1,000 m; (B) Barra de escala = 200 mm; (CE) Scale bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente 1x DMEM F12 médio (de Ham)
L-Glutamina 2 mM
pruvate de sódio 1 mM
factor de crescimento epidérmico 10 ng mL -1
Básico factor-2 de crescimento de fibroblastos 10 ng mL -1
hidrocortisona 500 ng mL -1
Insulina 5 ug mL1
Transferrin 5 ug mL1
selenito de sódio 5 ng ml -1
albumina bovina 0,10%
Penicilina / Estreptomicina 100 unidades mL -1 / 100 ug mL1
Meio de Eagle (MEM) ácidos essenciais mínimos aminoácidos não essenciais 0,1 mM
O beta-mercaptoetanol 10 -4 M

Tabela 1:. Rato Tubal Epithelim Meio de Crescimento (M-Te-GM) componentes listados na coluna da esquerda são dissolvidos em meio F12 de DMEM 1x (de Ham) nas concentrações indicadas, coluna da direita. A composição do meio final é livre de soro.

Discussão

Nós estabelecemos um ensaio de transplante de almofada de gordura dos ovários, que permite a entrega precisa e detecção de células epiteliais e tecidos. O procedimento de transplante de ensaio almofada de gordura de ovário é tecnicamente menos exigente do que a injeção intrabursal 10-12 e permite mais uniforme e localização precisa das células transplantadas em relação à injeção intraperitoneal 9. Também é bem adequado para o transplante a longo prazo de um órgão inteiro, tal como o tubo uterino.

Importante, a almofada de gordura dos ovários proporciona um micro-ambiente familiar para os epitélios do sistema reprodutivo feminino. Deve ser particularmente adequada para estudos das propriedades moleculares e celulares do ovário de humano e de ratinho e células do epitélio das trompas durante a regeneração e transformação maligna. Em contraste com outros órgãos, poucos estudos têm-se centrado na identificação e caracterização de células-tronco no epitélio da r femininatrato eproductive 18,19. Tais estudos são de particular importância porque muitos cancros são acreditados para se originam de células-tronco adultas 20. Ainda origens celulares de cancro do ovário epiteliais permanecem altamente discutível 18. Cancros do ovário epiteliais são responsáveis ​​pela maioria dos casos de câncer de ovário e está em quinto lugar entre todas as mortes relacionadas ao câncer de mulheres em os EUA 21. Assim, o desenvolvimento de um ensaio com ortotópico várias vantagens sobre as técnicas de transplante existentes 9-12 deve facilitar grandemente os estudos nesta área.

Dada a localização superficial da camada de gordura ovário, sistemas de imagens de pequenos animais podem ser usados ​​para acompanhar engraftments marcadas com fluorescente forte ou repórteres bioluminescentes. Também deve ser possível estabelecer ensaios de imagiologia minimamente invasivos alta resolução vivos, tais como a microscopia não-linear 22. A almofada de gordura dos ovários, também podem ser mantidos em culturas de órgãos, desse modo, permitiring cultura tri-dimensional de epitélio normal e neoplásico sob condições recapitulando estreitamente a organização das células e a matriz extracelular. Estudos futuros devem abordar estas possibilidades promissoras.

Vários passos críticos tem que ser considerada. Proporcionando uma almofada de aquecimento e manter roedores quente durante a cirurgia melhora a taxa de sobrevivência. Esterilidade de instrumentos de manipulação a almofada de gordura garante que os sistemas enxertados são mantidos estéril. Em nossa experiência, significativos resultados de sangramento em retardo do crescimento de transplantes. É importante ressaltar que a almofada de incisão de gordura deve ser feita precisamente porque rasgar a almofada de gordura ou perfurando-o através de causas de sangramento. Coagulantes deve ser usado para parar a hemorragia, como necessário. Se engraftments não se desenvolvem, uma concentração mais elevada de células injectadas deve ser considerada. As primeiras protuberâncias bem sucedidos podem ser observadas tão cedo quanto uma semana após o transplante e mais engraftments deve ser uma visívelmeses após o procedimento. Para o transplante, agulhas com diâmetro maior (23-25 ​​L) pode ser utilizada para prevenir cisalhamento de células grandes (mais de 10 um de diâmetro). No entanto, essas agulhas pode ser mais traumático para a almofada de gordura e seu uso deve ser testada antecipadamente. Para nossas experiências que usaram ratinhos dadores e receptores de idade de 6 a 8 semanas. Em ambas as finalidades ratos mais jovens ou mais velhas pode ser usado. No entanto, o número de células injectadas podem precisar de ser ajustadas. Quanto menor o tamanho de bolsas de gordura ovarianos em doadores mais jovens também precisam ser considerados.

Tal como acontece com qualquer método, existem algumas limitações do ensaio de transplante de almofada de gordura ovário mouse. Embora os ratos imuno-competentes singeneicas podem ser utilizados para murino primários células / tecidos, a técnica requer GFN ou ratinhos SCID para o transplante de material humano. É provável possível para humanizar a almofada de gordura para suportar o crescimento de células epiteliais humanas. No entanto, nós não testei essa abordagem ainda. Uso de Fe mais jovemos machos podem levar a custos mais baixos de reprodução; No entanto, os ratos fêmeas virgens maduras (com idade de 8 a 10 semanas) tem uma almofada de gordura maiores, permitindo assim que o transplante de amostras maiores. Finalmente, o pessoal do laboratório deve ser treinado em cirurgia animal para assegurar a execução oportuna e bem-sucedida do procedimento.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, para fornecer as células humanas HIO118. Estes estudos foram apoiados pelos subsídios do Programa de Stem Cell New York (NYSTEM; T028095) e os Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P50HD076210) para AFN, e pelas doações de NYSTEM (C028125, C024174 e T028095), National Institutes of / Instituto de Saúde Nacional do Câncer (CA182413) e Fundo Ovarian Cancer Research (327516) para AYN.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de calibre 25BD Becton Dickinson305122
agulha de calibre 28 (seringa hipodérmica com agulha acoplada)Kendall30339Número da peça: 8881500014
fator de crescimento básico de fibroblastos-2Sigma-AldrichF9786
matriz de membrana basal (Geltrex)Camundongos InvitrogenA1413202
β-actina-DsRedO Laboratório Jackson6051B6. Camundongos Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-actina-EGFPThe Jackson Laboratory3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-mercaptoetanolSigma-AldrichM7522
albumina bovinaSigma-AldrichA3311
clorofórmioVWREM-CX1058-1
colagenase/hialuronidaseCélula-tronco Tecnologias7912
frascos criogênicosThermo Scientific Nunc377267
dispase IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM's)Corning10-092-CV
DNaseI (Desoxirribonuclease I)Stem Cell Technologies7900
meio de incorporação para amostras de tecido congelado (OCT)Sakura Finetek4583
fator de crescimento epidérmicoSigma-AldrichE4127
etanol 200 provaKoptecV1001para preparar 70% 
soro fetal bovinoSigmaF4135
ponta de filtro 0.1-10/20 µ l XL USA Scientific1120-3810
FOXJ1 anticorpoeBioscienceE10109-1632usado na concentração 1:1.000 (sem desmascaramento)
hidrocortisonaSigmaH0135
KetoprofenoZoetis4396H
filme de laboratório (Parafilm M)American National CanPM-999
L-GlutaminaCorning25-005-Cl
insulina-transferina-sódio selenitoSigma-AldrichI884
isoflurano, 250 mlSanta Cruz Animal Healthsc-363629Rx
placa de fixação baixa 24 poçosCostar3473
MEM aminoácidos não essenciaisCorning25-025-Cl
moldes de histologia de metalMicroscopia Eletrônica CiênciasMicroscópio 62527-22
Eclipse TS 100invertido
estéreoNikonSMZ800
Nod/SCID/gama (NSG)The Jackson Laboratory05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
solução de paraformaldeído 16%Microscopia Eletrônica Sciences15710
parafina (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
PAX8 anticorpoProteintech10336-1-APusado na concentração 1:1.000 (sem desmascaramento)
PBS (solução salina tamponada com fosfato)Corning  21-030-CV
penicilina estreptomicinaCorning30-002-Cl
imunodeficiência combinada grave (SCID / NCr) camundongos, BALB / C fundo)NCI-Frederick Programa de Produção Animal01S11
piruvato de sódioCorning25-000-Cl
gel de processamento de espécime (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
sacaroseSigma-AldrichS0389
Tripsina-EDTA, 25%Corning25-053-Cl
, microscópio Nikon , camundongos

Referências

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