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Artigo de método

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

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DOI:

10.3791/54457

⸱

9 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Resumo

Em plataformas in vitro para estudar as células endoteliais e biologia vascular são largamente limitadas à cultura de células endoteliais 2D, câmaras de fluxo com o polímero ou com base substratos de vidro, e ensaios de formação de tubos à base de hidrogel. Estes ensaios, enquanto informativo, não recapitular geometria luz, matriz extracelular adequada, e proximidade multi-celular, que desempenham um papel-chave na modulação da função vascular. Este manuscrito descreve um método de moldagem por injeção para gerar vasos artificiais, com diâmetros da ordem de 100 mm. Microvasos são fabricados semeando células endoteliais em um canal microfluídico incorporado dentro de um tipo nativo I colágeno hidrogel. Ao incorporar nas células do parênquima dentro da matriz de colagénio antes da formação de canal, microambientes específicos de tecido podem ser modelados e estudados. modulações adicionais de propriedades e meios de comunicação hidrodinâmico composição permitir o controlo da função vascular complexa dentro do microambiente desejado.Essa plataforma permite o estudo de recrutamento perivascular de células, as interacções do sangue do endotélio, a resposta de fluxo, e as interacções de tecidos-microvascular. microvasos Engineered oferecer a capacidade de isolar a influência de componentes individuais de um nicho vascular e controlar com precisão as suas químicas, mecânicas e propriedades biológicas para estudar a biologia vascular na saúde e na doença.

Introdução

A microvasculatura em cada órgão ajuda a definir o microambiente tecido, manter a homeostase do tecido e regular a inflamação, a permeabilidade, a trombose, e fibrinólise 1,2. Endotélio microvascular, em particular, é a interface entre o fluxo de sangue e o tecido circundante e, por conseguinte, desempenha um papel crítico na modulação da função do órgão e vascular em resposta a estímulos, tais como as forças hidrodinâmicas e citoquinas e hormonas circulantes 3 ​​- 5. Compreendendo as interacções específicas entre o endotélio, o sangue, e o microambiente circundante do tecido é importante para o estudo da biologia vascular e a progressão da doença. No entanto, o progresso em estudar essas interações tem sido dificultada pela limitação em ferramentas in vitro que não recapitulam na estrutura microvascular vivo e função 6,7. Como resultado, o campo e avanço terapêutico tem se baseou fortemente em caro e tempo-consumir modelos animais, que muitas vezes não conseguem traduzir para o sucesso em seres humanos 8 - 10. Enquanto modelos in vivo são de valor inestimável no estudo dos mecanismos da doença e funções vasculares, eles são complexos e muitas vezes não têm controle preciso do indivíduo celulares, bioquímicos e biofísicos pistas.

Vasculatura por todo o corpo possui uma estrutura hierárquica madura em conjunto com leitos capilares expansivas, proporcionando perfusão otimizado e transporte de nutrientes simultaneamente 11. Inicialmente, as formas vasculatura como um plexo primitiva, que reorganiza a uma rede hierarquicamente ramificada durante o desenvolvimento precoce 12,13. Embora muitos dos sinais envolvidos nestes processos são bem compreendidos 14-16, permanece elusiva como tal modelação vascular é determinada 15. Por sua vez, recapitulando este processo in vitro para projetar redes vasculares organizados tem a abelhan. Muitas in vitro plataformas difíceis existentes para modelar vasculatura, tais como culturas de células endoteliais duas dimensões, não têm características importantes, tais como a proximidade de multi-celular, três luminal geometria dimensional, fluxo, e a matriz extracelular. Tubo de ensaios de formação em hidrogéis 3D (colágeno ou fibrina) 17 - 19 ou invasão ensaios 20,21 têm sido utilizados para estudar a função endotelial em 3D e suas interações com outros vasculares 17,22 ou de células do tecido tipos 23. No entanto, montados em lúmens estes ensaios não têm interconectividade, fluxo hemodinâmico, e perfusão adequada. Além disso, a propensão para a regressão vascular nestes ensaios de formação de tubo 24 evita a cultura a longo prazo e a maturação o que limita o grau de estudos funcionais que podem ser executadas. Assim, há uma necessidade crescente de engenheiro em plataformas in vitro de redes microvasculares que podem modelar adequadamente enendotelial características e são capazes de cultura a longo prazo.

Uma variedade de técnicas de engenharia vasculares têm surgido ao longo dos anos para aplicações médicas para substituir ou vasos de bypass afetados em pacientes com doença vascular. Vasos de grande diâmetro feitas de materiais sintéticos, tais como tereftalato de polietileno (PET), e politetrafluoroetileno (ePTFE) tiveram sucesso terapêutico considerável com permeabilidade longo prazo (média desobstrução de 95% mais de 5 anos) 25. Apesar de pequeno diâmetro enxertos sintéticos (<6 mm) geralmente enfrentam complicações como a hiperplasia da íntima e trombopoiese 26 - 28, da engenharia de tecidos enxertos de pequeno diâmetro feitos com material biológico fizeram progressos significativos 29,30. Apesar dos avanços desse tipo, vasos de engenharia em microescala mantiveram-se um desafio. Para modelar adequadamente a microcirculação, é necessário para gerar padrões de rede complexos com sufficiente de resistência mecânica para manter a desobstrução, e com uma composição da matriz que permite tanto a permeação de nutrientes para as células parenquimatosas e remodelação celular.

Este protocolo apresenta um romance rede de vasos perfusable artificial que imita um nativo in vivo configuração com um ajustável e controlável microambiente 31-34. O método descrito gera microvasos artificiais, com diâmetros na ordem de 100 um. microvasos engenharia são fabricados por perfusão células endoteliais através de um canal microfluídico que está incorporado dentro do tipo macio I colágeno hidrogel. Este sistema tem a capacidade de gerar redes estampados com estrutura luminal aberta, replicar interações multi-celulares, modular a composição da matriz extracelular, e aplicar forças hemodinâmicas fisiologicamente relevantes.

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Protocolo

1. Microfabricação de Patterned polidimetilsiloxano (PDMS) com Network Design

  1. De fabricação de wafer criar um modelo negativo do Projeto de Rede
    1. Criar um padrão de rede usando qualquer software assistida por computador (CAD). Certifique-se de que a dimensão diagonal entre a entrada e saída de acordo com a distância entre a entrada e saída reservatórios nos dispositivos da habitação em etapas futuras (ver 2.1.1).
      Nota: O desenho do padrão em si é personalizado de acordo com os objetivos da pesquisa específicas do usuário (veja a Figura 1, por exemplo, padrões).
    2. Gerar uma máscara do padrão de rede usando a impressão de alta resolução ou encomendar um photomask cromo de um fornecedor comercial. Um protocolo mais detalhado do processo de fotolitografia está disponível noutro local 35.
    3. Limpar um wafer 8 "de silício por 5 min a 100 W com tratamento de plasma de oxigênio.
    4. Despeje fotorresiste negativo o suficiente (SU-82.100 funciona bem) sobre a bolacha de tal modo que a formas resistir a uma dose com o diâmetro de 2,5 cm. Usando um aplicador de spin, girar o wafer a 500 rpm com 100 rpm rampa / seg e manter por 10 s. Em seguida, aumentar para 1.600 rpm com 300 rpm / seg e manter por 30 segundos. Nota: A velocidade e rampa precisam ser otimizados para cada condição de laboratório para produzir uma espessura resistir de 150 mm.
    5. Soft-coza a bolacha a 65 ° C durante 7 min, rampa até 95 ° C, com 360 ° C / h, e manter durante 45 min. Se arrefecer lentamente até à temperatura ambiente na placa quente. Imprimir o padrão de navio para o wafer revestido por exposição à luz UV 365 nm sob uma fotomáscara cromo, com a exposição triplo da recomendação do fabricante (350 mJ / cm 2 para uma SU-8 espessura de cerca de 150 mm).
      Nota: Desde SU-8 é um negativo resistir, as regiões expostas (tudo, exceto o design padrão) vai se tornar insolúvel para o desenvolvedor no passo 1.1.7.
    6. Hard-coza a hóstia exposta a 65° C durante 5 min e em rampa até 95 ° C, com 360 ° C / h e manter durante 25 min, em seguida, permitir que a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente na placa quente.
    7. Mergulhe o wafer em SU-8 desenvolvedor para 10 - 15 minutos para lavar não exposta resistir, em seguida, limpe com álcool isopropílico e seco sob um fluxo de nitrogénio comprimido. Inspeccionar o padrão sob um microscópio de luz para garantir o SU-8 resistir é bem ligado à bolacha (veja descamação e bolhas indesejáveis).
    8. Medir a espessura das características padrão utilizando um perfilómetro de acordo com as instruções do fabricante 36. Durante a aquisição de medição, evitar regiões de estrutura que são essenciais para a função da rede (isto é, entrada e condutas de saída) como um perfilómetro de contacto com base poderia comprometer a integridade estrutural das características modelado na bolacha. Como alternativa, use um método sem contato (ou seja, profilometer óptico) para evitar este problema completamente.
  2. Generação de modelado e Plano Moldes para Collagen Molding
    Nota: Pega silanos dentro de uma Cobertura de vapores químicos.
    1. Coloque a bolacha em um exsicador com 100 ul de tricloro (3,3,3-trifluoropropil) silano durante 2 horas a silanizar a superfície.
    2. Transferir wafer silanizada em uma praça de Petri 120 x 120 mm. Pour agente misto e desgaseificado PDMS elastómero e a cura (10: 1 w / w rácio) através da bolacha para atingir 4-6 mm de espessura. Despeje PDMS adicionais em um quadrado Petri prato separado 120 x 120 mm para gerar moldes planas, sem padrões. Cura a 65 ° C durante 2 h.
    3. Retirar do forno e permitir que o PDMS-se arrefecer até à temperatura ambiente. Usando um bisturi corte cuidadosamente uma praça em torno do SU-8 e, lentamente, retire o molde PDMS do wafer. Aparar bordos a 30 mm x 30 mm. Para moldes planas, corte PDMS curado sem um padrão impresso em pedaços quadrados cerca de 40 mm x 40 mm.

2. Dispositivos de habitação

  1. fabrication de superior e inferior da carcaça Pieces
    1. Fabricar recipiente que guarda usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA). Para fabricar, encomendar as peças de uma loja de máquina padrão com computador numéricos capacidades de moagem controlado (CNC). Ver Figura 1 para uma representação esquemática das peças superior e inferior.
    2. Design a peça superior da caixa (Figura 1D) para incluir uma 20 milímetros x 20 milímetros bem na parte inferior do dispositivo com uma profundidade de 1 mm, dois orifícios de injecção de colagénio (diâmetro de 4 mm) na parte superior do dispositivo localizado nos cantos do poço quadrado, dois reservatórios de entrada e de saída com um diâmetro de 6 mm, e quatro furos de parafuso (3 mm de diâmetro) nos quatro cantos do dispositivo.
      Nota: furos adicionais podem ser perfurados na periferia da peça para fins de manuseamento.
    3. Projetar a peça carcaça inferior (Figura 1E) para incluir um buraco quadrado no meio (dimensões 15 mm x 15 mm) com uma envolvente de 25 mm x 25 mmprateleira com uma profundidade de 0,25 mm. Broca 4 furos com 4-40 discussão. Garantir que os orifícios dos parafusos na parte inferior e superior peças vão alinhar juntos durante etapas de montagem futuras.

3. microvasos fabricação de dispositivos

  1. Preparação de Materiais
    1. Lavar e esterilizar dois conjuntos de pinças, uma espátula de aço inoxidável, uma chave de fenda plana pequena, parafusos de aço inoxidável, e vários passador pinos de aço inoxidável. Para a fabricação dos navios, também autoclave PDMS moldes micropatterned, PDMS quadrados planos, lamelas de vidro (22 x 22 mm), e pedaços de algodão.
    2. Esterilizar as peças PMMA habitacionais em lixívia por pelo menos 1 hora, depois lave com água autoclavada na capa de cultura de tecido duas vezes, e deixar secar ao ar em placas de cultura de tecidos estéreis (150 mm x 25 mm).
  2. Estéril Polietilenoimina-glutaraldeído (PEI - GA) Revestimento
    1. Tratar poços interiores de peças de PMMA secos esterilizadoscom plasma durante cerca de 1 min. Adicionar 1% de polietilenoimina (PEI) para os poços internos (os 20 mm quadrados bem na parte superior e a prateleira 25 milímetros quadrados) na parte inferior das peças de PMMA durante 10 min. Lavar com H2O estéril e deixar secar no capuz de cultura de tecidos.
      Nota: O tempo necessário para o tratamento com plasma é variável, dependendo do dispositivo utilizado - o PEI devem espalhar-se facilmente que indica uma superfície hidrofílica. Se não, tratamento de plasma adicional pode ser necessário.
    2. Aplicar 0,1% de glutaraldeído (GA) em PEI tratada superfícies das peças de PMMA durante 30 min. Lavar duas vezes com água esterilizada e deixar secar.
      Nota: Em etapas futuras, o colágeno vai aderir à superfície revestida através de crosslinking de colágeno com glutaraldeído. Isto ajuda a proteger o gel no seu lugar dentro do dispositivo durante os passos de montagem e futuras ao longo do período de cultura dispositivo.
  3. Colágeno Gel de Preparação
    1. Fabricar navios que utilizam 0,6% - colágeno 1%soluções. Para tornar a 0,75% de colágeno para a fabricação de navio, misture colágeno tipo I solução-mãe (1,5% - isolado do rato caudas 37) com hidróxido de sódio (NaOH), 10x de mídia Supplement (M199) e meios de cultura celular. Mantenha todas as soluções em gelo.
    2. Determinar o volume de colagénio pela seguinte equação, em que V ƒinal é o volume final de gel requerido (geralmente, 1 ml de colagénio por dispositivo é suficiente), colagénio da V é o volume de colagénio estoque necessário, colagénio estoque C é a concentração colagénio do banco de colagénio e C ƒinal é a concentração desejada do colagénio no recipiente.
      figure-protocol-1
    3. Usando uma seringa de 1 ml para transferir o volume apropriado de colagénio de estoque para um novo tubo de 30 mL cónico. Determinar os volumes de NaOH neutralizante (V NaOH), M199 10x suplemento media(V 10 X), e meios de cultura celular (1 V X) da seguinte forma e misturar separadamente num tubo de 15 ml:
      figure-protocol-2
    4. Adicionar a mistura de reagentes de neutralização (10 V X, NaOH V, V 1 X) para o colagénio alíquota, e usar uma pequena espátula para misturar suavemente a solução até que um gel homogénea. Evitar a introdução de bolhas por agitação lenta e suavemente.
    5. Para incorporar as células dentro da matriz para a concentração desejada (por exemplo, 0,5 - 20 milhões de células / mL), adicionar as células à solução de colagénio depois de ser misturado com os reagentes de neutralização, e continuar a agitar até que as células são distribuídas homogeneamente.
    6. Quando as células são adicionados, ajustar o volume de meios de cultura de células para acomodar o volume adicional, tal como determinado pela equação seguinte, em que as células V </ sub> é o volume necessário de suspensão de células, a densidade celular ƒinal C é a densidade de células desejada no recipiente, a densidade da suspensão de células C é a densidade de células na solução estoque.
      figure-protocol-3
  4. Injeção de colágeno - parte superior
    1. Coloque o molde PDMS micropadronadas em 100 mm x 20 milímetros prato. Plasma limpar o molde PDMS durante 1 min.
    2. Alinhar a peça de PMMA superior no topo do molde de PDMS de modo que os reservatórios quadrados no molde estão directamente sob os reservatórios de entrada e de saída (ver Figura 1D - linhas tracejadas). Coloque as cavilhas de aço inoxidável para a entrada e saída buracos reservatório no topo da peça PMMA para manter o acesso claro a partir dos reservatórios para o padrão.
    3. Usando uma seringa de 1 ml para extrair ~ 0,5-0,6 mL de colagénio. Certifique-se de que não há bolhas permanecem na seringa.
    4. Pressione lightly com uma pinça sobre o alojamento superior para garantir o contato nivelada entre o topo peça e do molde PDMS. Injetar colágeno lentamente através de uma porta de injecção no topo da peça PMMA. Verifique se o colágeno preenche o domínio 20 mm x 20 mm acima do padrão e não vazar.
    5. Feche o prato sem empurrando os pinos de guia e permitir ao gel num incubador 37 ° C durante 30 min.
  5. Injeção de colágeno - parte inferior
    1. Coloque uma lamela de vidro 22 x 22 mm no centro da peça de fundo. Usando uma seringa de 1 ml para dispensar ~ 0,25 ml de colagénio uniformemente sobre a lâmina de vidro. Abaixe o PDMS quadrado plano sobre o colágeno, garantindo o PDMS é plana contra o PMMA e não há bolhas de ar. Deixa-se gel a 37 ° C durante 30 min.
  6. conjunto de dispositivo
    1. Depois de a gelificação, adicionar suficiente PBS em torno do pedaço de PDMS plana na parte inferior para envolver o PDMS (cerca de 1 ml). Use uma pinça para remover qualquer ecolágeno XCESS em torno das bordas, e, lentamente, retire a peça PDMS. Adicionar mais PBS no topo do colagénio para manter a hidratação.
    2. Para preparar a parte superior, use uma pinça para pegar a peça superior PMMA e lançá-lo de forma que o molde PDMS está no topo. Adicionar algumas gotas de PBS para a interface, em seguida, rapidamente e firmemente remover o molde PDMS da peça superior de PMMA.
    3. Remova cuidadosamente cavilhas de aço inoxidável do outro lado da PMMA habitação usando outro par de pinças. Adicionar mais alguns gotas de PBS sobre o colágeno micropadronadas. Virar a peça superior PMMA de forma que o colágeno está voltado para baixo e coloque 4 parafusos nos furos de canto.
    4. Cuidadosamente, coloque a parte superior na parte superior da peça da base, alinhando os parafusos com os furos de canto da parte inferior. Não permitir que as duas peças para deslizar uma contra a outra. Use uma chave de fenda para apertar os parafusos com um toque suave. Não aperte demais.
    5. Aspirar o PBS em torno das superfícies de PMMA e coloque uma pequena piECE de algodão sob uma extremidade do dispositivo. Com uma pipeta, remover qualquer PBS dos reservatórios e substituir com meios de cultura celular. Permitir que o dispositivo gel juntos numa incubadora a 37 ° C durante pelo menos 1 h.
  7. Sementeira celular
    1. Culturas de células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs) em meio de crescimento endotelial, a 37 ° C (CO 2, O 2) até à confluência 38. Sempre que possível, use entre as passagens 4 e 7.
    2. Tripsinizar as células endoteliais por lavagem do frasco de cultura com 6 ml de PBS e, em seguida, adição de 2 ml de tripsina a 0,05% a 37 ° C para dissociar as células. Deixar as células em tripsina até que a maioria das adesões focais foram destacadas e as células são arredondados para cima (isto normalmente leva cerca de 2-3 minutos). Parar a reacção por adição de tripsina de 4 ml de meio de crescimento endotelial contendo soro fetal de bovino (FBS). Lavar o balão com os meios de comunicação várias vezes para assegurar que as células são separadas do balão e recolhernum tubo cónico.
    3. Contar as células utilizando um hemocitómetro e ressuspender-los a uma densidade de 10 milhões de células por ml. Remova toda a mídia de cultura de células de entrada e saída reservatórios. Utilizando uma ponta de 200 ul de carregamento de gel, adicionar 10 ul de suspensão de células no centro do reservatório de entrada. As células devem começar a fluir para dentro da rede de imediato e o revestimento da rede.
    4. Adicionar 200 ul media igualmente a ambos os reservatórios e deixar células anexar e espalhar dentro da rede por pelo menos 1 hora.
  8. Cultura dispositivo
    1. Cultura o dispositivo com o fluxo impulsionado gravidade através da rede por adição de 200 ul de meio de cultura celular para o reservatório de entrada e de 50 ul para o reservatório de descarga. Com este método de cultura, substituir todos os meios de comunicação 12 h para manter a viabilidade endotelial.
      Nota: Se as condições de cultura de fluxo contínuo são desejáveis ​​(para manter a tensão de cisalhamento constante, recolha de mídia na saída, etc.) a syrbomba de Inge pode ser usado em vez de cultura orientada gravidade.
    2. Permitir que as células endoteliais semeadas pelo menos 24 horas para prender e estabilizar antes de aplicar fluxo contínuo. Antes da configuração de fluxo contínuo, manter os dispositivos com as condições de fluxo dirigido por gravidade.
      NOTA: As condições de mídia para fluxo aplicada diferem de cultura impulsionada gravidade. A adição de um expansor de plasma, tais como dextrano, para a mídia estabiliza os microvasos engenharia e impede o colapso vascular durante a perfusão sustentada 39.
    3. Para tornar a mídia para a configuração de fluxo contínuo, dissolver 3,5% dextrano (70 kDa) em meio de crescimento endotelial para a cultura ideal navio. Utilizando uma técnica asséptica, encha 10 ml seringas com meios de crescimento endotelial com 3,5% de dextrano.
    4. Prepara-se uma placa de cultura estéril de fluxo por fusão furos na parede lateral de uma placa de Petri, utilizando um ferro de soldar.
    5. Encaixe 12 "tubo de silicone (1/32" ID) a um acoplamento de bloqueio Luer (Feminino, 1/16 "ID), e um 1 /16 "a conector tubo-a-tubo com um" segmento de tubo na outra extremidade. Inserir uma "agulha cega 20G (independente a partir do cubo de agulha) para a extremidade livre do 1" quarto segmento. Também se preparar um "segmento 3 do tubo ligado a um 90 ° conector articulação do cotovelo de tubo-a-tubo (para ser montado na entrada da caixa). Nos passos subsequentes, o tubo já não vai ser enfiada através do prato preparado e ligado ao 3 "segmento através da agulha G 20. tubulação de saída deve espelhar tubo de entrada, com uma extremidade livre, em vez de um acoplamento de bloqueio Luer. Autoclave todos os segmentos anteriores ao uso.
    6. Rosca de entrada autoclavados e tubulação de saída através de buracos no prato preparado. Anexar 3 "segmentos a 20 g de agulhas internas. Fixe o acoplamento de bloqueio Luer à seringa cheia de media e perfundir media através do tubo usando a bomba de seringa definida com um caudal elevado. Assegure-se que não há bolhas na tubulação ou conectores, uma vez que estes irão impedir o fluxo para o vaso.
    7. Insira o connector conjunta na entrada da habitação. Definir a bomba de seringa para a taxa de fluxo desejada e começar a perfusão.
      NOTA: Este pode ser ajustado, dependendo da geometria do vaso e das condições experimentais de tensões de cisalhamento aplicadas. Para um canal de 100 um de diâmetro, uma velocidade de fluxo de 3 mL / min funciona bem.
    8. Se desejar, recolher perfusato com tubulação de saída preparado inserido em um estéril 5 ml de poliestireno tubo de fundo redondo contendo 500 mL de mídia.
      Nota: Uma pequena quantidade de material é adicionado ao tubo de recolha para evitar a formação de bolhas que podem bloquear o fluxo.
    9. Dependendo da taxa de fluxo, a seringa pode ter de ser recarregado após 24 a 36 h. Isto é feito através da remoção do conector a partir da entrada do invólucro, a substituição da seringa, e meios permitindo a perfundir a uma taxa de fluxo elevada durante vários minutos. Esta sequência assegura que as bolhas não são introduzidas para a tubagem. Redefinir a bomba para a vazão desejada para a cultura, inserir o conector na entrada da habitação, evoltar para a incubadora.

Análise 4. Dispositivo

  1. Análise permeabilidade
    1. Use de 40 kDa FITC-dextrano para visualizar a permeabilidade do vaso in situ. Colocar o recipiente que guarda a um microscópio confocal e focar no plano navio. Adicionam-se 5 jiM de 40 kDa FITC-dextrano para a entrada e a imagem de uma ampliação de 4X, 25 o tempo de exposição mseg, e em um quadro por segundo durante 10 min.
    2. Analisar a série de imagens com o código de análise para estimar a permeabilidade de dextrano através da parede do recipiente para o colagénio (pM / seg) com base em um modelo publicado por Zheng et. ai. 31.
  2. Análise imunocoloração & Imagem Confocal
    1. Para corrigir navios, perfundir com formaldeído a 3,7% através da entrada durante 20 minutos e lavagem por perfusão PBS três vezes (20 minutos por lavagem). Bloco de ligação não específica do anticorpo com 2% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5% de Triton X-100 PErfused através da rede durante 1 h. Perfundir soluções de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C e lava-se três vezes com PBS. Perfundir soluções anticorpo secundário durante 1 - 2 h, e lavar novamente com PBS, do mesmo modo.
    2. Captar imagens de imunof luorescência de microvasos in situ utilizando um microscópio confocal com um passo de Z-1? M. Imagem microvasos com uma ampliação de 4X, 10X ou 20X.
      Nota: Ampliação de 4X irá fornecer informações globais estrutura de rede, enquanto 10X e 20X imagens ampliadas irá fornecer detalhes celulares, tais como alongamento, formação de junção, etc.
    3. Analisar as pilhas de imagens usando ImageJ com as projeções Z (imagem / / Z-projeto Stacks), secções transversais (Imagem / vista Pilhas / Orthogonal) e reconstruções 3D (Imagem / Pilhas / Projeto 3D).
  3. Microscopia Eletrônica de Varredura de imagem
    1. Para a análise de microscopia eletrônica, reparo in situ por perfusão meia-força sol de Karnovskybuição (2% de paraformaldeído / glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato 0,2 M) durante a noite. Desmontar o vaso e separar cuidadosamente os dois pedaços. Aparar arestas e mergulhar completamente na solução fixadora por vários dias.
    2. Imergir a porção superior espessura do navio em 25% de glutaraldeído, durante 20 minutos e lavar três vezes com PBS (2 min cada). Desidratar em lavagens de etanol em série de 50%, 70%, 85% (2 min cada) e duas lavagens em etanol a 100% (5 min cada).
    3. Preparar a amostra para análise com uma maior desidratação por secagem ponto crítico seguindo o protocolo do fabricante 40. Por pulverização catódica, revestimento do vaso de ouro-paládio (7 nm) e analisar sob um microscópio eletrônico de varredura, com uma tensão de aceleração de 5 kV, tamanho do ponto 3.

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Resultados

O navio-plataforma projetada cria microvasculatura funcional incorporado dentro de um tipo natural de colágeno I matriz e permite um controlo apertado do ambiente celular, biofísicos e bioquímicos in vitro. Para fabricar microvasos modificadas, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) são perfundidos através da rede microfluídicos embebidos em colágeno onde se fixam para formar um lúmen de patentes e endotélio confluentes. Como ilustrado na Figura 1A-C,

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Discussão

Engineered microvasos são um modelo in vitro onde as características fisiológicas, tais como a geometria do lúmen, as forças hidrodinâmicas, e interacções multi-celulares estão presentes e sintonizável. Este tipo de plataforma é poderosa na medida em que oferece a capacidade para modelar e estudar o comportamento endotelial numa variedade de contextos em que as condições de cultura in vitro podem ser combinados com a do microambiente em questão. Por exemplo, os mecanismos de condução processos endoteli...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer a Lynn e Mike Garvey imagem Laboratório do Instituto de Células Estaminais e Medicina Regenerativa, bem como o Mecanismo de Washington Nanofabricação da Universidade de Washington. Eles também agradecem o apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde concede DP2DK102258 (para YZ) e formação concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fabricação de Wafer
Sistema de Plasma AutoGlowAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc PWM32 Revestidor de Rotação
Alinhador de contato ABMAB-M
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 DesenvolvedorMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8" waferde silício Wafer World Inc.
Gerador de Micro Padrão de MesaHeidelberg Instrumentsμ PG 101Para geração de fotomáscara
Placa quenteVWR97042-646
Álcool ispropílicoAvantor Performance Materials9088
Placas de Petri (120 x 120 mm, quadradas)Sigma-AldrichZ617679
Tricloro(3,3,3-trifluoropropil)silanoSigma-AldrichMKBG3805V
Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de curaDow CorningSylgard 184Misturado a 10:1 (p/p)
Dessecador a vácuoForno Sigma-AldrichZ119024-1EA
VWR9120976
Fabricação e cultura de dispositivos
poli(metacrilato de metila) (PMMA)Plexiglas
Corona TreaterProdutos Electro-Technic, Inc.BD-20Dispositivo portátil para tratamento de plasma de dispositivos PMMA e moldes PDMS
Ferro de SoldaWeller Parafuso de
McMaster-Carr 91785A096
Pinos de aço inoxidávelMcMaster-Carr 93600A060
Pinças Miltex24-572Qualquer pinça semelhante pode ser usada
Espátula (Micro Colher)Serviços de Microscopia Eletrônica62410-01
ChaveQualquer chave de fenda de cabeça chata pode ser usada, autoclavada
Lamínulas de vidro (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
AlvejanteClorox4460030966 placas de
Petri (150 x 25 mm)Corning430599
placas de Petri (100 x 20 mm)Corning2909
Algodão, cortado em pedaçosautoclavada
(PEI)Sigma-AldrichP3143Diluir a 1% em água de grau de cultura de células
GlutaraldeídoSigma-AldrichG6257Diluir a 0,1% em água
de grau de cultura de célulasEsterilizado H2ODI autoclavado H2O
Colágeno tipo I, dissolvido em ácidoIsolado de caudas de rato conforme descrito em Rajan et. al. 2006 (ref #37)
Seringa de 1 mlBD309659
seringa de 10 mlBD309604
tubos cônicos de 15 mlCorning352097
Tubos cônicos de 30 mlCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 N NaOH (estéril)Sigma-Aldrich415413Diluir para 1 N em água de grau de cultura de células
HUVECsLonza
Meios de crescimento endotelialLonzaCC-3124
TripsinaCorning25-052-CI
Soro fetal bovino (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Dextrano de Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Corning21-031-CV
HemocitômetroHausser Scientific Co.3200
Pontas de carregamento de gelVWR37001-152
18 G Agulha de enchimento sem corteBD 305180
20 G Agulha de Dispensação de Aço InoxidávelMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, Tubulação de Silício OD 3/32"Cole-ParmerEW-95702-00
Acoplamento Tubo-a-tubo de 1/16"McMaster-Carr5116K165
90° Conectores de Cotovelo, Tubo-a-TuboMcMaster-Carr5121K901
Luer Lock Coupling (Fêmea, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Fórceps de Plástico, com Garras de Mandíbula Serviços deMicroscopia Eletrônica72971
Bomba de Seringa DuplaHarvard Apparatus70-4505
5 ml Poliestireno Tubo de fundo redondoFisher Scientific14-959-2A
Device Analysis
FormaldeídoSigma-AldrichF8775
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Rabbit anti-hCD31Abcamab32457diluição
de trabalho 1:25Anticorpo conjugado FITC anti-von Willebrand FactorAbcamab88221:100 anticorpo
secundário anti-coelho 568 de cabraThermofisher ScientificA-110111:100 diluição de trabalho
HoeschtThermofisher ScientificH1399Ressuspenso em DMSO
Cacodilato de sódio Sigma-AldrichC0250Para fazer tampão de cacodilato de 0,2 M
EtanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa Dextran conjugado com FITCSigma-AldrichFD40S 
adicionais  < / strong >
CHIR-99021Selleck ChemS2924Inibidor de GSK-3 de molécula pequena
VEGF recombinante humanoPeprotech100-20
bFGF recombinante humanoPeprotechAF-100-18B
Base de elastômero Máquina Ranurado de Cabeça de Truss de Aço Inoxidável WTCPS de fenda de 1 cm x 3 cm Polietilenoimina acético a 0,1%

Referências

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