Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

Resumo

Este protocolo mostra como realizar microinjeção citoplasmática em zigotos de animais de fazenda. Essa técnica pode ser usada para fornecer qualquer solução ao embrião de uma célula, como ferramentas de edição de genoma para gerar animais nocauteados.

Resumo

A microinjeção citoplasmática em embriões unicelulares é uma técnica muito poderosa. Por exemplo, permite a entrega de ferramentas de edição de genoma que podem criar modificações genéticas que estarão presentes em todas as células de um organismo adulto. Também pode ser usado para fornecer siRNA, mRNAs ou anticorpos bloqueadores para estudar a função do gene em embriões pré-implantação. A técnica convencional de microinjeção de embriões usada em roedores consiste em uma micropipeta muito fina que penetra diretamente na membrana plasmática quando avançada no embrião. Quando essa técnica é aplicada a animais de criação, geralmente resulta em baixa eficiência. Isso ocorre principalmente porque, em contraste com camundongos e ratos, os zigotos bovinos, ovinos e suínos têm um citoplasma muito escuro e uma membrana plasmática altamente elástica que dificulta a visualização durante a injeção e a penetração da membrana plasmática. Neste protocolo, descrevemos um método de microinjeção adequado para a entrega de soluções no citoplasma de zigotos bovinos que provou ser bem-sucedido também para embriões de ovinos e suínos. Primeiro, um laser é usado para criar um buraco na zona pelúcida. Em seguida, uma micropipeta de vidro de ponta romba é introduzida através do orifício e avançada até que a ponta da agulha atinja cerca de 3/4 do embrião. Em seguida, a membrana plasmática é rompida por aspiração de conteúdo citoplasmático dentro da agulha. Finalmente, o conteúdo citoplasmático aspirado seguido pela solução de interesse é injetado de volta no citoplasma embrionário. Este protocolo tem sido usado com sucesso para a entrega de diferentes soluções em zigotos bovinos e ovinos com 100% de eficiência, lise mínima e taxas normais de desenvolvimento de blastocistos.

Introdução

microinjecção citoplasmática de embriões de 1 célula é uma técnica muito potente. Ele pode ser usado para a entrega de qualquer solução para o embrião com, por exemplo, produzir gene knock-out para estudar a função do gene ou para gerar animais editado por genes. Zigotos de animais de exploração agrícola mais relevantes têm uma composição de ácidos graxos muito elevado que faz com que seu citoplasma opaco e escuro ^1. Eles também têm uma membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características fazem microinjeção usando pronuclear injeção convencional / citoplasmática como usado em espécies de roedores desafiadoras e muitas vezes imprecisas.

Microinjecção citoplasmática tem vantagens sobre microinjecção pronuclear, uma vez que é mais fácil de executar e também causa menos danos para os embriões injectados, resultando em maior viabilidade ^2. O objetivo geral deste protocolo é demonstrar um método bem sucedido para a entrega de soluções para o citoplasma de zigotos de animais de exploração. Para ser capaz de realizarmicroinjecção citoplasmática com alta eficiência em embriões de gado, é usado um laser para gerar um furo na zona pelúcida (ZP) e então, uma agulha de extremidade romba de vidro é usado para a microinjecção. Esta estratégia visa reduzir os danos mecânicos impressa no embrião durante a injeção. Em seguida, o conteúdo citoplasmático de aspiração no interior da agulha de injecção permite a quebra eficiente e confiável do PM assegurar que a solução é fornecida para dentro do citoplasma do embrião.

Esta técnica já sido utilizado com sucesso em embriões de bovinos para entregar siRNA para o citoplasma zigótica ^3,4 e para gerar mutações que utilizam as repetições curtas em cluster regularmente interespaçadas palindrómicos (CRISPR) / CRISPR associada do sistema 9 de sistema (Cas9) ^5. É igualmente apropriado (com pequenas modificações) para injetar bovina oócitos inclusos-cumulus ^6. Aqui, descrevemos nosso protocolo de injeção de entregar um corante, que podem ser aplicáveis ​​a injeção de qualquer dessolução Ired no zigoto, e mostrar que usando esta técnica provoca lise mínima e não afeta o desenvolvimento embrionário precoce.

Protocolo

1. Micropipeta Produção

1. micropipeta Injection
   1. Coloque um capilar de vidro de borossilicato (diâmetro externo (OD): 1,0 mm, diâmetro interior (ID): 0,75 mm) num puxador de micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo.
   2. Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa seringueiro. (Exemplo: Calor: 825; Pull: 30; Velocidade: 120; Tempo: 200; Pressão: 500).
   3. Remova cuidadosamente as pipetas puxados a partir do dispositivo e colocá-lo em um microforge em uma posição horizontal.
   4. Traga a pipeta puxado e o filamento aquecedor microforge com a sua conta de vidro em foco. Utilizar o retículo ocular para medir a espessura desejada e mover a pipeta horizontalmente até que o filamento de aquecimento atinge o diâmetro interno alvo (5 uM).
   5. Ajustar a aquecer a cerca de 45% e suavemente trazer a pipeta para baixo de modo que toque o filamento. Ativar o aquecedor brevemente. este wderreter doente ligeiramente a pipeta de modo que adere ao filamento e depois do arrefecimento, a pipeta vai quebrar no ponto de contacto gerar um corte a direito.
      Nota: Definir a temperatura apropriada é fundamental neste passo desde que as temperaturas demasiado elevadas fará com que a curva da pipeta e, portanto, um corte rectilíneo não será possível e temperaturas muito baixas, não será suficiente para derreter a pipeta (Figura 1A).
   6. Fazer um ângulo de aproximadamente 30 ° perto da ponta da pipeta, posicionando-o a cerca de 10 uM de distância a partir do filamento de aquecimento. Ajustar a temperatura para 60% e activar o aquecedor.
      Nota: Este irá dobrar a pipeta sobre o filamento. Este ângulo é desejada para que a ponta da agulha é paralela à superfície da placa de injecção, quando montado no injector (Figura 1B).
   7. Lidar com pipetas de microinjeção com cuidado, pois eles são extremamente afiada e frágil.
2. segurando micropipeta
   1. Coloque um borosiliccomeu capilar de vidro (OD: 1,0 mm ID: 0,75 mm) em um extrator micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo.
   2. Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa, mesmo cone e paredes paralelas (Exemplo: Calor: 815; Pull: 20; Velocidade: 140; Time: 175; Pressão: 200).
   3. Remova cuidadosamente a pipeta puxado a partir do dispositivo extrator e colocá-lo no porta-microforge em uma posição horizontal. Ajuste o foco no filamento aquecedor e pipeta.
   4. Utilizar o retículo ocular para medir o diâmetro da pipeta e mover a pipeta até que o seu diâmetro ao longo do filamento alcança de 180 um.
   5. No tamanho indicado, marcar o capilar de vidro, com uma caneta de ponta de diamante, em seguida, pressione suavemente na ponta puxou para quebrar o vidro. Isso deve resultar em um corte reto (Figura 1C).
   6. Mover a pipeta para uma posição vertical, com a sua ponta estreita para o filamento. Regule a temperatura do microforge a 60%.
   7. Fire-polonês a ponta da pipeta usando técnicas padrão ⁷ até que esta atinja um ID de 40 uM. Use o retículo ocular para verificar o ID (Figura 1D).
   8. Faça um ângulo na pipeta.
      1. Traga a pipeta de volta para uma posição horizontal cerca de 10 um para longe do filamento e 5 mm de distância da sua ponta. Ajustar a temperatura para cerca de 60% e activar o aquecedor para dobrar a pipeta sobre o filamento. Continuar o aquecimento, até um ângulo desejado (de cerca de 30 ^°) é alcançado. Verifique o ângulo visual (Figura 1E).
         Nota: A pipeta é normalmente montado à microinjector com um ângulo aproximado de 60 ^° em relação ao fundo do prato por injecção. A ponta da pipeta é dobrada de modo que é paralela à parte inferior do prato, que é necessário para a correcta injecção do embrião no seu plano médio.

le "> 2. Setup Micromanipulator

1. Verifique se as microinjetores são totalmente carregado com óleo e que não há bolhas de ar no sistema (bolhas no microinjetor impedir que o controle fino da injecção).
2. Verifique se os micromanipuladores estão na posição central. Isto irá permitir a uma ampla gama de movimento das pipetas.
3. Insira a pipeta segurando no suporte micromanipulador da esquerda e da pipeta de injeção no suporte micromanipulação direita.
4. Deixe o óleo entrar nas pipetas por capilaridade e verificar se o sistema está funcionando corretamente, movendo óleo cima e para baixo dentro da pipeta usando os controles microinjetor.
   Nota: Se não houver nenhuma circulação do óleo dentro das agulhas, pode haver uma obstrução. Neste caso, usar uma agulha nova.
5. Use os controlos micromaniplador para trazer as pipetas para o centro do campo do microscópio de vista. Usando uma ampliação de 4X, verifique se as dicas micropipeta estão no ângulo correto (parallel para a parte inferior do prato).
   Nota: Uma configuração correcta das agulhas é a chave para uma injecção de sucesso e resultados para a consistência.
6. Calibrar o sistema de laser seguindo o manual de calibração do fabricante.

3. Preparação do prato de injecção (Figura 2)

1. Coloque uma gota de 50 ul de aquecido (37 ° C) SOF-HEPES (composição detalhado na secção de materiais) suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS) no centro da tampa de uma placa de petri de 100 mm. Coloque um 1 - 2 ul gota da solução a ser injectada próximo da gota injecção. Certifique-se de que os embriões não arrefecer abaixo RT.
   Nota: Neste protocolo, irá adicionar o corante Dextran-Vermelho para a solução de injecção para ser capaz de visualizar o local da injecção e segui-lo mais tarde.
2. Cobrir as gotas na placa de injecção, utilizando aproximadamente 10 ml de óleo mineral.
3. Colocar o prato de injecção na fase do microscópio invertido e trazer o PIPEttes na gota injecção. Verifique se as agulhas estão no foco dentro da gota. Ajustar a sua altura conforme necessário usando os controles micromaniplador.
4. Usando uma micro-distribuidor, carregar cerca de 20 - 30 zigotos (17-20 horas pós-fertilização (HPF)) no lado superior da gota injecção. Realizar a injecção à temperatura ambiente de modo que o número de embriões na queda de injecção é determinada pela velocidade à qual a pessoa pode injectar-los. Não carregue mais embriões do que os que podem ser injetadas em 30 min.
   1. Para carregar os embriões em no micro, pressionar o êmbolo totalmente e mergulhe a ponta na solução contendo os embriões. Tocam os embriões para ser apanhada com a ponta do capilar de vidro (um de cada vez) e liberam lentamente o êmbolo de modo que cada embrião entra no capilar. Repita este procedimento até todos os embriões são apanhados ou a capacidade de micro-distribuidor está cheio.
   2. Para liberar os embriões carregados, pressionar o êmbolo suavemente até que todo o volume de containing os embriões é liberado do capilar.

4. microinjeção

1. Usando o objectivo 4X, carregar a solução a ser injectada para a pipeta de injecção por aplicação de pressão negativa (aspiração). Coloque solução suficiente para injetar 2 - 3 zigotos. Em seguida, passar para a queda de injeção.
2. Dentro da gota injeção, mover a pipeta segurando para que a ponta fica perto de um zigoto. Aplique pressão negativa (aspirado) com o microinjetor exploração de modo que o zigoto fica fixo para a pipeta holding e mudança para um objetivo 20X.
3. Uma vez que o zigoto está ligado à pipeta de exploração, verificar a sua qualidade utilizando a pipeta de injeção para mover suavemente o embrião ao redor sem separá-la. A qualidade zigoto bom deve ter os dois corpos polares (embora, por vezes, apenas um é visto) e um citoplasma homogêneo. Não injectar zigotos anormais (Figura 3A).
4. Se necessário, reposicionar o embrião para uma injecção adequadalocalização. Um bom posicionamento seria aquele em que existe um espaço entre a ZP e o PM, de modo que o PM não seja danificada pelo laser.
5. Verificar que a pipeta de injecção está posicionado no plano médio do embrião tocando suavemente o zigoto no local da injecção. Se ele não está no seu plano médio, a agulha irá tendem a fazer rodar o embrião em vez de punção. Ajustar a altura da pipeta de injecção conforme necessário.
6. Fazer um buraco na ZP usando um laser (Figura 3B).
   1. Utilizando software lugar do laser, a retícula de laser na ZP onde o furo vai ser feita (no lado oposto ao onde o embrião está ligado à pipeta de exploração). Usando a janela, clique em controle de laser sobre o botão de fogo. Certifique-se de que o tamanho do orifício é suficientemente grande para criar uma abertura no ZP para a agulha para passar através sem danificar o PM (Exemplo: 0,662 ms de largura de impulso / 6,9 uM O tamanho do orifício).
7. Passe a agulha de injeçãoatravés do orifício na ZP e fazer contato com a PM. Continue a empurrar a pipeta para a frente até que a agulha é ¾ da forma para o embrião (Figura 3C).
8. Observar a posição do menisco na interfase solução de óleo, tal como este será utilizado para controlar o volume de injecção consistente.
9. Aplicar pressão negativa (aspiração) na pipeta de injecção, o que irá resultar em PM e citoplasma sendo aspirado para a agulha de injecção. Continuar até que o movimento do citoplasma para dentro da agulha ou acelera quando o conteúdo citoplasma misturando-se com uma solução de injecção pode ser visto. Estes irão indicar a ruptura da PM (Figura 3D).
10. Injectar de volta o conteúdo citoplasmático seguido da solução para dentro do citoplasma do zigoto pela aplicação de pressão positiva (que se injectam), até que o menisco na interfase solução-óleo tem avançado diâmetro equivalente de um zigoto passado o ponto de partida.
    Nota: Nas nossas condições, este representa cerca de 7 pl de solução injectada (Figura 3E).
11. Mudar para um objectivo 4X e mover o injectado embrião / s para o lado de baixo da gota de injecção. Liberar o embrião através da aplicação de pressão positiva sobre o microinjetor exploração. Manter os embriões não injectados no lado superior e os injetados no lado inferior da queda para ajudar a manter o controle dos embriões injetados / não-injetado e trabalhar de forma eficiente.

5. Embrião de recuperação e Injeção Resultados

1. Adicione 3 gotas de cerca de 200 ul numa nova placa com pré-aquecido SOF-HEPES. Recolher os embriões injectados utilizando uma micro-distribuidor (como descrito acima). Lavar os embriões injectados movendo-os através do SOF 3-HEPES gotas.
2. Conte os embriões lisadas durante a microinjeção e descartá-las.
   Nota: Um zigoto lisadas podem ser facilmente distinguidos a partir de um único intacta desde o primeiro aparece translúcido, preencher toda a ZP, e, geralmente, tem citoplasmáticateor de vazamento para o exterior do embrião.
3. Opcionalmente, verificar a eficiência microinjecção utilizando um microscópio de fluorescência. Esteja ciente de que a exposição à luz UV pode induzir danos embrião que pode afetar o desenvolvimento subsequente.
4. Grupos de cultura de 25 embriões injectados em 50 gotas ul de meio simplex optimização de potássio (KSOM) suplementado com 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em óleo mineral a 38,5 ° C, 5% CO ₂ em ar, e humidade de saturação.
5. Suplementar o meio de cultura com 5% de FBS dois dias após a injecção.
6. Verifique blastocisto (BL) taxas de 7 dias após a injeção. Calcular as taxas de BL como o número total de embriões de blastocisto / número total de embriões cultivados em que a queda.

Resultados

Microinjecção citoplasmática assistida por laser é um protocolo potente e fiável para fornecer soluções para o citoplasma de zigotos de gado. A Figura 3 mostra um esquema geral dos zigotos, antes e depois da injecção, bem como o contorno geral da técnica. Dextrano-vermelho é usado como injeção de solução para permitir site de rastreamento de injeção e injeção de eficiência e precisão. O sucesso da entrega a solução está ilustrada na Figura 4 que mostra u...

Discussão

A microinjecção de zigotos é um método bem estabelecido para a introdução de soluções em embriões de mamíferos. Com algumas variações dependentes das espécies e o objectivo da experiência, esta técnica pode ser usado de forma ampla. Mostramos como executar microinjecção intracitoplasmática usando um laser para ajudar na entrada de uma micropipeta de extremidade romba. Os zigotos de algumas espécies animais (tais como gado bovino, ovelhas, e porcos) têm um citoplasma escuro, dificultando a visualização da pipeta de injec...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrator de micropipetas	Sutter Instrument	P-97
Instrumentos Sutter capilares de vidro		B100-75-10	Estes capilares são utilizados para fazer as pipetas de retenção e injecção. Qualquer tubo de borossilicato de parede espessa/padrão sem filamento pode ser usado.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipado com lente de ampliação de 10X.
Micromanipulador	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Microscópio invertido	Nikon	TE2000-U	Equipado com lentes 4X, 20X e com sistema laser.
Laser	Laser Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Laser ativo.
Microdispensador	Drummond	3-000-105	O microdispensador é usado para mover os embriões. Uma pipeta p10 também pode ser usada, mas carregando o menor volume possível.
Placa de cultura 100 x 15 mm	Falcon	351029	Use a tampa da placa para fazer a placa de injeção, pois elas têm paredes mais baixas e facilitarão o posicionamento e a movimentação do micromanipulador. A tampa de uma placa de cultura de 60 mm também pode ser usada.
Placa de cultura de 35 mm	Corning	430165	Estas placas são usadas para cultivar os embriões em 50 μ l gotas cobertas com óleo mineral. Alternativamente, um prato de 4 poços também pode ser usado. Independentemente do prato escolhido para cultivar os embriões, eles sempre devem ser equilibrados na incubadora por pelo menos 4 horas antes de transferir os embriões para eles.
Incubadora	Sanyo	MCO-19AIC	Qualquer incubadora que possa ser configurada para 38,5 > C, 5% de CO2 podem ser usadas.
Estereomicroscópio	Nikon	SMZ800	Usado para visualizar os embriões nas gotas de cultura e durante as lavagens. Qualquer estereomicroscópio com ampliação de 10X pode ser usado.
Unidade de controle HT	Minitube	12055/0400	Sistema de aquecimento acoplado ao estereomicroscópio.
Estágio de Microscópio Aquecido	Minitube	12055/0003	Sistema de aquecimento acoplado ao estereomicroscópio.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Uma solução estéril de 10 mg / ml é usada para injetar.
Óleo Mineral	sigma	M8410	Mantenha o óleo mineral à temperatura ambiente e  protegido da luz usando papel alumínio.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Suplementado com 4 mg/ml de BSA. As placas KSOM para cultura de embriões devem ser equilibradas em uma incubadora por pelo menos 4 horas antes do uso.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use um FBS qualificado para células-tronco.
Zigotos			Os zigotos são injetados de 17 a 20 hpf e podem ser derivados de in-vitro- ou in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Concentração final: 107,7 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Concentração final: 7,16 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Concentração final: 1,19 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Concentração final: 0,49 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
DL-lactato de sódio	Sigma	L4263	Concentração final: 5,3 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Concentração final: 1,71 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
D-(&menos;)-Frutose	Sigma	F3510	Concentração final: 0,5 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Concentração final: 21 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Concentração final: 1x. Componente do meio SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Concentração final: 1x. Componente do meio SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	Concentração final: 4 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
Piruvato de sódio	Sigma	P4562	Concentração final: 0,33 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Concentração final: 1 mM. Componente do meio SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Concentração final: 1 mg/ml. Componente do meio SOF-HEPES.
Gentamicina	Sigma	G-1397	Concentração final: 5 μ g/ml. Componente do meio SOF-HEPES.
Água para transferência de embriões	Sigma	W1503	Componente do meio SOF-HEPES.
Meio SOF-HEPES	Fabricado em laboratório		pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filtro esterilizado através de um 22 μ m pode ser armazenado na geladeira a 4 &graus; C por 1 mês. Quente em 37 > C banho-maria antes de usar.