Summary

Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

Published: October 05, 2016
doi:

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

microinjecção citoplasmática de embriões de 1 célula é uma técnica muito potente. Ele pode ser usado para a entrega de qualquer solução para o embrião com, por exemplo, produzir gene knock-out para estudar a função do gene ou para gerar animais editado por genes. Zigotos de animais de exploração agrícola mais relevantes têm uma composição de ácidos graxos muito elevado que faz com que seu citoplasma opaco e escuro 1. Eles também têm uma membrana plasmática bastante elásticas (PM). Estas características fazem microinjeção usando pronuclear injeção convencional / citoplasmática como usado em espécies de roedores desafiadoras e muitas vezes imprecisas.

Microinjecção citoplasmática tem vantagens sobre microinjecção pronuclear, uma vez que é mais fácil de executar e também causa menos danos para os embriões injectados, resultando em maior viabilidade 2. O objetivo geral deste protocolo é demonstrar um método bem sucedido para a entrega de soluções para o citoplasma de zigotos de animais de exploração. Para ser capaz de realizarmicroinjecção citoplasmática com alta eficiência em embriões de gado, é usado um laser para gerar um furo na zona pelúcida (ZP) e então, uma agulha de extremidade romba de vidro é usado para a microinjecção. Esta estratégia visa reduzir os danos mecânicos impressa no embrião durante a injeção. Em seguida, o conteúdo citoplasmático de aspiração no interior da agulha de injecção permite a quebra eficiente e confiável do PM assegurar que a solução é fornecida para dentro do citoplasma do embrião.

Esta técnica já sido utilizado com sucesso em embriões de bovinos para entregar siRNA para o citoplasma zigótica 3,4 e para gerar mutações que utilizam as repetições curtas em cluster regularmente interespaçadas palindrómicos (CRISPR) / CRISPR associada do sistema 9 de sistema (Cas9) 5. É igualmente apropriado (com pequenas modificações) para injetar bovina oócitos inclusos-cumulus 6. Aqui, descrevemos nosso protocolo de injeção de entregar um corante, que podem ser aplicáveis ​​a injeção de qualquer dessolução Ired no zigoto, e mostrar que usando esta técnica provoca lise mínima e não afeta o desenvolvimento embrionário precoce.

Protocol

1. Micropipeta Produção micropipeta Injection Coloque um capilar de vidro de borossilicato (diâmetro externo (OD): 1,0 mm, diâmetro interior (ID): 0,75 mm) num puxador de micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo. Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa seringueiro. (Exemplo: Calor: 825; Pull: 30; Velocidade: 120; Tempo: 200; Pressão: 500). Remova cuidadosamente as pipetas puxados a partir do dispositivo e colocá-lo em um microforge em uma posição horizontal. Traga a pipeta puxado e o filamento aquecedor microforge com a sua conta de vidro em foco. Utilizar o retículo ocular para medir a espessura desejada e mover a pipeta horizontalmente até que o filamento de aquecimento atinge o diâmetro interno alvo (5 uM). Ajustar a aquecer a cerca de 45% e suavemente trazer a pipeta para baixo de modo que toque o filamento. Ativar o aquecedor brevemente. este wderreter doente ligeiramente a pipeta de modo que adere ao filamento e depois do arrefecimento, a pipeta vai quebrar no ponto de contacto gerar um corte a direito. Nota: Definir a temperatura apropriada é fundamental neste passo desde que as temperaturas demasiado elevadas fará com que a curva da pipeta e, portanto, um corte rectilíneo não será possível e temperaturas muito baixas, não será suficiente para derreter a pipeta (Figura 1A). Fazer um ângulo de aproximadamente 30 ° perto da ponta da pipeta, posicionando-o a cerca de 10 uM de distância a partir do filamento de aquecimento. Ajustar a temperatura para 60% e activar o aquecedor. Nota: Este irá dobrar a pipeta sobre o filamento. Este ângulo é desejada para que a ponta da agulha é paralela à superfície da placa de injecção, quando montado no injector (Figura 1B). Lidar com pipetas de microinjeção com cuidado, pois eles são extremamente afiada e frágil. segurando micropipeta Coloque um borosiliccomeu capilar de vidro (OD: 1,0 mm ID: 0,75 mm) em um extrator micropipeta (no centro dos titulares de direitos e capilares esquerda) e bloqueá-lo. Use um programa apropriado para puxar o capilar de vidro, por isso resulta em uma ponta fina com uma longa, mesmo cone e paredes paralelas (Exemplo: Calor: 815; Pull: 20; Velocidade: 140; Time: 175; Pressão: 200). Remova cuidadosamente a pipeta puxado a partir do dispositivo extrator e colocá-lo no porta-microforge em uma posição horizontal. Ajuste o foco no filamento aquecedor e pipeta. Utilizar o retículo ocular para medir o diâmetro da pipeta e mover a pipeta até que o seu diâmetro ao longo do filamento alcança de 180 um. No tamanho indicado, marcar o capilar de vidro, com uma caneta de ponta de diamante, em seguida, pressione suavemente na ponta puxou para quebrar o vidro. Isso deve resultar em um corte reto (Figura 1C). Mover a pipeta para uma posição vertical, com a sua ponta estreita para o filamento. Regule a temperatura do microforge a 60%. Fire-polonês a ponta da pipeta usando técnicas padrão 7 até que esta atinja um ID de 40 uM. Use o retículo ocular para verificar o ID (Figura 1D). Faça um ângulo na pipeta. Traga a pipeta de volta para uma posição horizontal cerca de 10 um para longe do filamento e 5 mm de distância da sua ponta. Ajustar a temperatura para cerca de 60% e activar o aquecedor para dobrar a pipeta sobre o filamento. Continuar o aquecimento, até um ângulo desejado (de cerca de 30 °) é alcançado. Verifique o ângulo visual (Figura 1E). Nota: A pipeta é normalmente montado à microinjector com um ângulo aproximado de 60 ° em relação ao fundo do prato por injecção. A ponta da pipeta é dobrada de modo que é paralela à parte inferior do prato, que é necessário para a correcta injecção do embrião no seu plano médio. le "> 2. Setup Micromanipulator Verifique se as microinjetores são totalmente carregado com óleo e que não há bolhas de ar no sistema (bolhas no microinjetor impedir que o controle fino da injecção). Verifique se os micromanipuladores estão na posição central. Isto irá permitir a uma ampla gama de movimento das pipetas. Insira a pipeta segurando no suporte micromanipulador da esquerda e da pipeta de injeção no suporte micromanipulação direita. Deixe o óleo entrar nas pipetas por capilaridade e verificar se o sistema está funcionando corretamente, movendo óleo cima e para baixo dentro da pipeta usando os controles microinjetor. Nota: Se não houver nenhuma circulação do óleo dentro das agulhas, pode haver uma obstrução. Neste caso, usar uma agulha nova. Use os controlos micromaniplador para trazer as pipetas para o centro do campo do microscópio de vista. Usando uma ampliação de 4X, verifique se as dicas micropipeta estão no ângulo correto (parallel para a parte inferior do prato). Nota: Uma configuração correcta das agulhas é a chave para uma injecção de sucesso e resultados para a consistência. Calibrar o sistema de laser seguindo o manual de calibração do fabricante. 3. Preparação do prato de injecção (Figura 2) Coloque uma gota de 50 ul de aquecido (37 ° C) SOF-HEPES (composição detalhado na secção de materiais) suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS) no centro da tampa de uma placa de petri de 100 mm. Coloque um 1 – 2 ul gota da solução a ser injectada próximo da gota injecção. Certifique-se de que os embriões não arrefecer abaixo RT. Nota: Neste protocolo, irá adicionar o corante Dextran-Vermelho para a solução de injecção para ser capaz de visualizar o local da injecção e segui-lo mais tarde. Cobrir as gotas na placa de injecção, utilizando aproximadamente 10 ml de óleo mineral. Colocar o prato de injecção na fase do microscópio invertido e trazer o PIPEttes na gota injecção. Verifique se as agulhas estão no foco dentro da gota. Ajustar a sua altura conforme necessário usando os controles micromaniplador. Usando uma micro-distribuidor, carregar cerca de 20 – 30 zigotos (17-20 horas pós-fertilização (HPF)) no lado superior da gota injecção. Realizar a injecção à temperatura ambiente de modo que o número de embriões na queda de injecção é determinada pela velocidade à qual a pessoa pode injectar-los. Não carregue mais embriões do que os que podem ser injetadas em 30 min. Para carregar os embriões em no micro, pressionar o êmbolo totalmente e mergulhe a ponta na solução contendo os embriões. Tocam os embriões para ser apanhada com a ponta do capilar de vidro (um de cada vez) e liberam lentamente o êmbolo de modo que cada embrião entra no capilar. Repita este procedimento até todos os embriões são apanhados ou a capacidade de micro-distribuidor está cheio. Para liberar os embriões carregados, pressionar o êmbolo suavemente até que todo o volume de containing os embriões é liberado do capilar. 4. microinjeção Usando o objectivo 4X, carregar a solução a ser injectada para a pipeta de injecção por aplicação de pressão negativa (aspiração). Coloque solução suficiente para injetar 2 – 3 zigotos. Em seguida, passar para a queda de injeção. Dentro da gota injeção, mover a pipeta segurando para que a ponta fica perto de um zigoto. Aplique pressão negativa (aspirado) com o microinjetor exploração de modo que o zigoto fica fixo para a pipeta holding e mudança para um objetivo 20X. Uma vez que o zigoto está ligado à pipeta de exploração, verificar a sua qualidade utilizando a pipeta de injeção para mover suavemente o embrião ao redor sem separá-la. A qualidade zigoto bom deve ter os dois corpos polares (embora, por vezes, apenas um é visto) e um citoplasma homogêneo. Não injectar zigotos anormais (Figura 3A). Se necessário, reposicionar o embrião para uma injecção adequadalocalização. Um bom posicionamento seria aquele em que existe um espaço entre a ZP e o PM, de modo que o PM não seja danificada pelo laser. Verificar que a pipeta de injecção está posicionado no plano médio do embrião tocando suavemente o zigoto no local da injecção. Se ele não está no seu plano médio, a agulha irá tendem a fazer rodar o embrião em vez de punção. Ajustar a altura da pipeta de injecção conforme necessário. Fazer um buraco na ZP usando um laser (Figura 3B). Utilizando software lugar do laser, a retícula de laser na ZP onde o furo vai ser feita (no lado oposto ao onde o embrião está ligado à pipeta de exploração). Usando a janela, clique em controle de laser sobre o botão de fogo. Certifique-se de que o tamanho do orifício é suficientemente grande para criar uma abertura no ZP para a agulha para passar através sem danificar o PM (Exemplo: 0,662 ms de largura de impulso / 6,9 uM O tamanho do orifício). Passe a agulha de injeçãoatravés do orifício na ZP e fazer contato com a PM. Continue a empurrar a pipeta para a frente até que a agulha é ¾ da forma para o embrião (Figura 3C). Observar a posição do menisco na interfase solução de óleo, tal como este será utilizado para controlar o volume de injecção consistente. Aplicar pressão negativa (aspiração) na pipeta de injecção, o que irá resultar em PM e citoplasma sendo aspirado para a agulha de injecção. Continuar até que o movimento do citoplasma para dentro da agulha ou acelera quando o conteúdo citoplasma misturando-se com uma solução de injecção pode ser visto. Estes irão indicar a ruptura da PM (Figura 3D). Injectar de volta o conteúdo citoplasmático seguido da solução para dentro do citoplasma do zigoto pela aplicação de pressão positiva (que se injectam), até que o menisco na interfase solução-óleo tem avançado diâmetro equivalente de um zigoto passado o ponto de partida. Nota: Nas nossas condições, este representa cerca de 7 pl de solução injectada (Figura 3E). Mudar para um objectivo 4X e mover o injectado embrião / s para o lado de baixo da gota de injecção. Liberar o embrião através da aplicação de pressão positiva sobre o microinjetor exploração. Manter os embriões não injectados no lado superior e os injetados no lado inferior da queda para ajudar a manter o controle dos embriões injetados / não-injetado e trabalhar de forma eficiente. 5. Embrião de recuperação e Injeção Resultados Adicione 3 gotas de cerca de 200 ul numa nova placa com pré-aquecido SOF-HEPES. Recolher os embriões injectados utilizando uma micro-distribuidor (como descrito acima). Lavar os embriões injectados movendo-os através do SOF 3-HEPES gotas. Conte os embriões lisadas durante a microinjeção e descartá-las. Nota: Um zigoto lisadas podem ser facilmente distinguidos a partir de um único intacta desde o primeiro aparece translúcido, preencher toda a ZP, e, geralmente, tem citoplasmáticateor de vazamento para o exterior do embrião. Opcionalmente, verificar a eficiência microinjecção utilizando um microscópio de fluorescência. Esteja ciente de que a exposição à luz UV pode induzir danos embrião que pode afetar o desenvolvimento subsequente. Grupos de cultura de 25 embriões injectados em 50 gotas ul de meio simplex optimização de potássio (KSOM) suplementado com 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em óleo mineral a 38,5 ° C, 5% CO 2 em ar, e humidade de saturação. Suplementar o meio de cultura com 5% de FBS dois dias após a injecção. Verifique blastocisto (BL) taxas de 7 dias após a injeção. Calcular as taxas de BL como o número total de embriões de blastocisto / número total de embriões cultivados em que a queda.

Representative Results

Microinjecção citoplasmática assistida por laser é um protocolo potente e fiável para fornecer soluções para o citoplasma de zigotos de gado. A Figura 3 mostra um esquema geral dos zigotos, antes e depois da injecção, bem como o contorno geral da técnica. Dextrano-vermelho é usado como injeção de solução para permitir site de rastreamento de injeção e injeção de eficiência e precisão. O sucesso da entrega a solução está ilustrada na Figura…

Discussion

A microinjecção de zigotos é um método bem estabelecido para a introdução de soluções em embriões de mamíferos. Com algumas variações dependentes das espécies e o objectivo da experiência, esta técnica pode ser usado de forma ampla. Mostramos como executar microinjecção intracitoplasmática usando um laser para ajudar na entrada de uma micropipeta de extremidade romba. Os zigotos de algumas espécies animais (tais como gado bovino, ovelhas, e porcos) têm um citoplasma escuro, dificultando a visualizaç…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

Materials

Micropipette puller Sutter Instrument P-97
Glass capillary Sutter instruments B100-75-10 These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge Narishige MF-9 Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator Nikon/ Narishige NT88-V3
Inverted microscope Nikon TE2000-U Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser Research Instruments 7-47-500 Saturn 5 Active laser.
Microdispenser Drummond 3-000-105 The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish Corning 430166 Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier. 
35mm culture dish Corning 430165 These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator Sanyo MCO-19AIC Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope Nikon SMZ800 Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT Minitube 12055/0400 Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage Minitube 12055/0003 Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red Thermo Scientific D1828 A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil sigma M8410 Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine Zenit ZEBV-100 Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS Gemini-Bio 100-525 Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl Sigma S5886 Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl Sigma P5405 Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4 Sigma P5655 Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O Sigma M2393 Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate Sigma L4263 Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O  Sigma C7902 Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose  Sigma F3510 Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES  Sigma H4034 Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA Sigma M7145 Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA Sigma B6766 Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3 Sigma S5761 Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate Sigma P4562 Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax Gibco 35050 Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA Sigma A-3311 Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin Sigma G-1397 Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer Sigma W1503 Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium Made in the lab pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.

Referências

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Citar este artigo
Bogliotti, Y. S., Vilarino, M., Ross, P. J. Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes. J. Vis. Exp. (116), e54465, doi:10.3791/54465 (2016).

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