Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.
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Artigo de método
De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há uma necessidade crescente de fenotipagem e histopatologia eficientes de uma variedade de tecidos. Essa necessidade de fenotipagem é evidente com os projetos ambiciosos para interromper todos os genes do genoma do camundongo. A comunidade de pesquisa precisa de meios rápidos e baratos para fenotipar tecidos por meio da histologia. As análises histológicas dos tecidos esqueléticos costumam ser demoradas e, na melhor das hipóteses, semiquantitativas, exigindo regularmente interpretação subjetiva das lâminas de indivíduos treinados. Aqui, apresentamos um paradigma criohistológico para fenotipagem eficiente e barata de tecidos mineralizados. Primeiro, apresentamos um novo método de criossecção estabilizada com fita que preserva a morfologia dos tecidos mineralizados. Essas seções são então aderidas rigidamente a lâminas de vidro e fotografadas repetidamente ao longo de várias rodadas de coloração. As imagens resultantes são então alinhadas manualmente ou por meio de software de computador para produzir pilhas compostas de várias imagens em camadas. O protocolo permite a co-localização de vários sinais moleculares para células específicas dentro de uma determinada seção. Além disso, esses sinais fluorescentes podem ser quantificados objetivamente por meio de software de computador. Este protocolo supera muitas das deficiências associadas à histologia de tecidos mineralizados e pode servir como uma plataforma para a fenotipagem de alto rendimento e alto conteúdo de tecidos musculoesqueléticos no futuro.
Introdução
Pesquisa biológica, muitas vezes requer fenotipagem eficiente, o que é frequentemente associada com algum tipo de análise histológica 1-3. Esta necessidade é ainda mais evidente com os projectos ambiciosos para interromper cada gene no genoma do rato 4. Estas análises histológicas pode variar de avaliar a morfologia celular e / ou características anatómicas a expressão de mapeamento de genes específicos ou proteínas para células individuais. Na verdade, uma das contribuições fundamentais de histologia para o campo da genômica é a capacidade de associar um sinal molecular específica para uma região ou célula tipo específico.
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Protocolo
A Universidade do comitê de cuidados com os animais institucional e uso Connecticut Centro de Saúde aprovou todos os procedimentos com animais.
1. Fixação and Embedding
- Eutanásia do animal através de CO 2 asfixia ou outros métodos aprovados.
- Colheita do tecido de interesse (por exemplo, membro, vértebras, etc.) e colocar em 10% de formalina tamponada neutra a 4 ° C até ser adequadamente fixo. Tome especial cuidado para manter a colocação anatômica consistente antes da fixação. Por exemplo, corrigir membros com juntas em flexão consistente, rotação interna e rotação externa ângulos 11. No....
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Resultados
Um fluxo de trabalho geral para o Alto Rendimento, Multi-Imagem Cryohistology
A Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral utilizado para esta técnica. Ele inclui várias etapas de fixação através de várias rodadas de imagem e, finalmente, de alinhamento de imagem / análise. O processo pode demorar tão pouco como uma semana para ir de fixação de amostra através de 4 rodadas de imagem, o que .......
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Discussão
Aqui nós apresentamos um protocolo cryohistology detalhada para co-localizar e quantificar várias medidas biológicas, alinhando imagens de várias rodadas de coloração / imagens em uma única seção. O método descrito utilizando o cryotape é especialmente útil uma vez que mantém a morfologia do tecido difícil de secção (por exemplo, osso mineralizado e cartilagem). Além disso, o tecido seccionados é aderida firmemente para a lâmina de vidro, para permitir que vários ciclos de coloração / imagem da mesma secção; Ao.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer as seguintes fontes de financiamento: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 e T90-DE021989.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10% de formalina tamponada neutra | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Vários fornecedores disponíveis. Tóxico. Pode ser substituído por paraformaldeído a 4%. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Vários fornecedores disponíveis. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Diferentes tamanhos podem ser usados dependendo do tecido |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Pode ser substitituado com outras criometrias. No entanto, as resinas à base de PVA/PEG funcionaram melhor em nossas mãos. |
| 2-metil-butano | Sigma Aldrich | M32631 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Criostato | Leica Biosystems | 3050s | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Disco de amostra | Leica Biosystems | 14037008587 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Lâminas de criostato | Thermo Scientific | 3051835 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Microscopy Sciences | 62800-46 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Lâminas de microscópio de plástico | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Lâminas de microscópio de vidro | Thermo Scientific | 3051 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Adesivo Óptico Norland, 61 | Adesivo Óptico Norland Óptico | 61 | |
| Luz Negra UV | General Electric | F15T8-BLB | |
| Ácido acético glacial | Sigma Aldrich | ARK2183 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Microscóferas vermelhas InSpeck | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| Microesferas verdes InSpeck | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Complexo de alizarina | Sigma Aldrich | A3882 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Demeclociclina | Sigma Aldrich | D6140 | Vários fornecedores disponíveis. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G5516 | Vários fornecedores disponíveis. |
| ELF 97 substrato de fosfatase ácida fluorescente amarela | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Vários fornecedores disponíveis. Pode ser substituído por Hoechst 33342 ou outros corantes nucleares. |
| TO-PRO-3 (contracoloração nuclear Cy5) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Iodeto de propídio | ThermoFisher Scientific | R37108 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Acetato de sódio anidro | Sigma Aldrich | S2889 | Vários fornecedores disponíveis. |
| tartarato de sódio dibásico di-hidratado | Sigma Aldrich | T6521 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Nitrito de sódio | Sigma Aldrich | S2252 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Vários fornecedores disponíveis. |
| MgCl2 hexahidratado | Sigma Aldrich | M9272 | Vários fornecedores disponíveis. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Sal TR Vermelho Rápido | Sigma Aldrich | F8764 | Vários fornecedores disponíveis. Também pode ser substituído por outros kits de substrato, como Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naftol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Vários fornecedores disponíveis. |
| N,N dimetilformamida | Sigma Aldrich | D158550 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Toluidine azul O | Sigma Aldrich | T3260 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Outros scanners lineares ou lado a lado também podem ser usados. |
| Conjunto de filtros DAPI | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Conjunto de Filtros | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| Conjunto de Filtros GFP | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| Conjunto de filtros YFP | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Conjunto de filtros amarelo personalizado (ELF 97) | Chroma Technology Corp. | costume; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| Conjunto de filtros TRITC | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Conjunto de Filtros | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Sistema de Transferência | Fita Microscopia Eletrônica Ciências | 62800-10 | Vários fornecedores disponíveis. |
| CryoJane Tape Windows | Microscopia Eletrônica Ciências | 62800-72 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Corrediças Adesivas CryoJane | Microscopia Eletrônica Ciências | 62800-4X | Vários fornecedores disponíveis. |
Referências
- Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
- Adissu, H. A., et al.
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Reimpressões e permissões
