Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.
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Artigo de método
De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há uma necessidade crescente de fenotipagem e histopatologia eficientes de uma variedade de tecidos. Essa necessidade de fenotipagem é evidente com os projetos ambiciosos para interromper todos os genes do genoma do camundongo. A comunidade de pesquisa precisa de meios rápidos e baratos para fenotipar tecidos por meio da histologia. As análises histológicas dos tecidos esqueléticos costumam ser demoradas e, na melhor das hipóteses, semiquantitativas, exigindo regularmente interpretação subjetiva das lâminas de indivíduos treinados. Aqui, apresentamos um paradigma criohistológico para fenotipagem eficiente e barata de tecidos mineralizados. Primeiro, apresentamos um novo método de criossecção estabilizada com fita que preserva a morfologia dos tecidos mineralizados. Essas seções são então aderidas rigidamente a lâminas de vidro e fotografadas repetidamente ao longo de várias rodadas de coloração. As imagens resultantes são então alinhadas manualmente ou por meio de software de computador para produzir pilhas compostas de várias imagens em camadas. O protocolo permite a co-localização de vários sinais moleculares para células específicas dentro de uma determinada seção. Além disso, esses sinais fluorescentes podem ser quantificados objetivamente por meio de software de computador. Este protocolo supera muitas das deficiências associadas à histologia de tecidos mineralizados e pode servir como uma plataforma para a fenotipagem de alto rendimento e alto conteúdo de tecidos musculoesqueléticos no futuro.
Introdução
Pesquisa biológica, muitas vezes requer fenotipagem eficiente, o que é frequentemente associada com algum tipo de análise histológica 1-3. Esta necessidade é ainda mais evidente com os projectos ambiciosos para interromper cada gene no genoma do rato 4. Estas análises histológicas pode variar de avaliar a morfologia celular e / ou características anatómicas a expressão de mapeamento de genes específicos ou proteínas para células individuais. Na verdade, uma das contribuições fundamentais de histologia para o campo da genômica é a capacidade de associar um sinal molecular específica para uma região ou célula tipo específico.
Os métodos tradicionais de histologia, especialmente para tecidos músculo-esqueléticas, são muitas vezes demorado e trabalhoso, exigindo, por vezes semanas para corrigir, descalcificação, seção, mancha e imagem do espécime, em seguida, analisar as imagens através da interpretação humana. Análise de múltiplos sinais moleculares, quer seja através de imuno-histoquímica, em hybridizat situion, ou colorações especiais, requer várias seções e até mesmo várias amostras para realizar de forma adequada. Além disso, estas várias respostas não podem ser co-localizadas à mesma célula e, por vezes, pode não ser co-localizados a uma região específica de uma dada amostra. Como o campo da genómica e epigenomics se move para a era digital, o campo histológico também deve seguir o mesmo caminho para fornecer eficiente e de alta taxa de transferência e análise automatizada de uma variedade de sinais moleculares dentro de um único corte histológico.
De fato, há uma demanda para melhoria de técnicas histológicas que podem associar vários sinais moleculares às células específicas dentro de uma dada amostra. Recentemente, publicou um novo método cryohistological de alto rendimento para avaliar várias medidas de resposta dentro de um determinado seção de tecido mineralizado 5-14. O processo envolve a estabilização do criocorte com cryotape congelado, fazendo aderir a secção gravado rigidamente a uma lâmina de microscópio, ea realização de várias rodadas de coloração e de imagem em cada seção. Estes ciclos de imagens são então alinhadas manualmente ou através de automação computador antes de análise de imagem (Figura 1). Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste processo e fornecer exemplos onde estas técnicas têm melhorado nossa compreensão dos diferentes processos biológicos.
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Protocolo
A Universidade do comitê de cuidados com os animais institucional e uso Connecticut Centro de Saúde aprovou todos os procedimentos com animais.
1. Fixação and Embedding
- Eutanásia do animal através de CO 2 asfixia ou outros métodos aprovados.
- Colheita do tecido de interesse (por exemplo, membro, vértebras, etc.) e colocar em 10% de formalina tamponada neutra a 4 ° C até ser adequadamente fixo. Tome especial cuidado para manter a colocação anatômica consistente antes da fixação. Por exemplo, corrigir membros com juntas em flexão consistente, rotação interna e rotação externa ângulos 11. Normalmente, corrigir membros integrais do mouse para 1 - 3 dias.
Cuidado: formol é tóxico e deve ser tratado em um exaustor enquanto usava o equipamento de protecção individual adequado.
Nota: O período de tempo de fixação depende do tamanho da amostra. Se o experimento permite, cortando abrir o osso vai melhorar a fixação do compartimento de medula.Algumas amostras podem exigir fixação da perfusão 15 para minimizar o fundo fluorescente (por exemplo, os sinais fluorescentes fracos dentro da medula óssea). - Transferência Espécimes de formalina a 30% de sacarose feito em 1x PBS e incubar durante 12-24 horas a 4 ° C.
Observação: Uma vez incubadas durante 12-24 horas, em seguida, as amostras podem ser colocadas a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Este método de armazenamento é recomendado para experiências em que os investigadores pretendem incorporar várias amostras no mesmo bloco, mas pode não colher todas estas amostras ao mesmo tempo (por exemplo, as experiências com vários pontos de tempo). - Retirar amostras a partir da sacarose e dissecar afastado qualquer excesso de tecido.
- Encha uma cryomold (tamanho do molde é dependente do tamanho da amostra) parte do caminho com crio a incorporação médio. Coloque amostra no molde de tal forma que o corte de avião para a região de interesse é paralelo com a parte inferior do molde.
Nota: Um exemplo de colocação de tecido específico e orientaçãopode ser encontrada na Figura 2A - B. - Coloque o cryomold sobre um pedaço de gelo seco até que uma fina camada de material crio a incorporação congela médio e, posteriormente, corrige a amostra no lugar. Encher o volume restante da cryomold com crio de meio de inclusão, mantendo a cryomold na pelete de gelo seco.
- Coloque a cryomold num recipiente contendo 2-metil-butano previamente arrefecido por gelo seco. Uma vez que as amostras são completamente congelado, retire cryomolds e sacuda o excesso de 2-metil-butano. Enrole cryomolds em celofane e coloque em uma temperatura de -20 ° C ou -80 ° C congelador para armazenamento.
Nota: As amostras pode secar ao longo do tempo quando armazenado em meio de incorporação de crio, especialmente à temperatura de -20 ° C. Sugerimos que de armazenamento de amostras durante mais do que 1 - 2 meses de crio de meio de inclusão a -80 ° C ou em 30% de sacarose a -80 ° C (ver passo 1.3).
2. Seccionamento Tissue estabilizou-Tape
- Remover os blocos de amostras do freezer e coloque em cryostat com a temperatura ajustada entre -20 e -25 ° C.
- Retire o bloco do cryomold e corte o excesso de crio a incorporação meio com uma lâmina de barbear.
- Coloque algum meio de crio incorporação no disco de amostra e, em seguida, alinhar o bloco de tal modo que a superfície do disco de amostra é paralela à superfície inferior do bloco estabelecendo assim o plano de corte apropriado para a região de interesse.
- Coloque o disco de amostra no criostato e permitem a incorporação de crio forma de congelar.
- Coloque o disco de amostra para o cabeçote da amostra e ajustar a cabeça de tal modo que os cortes de lâminas paralelas à superfície do bloco de amostra.
- Apare o bloco para baixo para um nível dentro da região de interesse e escovar fora quaisquer aparas a partir da superfície do bloco.
- Corte um pedaço do cryotape suficientemente grande para cobrir a região de interesse e pré-frio no criostato.
Nota: Várias peças podem ser cortadas de tamanhos consistentes e armazenado dentro do cryostno durante o corte. - Remover apoio não-aderente do cryotape segurando a fita pelas abas de prata não pegajosa / ouro usando uma pinça, em seguida, coloque a fita no bloco pegajoso do lado do baixo.
- Aplicar pressão à cryotape usando o rolete (Figura 2C).
- Faça uma seção (5-8 mm) usando o motor automático ou roda de corte manual da criostato.
Nota: É uma boa prática para manter a borda da cryotape como ele vem para o palco de modo que a secção não cair do palco durante o corte (Figura 2D). - Coloque o lado do tecido seção em uma lâmina de microscópio de plástico dentro do criostato.
- Remover a corrediça de plástico do criostato e permitir que o meio de crio incorporação para derreter de tal modo que a secção adere à superfície da lâmina.
- Repita seccionamento de cortes seriados ou de outras regiões de interesse.
- Uma vez terminado, armazenar as seções em uma caixa de slides umat 4, -20 ou -80 ° C, dependendo do comprimento de armazenamento necessária e as medidas de resposta a jusante. Por exemplo, usar lâminas que vão ser coradas para actividade enzimática (veja 5,2-5,3) dentro de um mês quando armazenada a 4 ° C.
3. Adesão de seções para lâminas de microscópio
- método adesivo curável por UV.
- Rotular a lâmina de microscópio.
Nota: Para uma maior automatização, amostras e lâminas podem ser rotulados com códigos de barras. - Aplicar uma gota de adesivo óptico activado por UV para duas lâminas de vidro e usar o bordo de uma lâmina de plástico para espalhar uma camada fina de adesivo sobre a superfície das lâminas de vidro.
- Cortar a guia prata / ouro e colocar o lado do tecido seção gravadas no adesivo do primeiro slide. Aplicar a secção de um movimento de rolamento de uma ponta à outra, a fim de minimizar a formação de bolhas aprisionadas debaixo da fita adesiva.
NOTA: A primeira corrediça é usada para pré-molhar a parte inferior de tele fita antes de o colocar no segundo slide (permanente) (passo 3.1.4). - Retirar a parte gravada a partir da primeira lâmina e colocá-lo sobre a camada adesiva da segunda corrediça (Figura 3A). Mais uma vez, tome cuidado para evitar o aprisionamento de bolhas.
NOTA: Esta etapa requer prática para dominar. - Uma vez que o número apropriado de seções para o experimento dado é colocado em cada slide, limpe o excesso de adesivo das áreas circundantes.
- Inspecionar cada seção de perto por bolhas ou fibras debaixo da fita. Realize esta inspeção sob um microscópio ou lupa. Se existirem obstruções, remover a secção indivíduo, remover as obstruções, e em seguida, reaplicar-lo para a lâmina de vidro.
- Uma vez que seja determinado que não existem obstruções sob as seções gravadas, coloque as lâminas de microscópio sob a luz negra UV para 5 - 10 min para reticular o adesivo.
- Rotular a lâmina de microscópio.
- método adesiva quitosano.
- Prepare the 1% de adesivo de quitosano. Preparar uma solução de ácido acético através da dissolução de 0,25 ml de ácido acético concentrado em 100 ml de água Dl (0,25% v / v). Dissolve-se 1 g de pó de quitosano em 100 ml de solução de ácido acético e agita-se a solução de O / N ou até que todo o pó de quitosano é dissolvido.
NOTA: A solução é estável à temperatura ambiente. - Depositar uma gota de solução de quitosano para cada secção que vai ser colocada sobre a corrediça.
- Cortar a guia prata / ouro da fita e colocar cada lado do tecido seção gravada para cima do adesivo (Figura 3A). Use muito cuidado para evitar o aprisionamento de bolhas.
- Uma vez que todas as secções são colocadas sobre a corrediça, a corrediça inclinar-se sobre uma das suas bordas longas e arrastar quitosano excessiva para a borda inferior com a pinça.
- Colocar as lâminas com esta orientação em cima de uma toalha de papel numa caixa de corrediça. A gravidade vai fazer com que o excesso de quitosano para cair sobre a toalha, dando origem a uma camada plana e uniforme de quitosano.
- Place a caixa de slides com a tampa mantida aberta na geladeira O / N para permitir que a quitosana para secar.
NOTA: Ver Tabela 1 para uma comparação entre os dois métodos adesivas.
- Prepare the 1% de adesivo de quitosano. Preparar uma solução de ácido acético através da dissolução de 0,25 ml de ácido acético concentrado em 100 ml de água Dl (0,25% v / v). Dissolve-se 1 g de pó de quitosano em 100 ml de solução de ácido acético e agita-se a solução de O / N ou até que todo o pó de quitosano é dissolvido.
4. Aplicação de marcadores de referência aos slides
- Preparar a solução de marcador de referência através da dissolução de 50 ul de verde e 50 ul de microesferas vermelhos em 100 ul de água. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.
- Coloque a 10 mL ou 20 mL ponta da pipeta na solução microesfera. Adicionar uma pequena gota de solução de microesfera para cada secção adjacente à região de interesse (Figura 3C). Tenha cuidado para não ficar microesferas dentro da região de interesse.
- Secam-se as lâminas à TA (protegida da luz), durante 30 minutos, se o processamento das lâminas nesse dia. Se não, coloque os slides em uma caixa de slides a 4 ° C.
Nota: Enquanto a solução microesfera seca antes de hidratar os slides, o microspheres permanecerá aderiu aos slides durante várias rodadas de coloração / imagem.
5. várias rodadas de Coloração
NOTA: Ao escolher uma sequência de imagens compatível, coloração, e passos de re-imagem, é possível detectar e co-localizar muitos sinais biológicos no mesmo corte de tecido. Cada rodada de imagem / coloração / recriação tem de ser desenvolvido para a questão histológica particular. A sequência de imagens / coloração / recriação tipicamente envolve a aquisição dos sinais fluorescentes endógenos (por exemplo, GFP celular, corantes de mineralização, in vivo sondas de imagem) na primeira rodada de imagem seguido de imunocoloração multiplexado fluorescente e várias rodadas de manchas de atividade enzimática. Por fim, a secção pode ser corada com corantes cromogénicos (por exemplo, H & E, azul de toluidina, safranina O, etc.) para realçar a arquitectura dos tecidos. Apresentados nesta secção são métodos personalizados adaptados deprotocolos comercialmente disponíveis.
- Coloração azul calceína de mineral acumulada
NOTA: Calce�a azul coloração produz uma superfície mineral consistente, que é passível de análise de imagem automatizado ao contrário contraste de campo escuro ou de interferência diferencial de imagem (DIC). O problema com a coloração azul calceína é que o espectro fluorescente sobrepõe com tetraciclina e rotulagem demeclocycline. Portanto, se a amostra contém esses rótulos minerais, imagem os rótulos na primeira rodada de imagem antes da coloração com azul calceína.- Se os sinais endógenos dentro do tecido são gravadas antes desta etapa coloração, submergir os slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin preenchido com 1xPBS até que as lamelas cair longe dos slides. Retire e seque as folhas de cobertura.
- Prepare a 30 mg / ml de solução de azul de calceína em 2% de NaHCO 3 (preparado dissolvendo 2 g de NaHCO3 em 100 ml de H 2 O e ajustarção a um pH de 7,4 com HCl). Alíquotas e armazenar a solução à temperatura de -20 ° C.
- Imergir as lâminas em um frasco Coplin contendo 1x PBS durante 15 minutos para hidratar as secções, se já não estiver hidratado da ronda anterior.
- Retirar as lâminas e secar a parte de trás e arestas com uma toalha de papel.
- Aplicar 100 - 500 ul de solução de azul de calceína por lâmina e incubar durante 10 min numa câmara de humidade a temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas em 1x PBS durante 10 minutos com 3 alterações.
- Aplicar ~ 200 mL de glicerol a 50% em 1x PBS a cada slide e montar a lamínula.
- Remover o excesso de glicerol e seca-se a parte inferior das lâminas.
- Tartarato resistente fosfatase ácida (TRAP) de coloração de actividade enzimática
NOTA: a TRAP é expressa por vários tipos de células da linhagem hematopoiética no incluindo os osteoclastos. A coloração TRAP aqui apresentado usa um substrato de fosfatase ácida amarelo fluorescente. Certos sinais fluorescentes ovERLAP com o conjunto de filtro amarelo personalizado incluindo etiquetas de tetraciclina / demeclociclina de mineralização, calceína corante azul e DAPI contracoloração.- Submergir slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin preenchido com 1x PBS até que as lamelas cair longe dos slides. Retire e seque as folhas de cobertura.
- Preparar tampão 1 por dissolução de 9,2 g de anidro acetato de sódio e 11,4 g de tartarato de sódio dibásico di-hidratado em água e levando o volume final a 1000 mL. Ajustar o pH para 4,2 com ácido acético concentrado glacial (~ 1,5 - 2 ml). Guardar a solução a 4 ° C por até 12 meses.
- Preparar tampão 2 por dissolução de 40 mg de nitrito de sódio em água e levando o volume final a 1 ml. Guardar a solução a 4 ° C durante até 1 semana.
- No dia da coloração, preparar o tampão de reacção por mistura de 7,5 ml de tampão 1 e 150 ul de tampão 2.
- Aplicar o tampão de reacção, sem substrato para a corrediças durante 10 - 15 minutos para equilibrar o tecido ao pH mais baixo.
NOTA: O volume típico é ~ 200 ul, mas precisa ser grande o suficiente para cobrir todas as seções. - Dilui-se o substrato da fosfatase ácida amarelo fluorescente entre 1:50 e 1: 100 no tampão de reacção.
NOTA: A diluição será ditada pela actividade da TRAP no interior da amostra. - Verter o tampão de reacção fora das lâminas e aplicar o tampão de reacção com o substrato fluorescente amarela para as lâminas.
- Colocar as lâminas sob a luz negra UV para ~ 5 min para ativar o substrato.
NOTA: O tempo de incubação pode variar em função da actividade de TRAP no interior da amostra. - Lavar as lâminas em 1x PBS durante 10 minutos com 3 alterações.
- Aplicar ~ 200 mL de glicerol a 50% em 1x PBS a cada slide e montar a lamínula.
- Remover o excesso de glicerol e seca-se a parte inferior das lâminas.
NOTA: O tampão TRAP ácida vai descalcificação as seções. O benefício adicional do decalcificação é que certas cores estará disponível novamente para a coloração jusante (por exemplo, etiquetas de mineralização). Por exemplo, a coloração com azul de calceína vai ser removida durante a coloração TRAP. Portanto, DAPI contracoloração podem ser visualizados neste canal durante uma rodada subseqüente.
- A fosfatase alcalina (AP) de coloração de actividade enzimática
NOTA: Vários tipos de células envolvidas com a mineralização incluindo osteoblastos e condrócitos mineralizing expressam AP. O substrato Fast Red utilizado neste protocolo provoca tanto um sinal vermelho e vermelho cromogénico fluorescente. Devido a isto, o substrato cromogénico apagará sinais fluorescentes nas regiões onde o substrato precipita. Portanto, é melhor para fazer esta mancha após imagiologia os sinais fluorescentes que podem ser temperados por o substrato de AP.- Submergir slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin preenchido com 1x PBS até que as lamelas cair longe dos slides. Remove e secar as lamelas.
- Prepare Tris 1 M por dissolução de 12,1 g de Tris em 100 ml de água. Ajustar o pH para 9,5 com NaOH 1 M.
- Prepare 1 M MgCl 2 hexahidrato por dissolução de 20,33 g de MgCl 2 em 100 ml de água desionizada.
- Prepare de NaCl 2 M por dissolução de 11,68 g de NaCl em 100 ml de água desionizada.
- Prepare a 100x (20 mg / ml) solução de estoque de TR vermelho rápido de sal por dissolução de 1 g de pó em 50 ml de água desionizada. Adicione 100 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- Prepare a 100x (10 mg / ml), solução de partida de fosfato de naftol AS-MX por dissolução de 500 mg de pó em 50 ml de N, N-dimetilformamida. Adicione 100 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- No dia da coloração, preparar o tampão de AP através da adição de 1 ml de Tris 1 M, 0,5 mL de 1 M de MgCl2, 0,5 ml de NaCl 2 M e levar o volume final para 10 ml, utilizando água desionizada (concentrações finais: 100 mM Tris, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl).
- Coloque AP bpode ser prejudicado em cada lâmina e incubar numa câmara de humidade durante 10 min à TA.
- Prepare tampão de substrato AP diluindo 100x estoques de fast Red TR Sal e Naphthol AS-MX para 1x no buffer AP.
- Despeje tampão AP off de lâminas e substituir com tampão de substrato AP. Incubar as lâminas durante 5 - 10 min numa câmara de humidade a temperatura ambiente.
NOTA: O tempo de incubação será ditada pela actividade de AP da amostra. - Lavagem das lâminas 3x em PBS 1X durante 5 minutos cada.
- Montagem de cobertura desliza com solução DAPI contracoloração (1: 1000 de diluição de DAPI em 50% de glicerol em PBS 1x).
- Azul de toluidina O (TB) coloração cromogénico
Observação: Como todas as etapas anteriores são gravadas sob a montagem aquosa temporária em 50% de glicerol / PBS solução, o passo cromogénico também é fotografada em condições aquosas. No entanto, a solução corante pode tender para lixiviar ao longo do tempo. Portanto, sugere-se a imagem do azul de toluidina, o mais rapidamente possível após a coloração.- Submergir slides da rodada de imagem anterior em uma jarra de Coplin cheia com água deionizada até que as lamelas cair longe dos slides. Retire e seque as folhas de cobertura.
- Depois de retirar as peças de cobertura, substitua com água fresca e incubar as lâminas durante pelo menos 10 minutos, para que os sais de PBS são suficientemente removidos do tecido.
- Preparar a solução de TB 0,025% em água desionizada.
- Colocar as lâminas na solução de TB por 1-5 min.
NOTA: O tempo de incubação é dependente da preferência do usuário, mas deve ser mantido consistente em todas as amostras. - Colocar as lâminas em jarra de Coplin com água e lavagem das lâminas deionizada 3x por 5 minutos cada.
- Mount tampa de deslizamento com 30% de glicerol dissolvidos em água deionizada (NÃO 1x PBS, pois isso fará com que a mancha seja liberado a partir do tecido). NOTA: Glicerol meio de montagem pode ser substituo com xarope de frutose, o que ajuda a evitar a difusão do corante do tecido. Parapreparar o xarope de frutose, dissolve-se 30 g de frutose em 10 ml de água desionizada e aquece-se a 60 ° C até se dissolver.
6. várias rodadas de Imagiologia
- Colocar as lâminas nas bandejas de microscópio (Figura 3D).
Nota: As bandejas são a mola. - Insira as bandejas na pilha bandeja do microscópio de varredura de slides (Figura 3E).
- Clique na lista de perfis para carregar um perfil para cada slide com tempos de exposição apropriados para cada fluoróforo. Clique no nome do slide para nomear cada slide manualmente ou ter o software leia o código de barras fornecido no rótulo do slide. Clique no botão de digitalização pré-visualização início para tirar uma imagem de visualização do slide.
- Definir as regiões de interesse no assistente de detecção de tecido e guardá-las para as rodadas subseqüentes de imagem. Uma vez que cada slide é a instalação, iniciar o processo de digitalização, clicando no botão Iniciar verificação.
Nota: O sistema pode armazenar até 100 SLIdes de cada vez. - Uma vez que a imagem tenha terminado, exportar as imagens de cada canal e imagem rodada indivíduo como .tif ou .jpg para montagem e análise de imagem.
7. Imagem Assembléia
- método manual usando o Photoshop (ou software de edição de imagem semelhante capaz de produzir imagens em camadas).
- Abra cada imagem canal individual de cada rodada de imagem.
- Monte as imagens individuais como camadas dentro de uma imagem composta. Para fazer isso, clique sobre a camada na paleta camada de uma imagem. Em seguida, arraste a camada em uma outra imagem. Esta operação de arrastar e soltar irá criar uma nova camada na imagem. Faça isso para todas as outras imagens. Como alternativa, use um script (Arquivo> Scripts> Carregar Arquivos na Pilha ...) para automatizar esse processo ao carregar vários arquivos de imagens como camadas em uma pilha de imagens.
- Uma vez que cada imagem é listado como uma camada individual na imagem composta, clique duas vezes no nome da camada para renomear a layers como necessário para discernir os diferentes canais.
- A fim de ver através de cada camada e criar uma imagem verdadeiramente composto, mudar o modo de mistura para cada camada de "Normal" para "Screen" dentro da paleta de camadas.
Nota: Para acelerar este passo, mudar uma única camada para a tela, clique com o botão direito sobre a camada, selecione "estilo de camada cópia", em seguida, destacar todas as outras camadas e selecione "colar estilo de camada" para aplicar o estilo tela para o outro camadas. - Se desejado, diminuir a opacidade (valor de alteração a 10 - 40%) da camada cromogénico (isto é, azul de toluidina) para melhor visualizar os sinais fluorescentes através da camada cromogénico.
Nota: O microscópio de varredura de azulejos utilizados no presente protocolo mantém os slides em 3 arestas, minimizando assim a quantidade de rotação que pode ocorrer ao slide durante cada rodada de imagem. Portanto, é muito mais fácil para o usuário para alinhar manualmente as imagens sem ter que rodar as imagens derivadasa partir de diferentes rondas de imagiologia.
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Resultados
Um fluxo de trabalho geral para o Alto Rendimento, Multi-Imagem Cryohistology
A Figura 1 representa o fluxo de trabalho geral utilizado para esta técnica. Ele inclui várias etapas de fixação através de várias rodadas de imagem e, finalmente, de alinhamento de imagem / análise. O processo pode demorar tão pouco como uma semana para ir de fixação de amostra através de 4 rodadas de imagem, o que ...
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Discussão
Aqui nós apresentamos um protocolo cryohistology detalhada para co-localizar e quantificar várias medidas biológicas, alinhando imagens de várias rodadas de coloração / imagens em uma única seção. O método descrito utilizando o cryotape é especialmente útil uma vez que mantém a morfologia do tecido difícil de secção (por exemplo, osso mineralizado e cartilagem). Além disso, o tecido seccionados é aderida firmemente para a lâmina de vidro, para permitir que vários ciclos de coloração / imagem da mesma secção; Ao...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer as seguintes fontes de financiamento: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 e T90-DE021989.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10% de formalina tamponada neutra | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Vários fornecedores disponíveis. Tóxico. Pode ser substituído por paraformaldeído a 4%. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Vários fornecedores disponíveis. |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | Diferentes tamanhos podem ser usados dependendo do tecido |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | Pode ser substitituado com outras criometrias. No entanto, as resinas à base de PVA/PEG funcionaram melhor em nossas mãos. |
| 2-metil-butano | Sigma Aldrich | M32631 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Criostato | Leica Biosystems | 3050s | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Disco de amostra | Leica Biosystems | 14037008587 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Lâminas de criostato | Thermo Scientific | 3051835 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Roller | Microscopy Sciences | 62800-46 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Lâminas de microscópio de plástico | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Lâminas de microscópio de vidro | Thermo Scientific | 3051 | Pode ser substituído por outras marcas/modelos. |
| Adesivo Óptico Norland, 61 | Adesivo Óptico Norland Óptico | 61 | |
| Luz Negra UV | General Electric | F15T8-BLB | |
| Ácido acético glacial | Sigma Aldrich | ARK2183 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Chitosan | Sigma Aldrich | C3646 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Microscóferas vermelhas InSpeck | ThermoFisher Scientific | I-14787 | |
| Microesferas verdes InSpeck | ThermoFisher Scientific | I-14785 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Complexo de alizarina | Sigma Aldrich | A3882 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Demeclociclina | Sigma Aldrich | D6140 | Vários fornecedores disponíveis. |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G5516 | Vários fornecedores disponíveis. |
| ELF 97 substrato de fosfatase ácida fluorescente amarela | ThermoFisher Scientific | E-6588 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Vários fornecedores disponíveis. Pode ser substituído por Hoechst 33342 ou outros corantes nucleares. |
| TO-PRO-3 (contracoloração nuclear Cy5) | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Iodeto de propídio | ThermoFisher Scientific | R37108 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Acetato de sódio anidro | Sigma Aldrich | S2889 | Vários fornecedores disponíveis. |
| tartarato de sódio dibásico di-hidratado | Sigma Aldrich | T6521 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Nitrito de sódio | Sigma Aldrich | S2252 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Tris | Sigma Aldrich | 15504 | Vários fornecedores disponíveis. |
| MgCl2 hexahidratado | Sigma Aldrich | M9272 | Vários fornecedores disponíveis. |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Sal TR Vermelho Rápido | Sigma Aldrich | F8764 | Vários fornecedores disponíveis. Também pode ser substituído por outros kits de substrato, como Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300) |
| Naftol AS-MX | Sigma Aldrich | N4875 | Vários fornecedores disponíveis. |
| N,N dimetilformamida | Sigma Aldrich | D158550 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Toluidine azul O | Sigma Aldrich | T3260 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | Outros scanners lineares ou lado a lado também podem ser usados. |
| Conjunto de filtros DAPI | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| CFP Conjunto de Filtros | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| Conjunto de Filtros GFP | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| Conjunto de filtros YFP | Chroma Technology Corp. | 49003 | |
| Conjunto de filtros amarelo personalizado (ELF 97) | Chroma Technology Corp. | costume; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr | |
| Conjunto de filtros TRITC | Chroma Technology Corp. | 49004 | |
| Cy5 Conjunto de Filtros | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| CryoJane Sistema de Transferência | Fita Microscopia Eletrônica Ciências | 62800-10 | Vários fornecedores disponíveis. |
| CryoJane Tape Windows | Microscopia Eletrônica Ciências | 62800-72 | Vários fornecedores disponíveis. |
| Corrediças Adesivas CryoJane | Microscopia Eletrônica Ciências | 62800-4X | Vários fornecedores disponíveis. |
Referências
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- Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
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