Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

دمج المطلق والنسبي البيانات الكمية PCR لتحديد STAT3 لصق النصوص البديل

Published: October 9, 2016 doi: 10.3791/54473
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison

Introduction

قصيرة المدى (جنبا إلى جنب) الربط البديلة، حيث بديلة متقبل أو الجهات المانحة المواقع هي على مقربة من بعضها البعض، هو أمر شائع في الثدييات 1، 2 اللافقاريات والنباتات 3. وتشير التقديرات إلى أن 20٪ من جينات الثدييات تحتوي على مواقع لصق بديلة 2-12 النيوكليوتيدات عدا 4. العديد من هذه المواقع هي 3 النيوكليوتيدات، وبصرف النظر يؤدي إلى إدراج أو استبعاد كودون واحد. هناك جدل حول طبيعة تنظيم الربط في هذه المواقع 5،6 حيث رأى البعض أن الخلافات الربط عزر خفية بحيث الاختيار العشوائي 7، في حين الاستدلال الآخرين التنظيم على أساس خصوصية الأنسجة 8.

وقد تم تحليلها جنبا إلى جنب اختيار الموقع لصق شبه كميا باستخدام المعدلة الكهربائي الشعرية 7، وعالية الدقة هلام الكهربائي 8. RNA تسلسل (RNA تسلسل) يقرأ يمكن استخدامها لقياس نسب الربط في كل لصقموقع. في هذه الطريقة، وقد وفرت بيانات الحمض النووي الريبي يليها ثاقبة في تنظيم المواقع جنبا إلى جنب لصق 9. وقد مكن أيضا التنبؤ نسب البديل لصق المتوقع على أساس النوكليوتيدات عزر 10. أكثر من التركيز على الربط الذي يشمل أو يستثني كانت رامزة واحدة على تحدث أكثر شيوعا المواقع لصق جنبا إلى جنب متقبل، والمعروفة باسم NAGNAGs (حيث N = أي النوكليوتيدات).

جنبا إلى جنب المانحة المواقع لصق البديلة بما في ذلك أو استبعاد كودون واحد (GYNGYN الاعتراف عزر، حيث = Y بيريميدين) هي أقل شيوعا من يقبلون جنبا إلى جنب. محول الإشارات ومنشط النسخ 3 (STAT3) هو جين رئيسي تمر جنبا إلى جنب المانحة الربط البديل 1،11. المواقع لصق جنبا إلى جنب المانحة تنضم الإكسونات 21 و 22 و تؤدي إلى إدراج أو استبعاد رامزة لسيرين-701 (S أو ΔS على التوالي) 1،11. مواقع المصب بديلة متقبل (40 النيوكليوتيدات بعيدا عن بعضها البعض) الانضمام الإكسونات 22 و23A / ب نتيجة في إدراج إما 55 البقايا النهائية للمجال transactivation (α) أو مجال transactivation اقتطاع مع 7 بقايا C-محطة فريدة من نوعها (β) 11. ولذلك، أربعة أنواع لصق ممكنة.

البروتين STAT3 هو عامل النسخ وتكامل إشارة رئيسيا في العديد من أنواع الخلايا 12 وعندما تحور تفعيله التأسيسي يساهم في العديد من الظواهر السرطان (إعادة النظر في المرجع 13). متلازمة أيوب، اضطراب نقص المناعة تتميز بمستويات عالية من فريق الخبراء الحكومي الدولي، ويتسبب أيضا عن طريق الطفرات في STAT3 (إعادة النظر في المرجع 14). كانت أدوار متميزة للα STAT3 والبروتينات β لصق البديل سابقا ووصف 15. في البداية، كان يعتقد STAT3 β للعمل في المهيمنة سلبية على نحو 16 استعداء النشاط النسخي STAT3 α، ولكن اقترح العمل اللاحق لديها الجينات المستهدفة مستقلة 17 18)، ولكن تشير دراسة حديثة أن STAT3 S وΔS المتغيرات لصق على حد سواء اللازمة لبقاء المدمنين STAT3 منتشر كبير خلية B الغدد اللمفاوية (DLBLCL) خلايا 19. وتبقى أهمية بيولوجية لاستكشافها. وبالنظر إلى أن تكوين لصق البديل يمكن أن تؤثر على وظيفة، سعينا لاكتشاف ما إذا كانت منزعجة نسبة من التحفيز خلوى في الحمضات.

لقد حاولنا في البداية لاستكشاف الربط بين الأحداث الربط اثنين باستخدام PCR محددة لα STAT3 والمتغيرات β لصق، تليها انشقاق من المنتجات مع تقييد انزيم معين لمتغيرات S لصق، AfeI. وأشارت كثافة من المنتجات إدراج كانت Ser701 صoughly عشر مرات أكثر شيوعا من حذفها (ΔS) في كل α STAT3 وβ (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، كان هذا النهج نصف الكمية لا يمكن استنساخه بما فيه الكفاية، ولا يمكن استخدامها بفعالية لقياس جميع لصق أربعة متغيرات في وقت واحد. تحليل نسب كل من الخيارين لصق أربعة، كان من الضروري وضع بروتوكول الكمي PCR (QPCR) التي أسفرت عن ضيق التقنية (عدة فحوصات لعينة معين) يعيد.

يعتمد النسبية QPCR على المقارنة بين الجينات التي تهم جين القياسية أو التدبير المنزلي المعروف أن أعرب في معين مستوى 20 ومناسب عندما يتم تضخيم هذا الجين من الفائدة والجينات التدبير المنزلي بكفاءة مماثلة. والذين تقطعت بهم السبل (س) فلوري (cyanine) صبغ مزدوج الحمض النووي ملزم يربط amplicons PCR 21، وبعد عدد معين من الدورات، حدث تضخيم كافية لمضان أن تكون قابلة للكشف. كلما ارتفع مستوى الأوليمن النص، وانخفاض دورة عتبة (CT) قيمة. حيث أن تركيز الاستعدادات كدنا] يختلف، ويحتاج المرء لمقارنة تركيز نص مع تركيز على نسخة من المعروف أن أعرب في مستوى ثابت في جميع العينات، مثل غلوكورونيداز-β (GUSB) في الحمضات 22.

النسبي QPCR ليس من الممكن لمتواليات مشابهة إلى حد كبير، كما رأينا في المتغيرات لصق الناتجة عن الربط جنبا إلى جنب. الشروط الصارمة المطلوبة لتضخيم تحديدا المتغيرات لصق تؤدي إلى كفاءة انخفضت. بدلا من ذلك، يجب استخدام الكمي المطلق 23. هذا يستلزم إعداد المنحنى القياسي مع تركيزات معروفة من نص تقسم المصالح، وضمان ظروف PCR تحسين النوعية 24. كما هو موضح، البيانات QPCR المطلقة والنسبية لجين معين يمكن دمجها لإبلاغ فهم تعبير الجين في نوع خلية معينة، فيهذه الحالة STAT3 في الحمضات حفز مختلفة 25.

هنا، يتم وصف STAT3 لصق البديل الكمي مع توقع أن الطريقة يمكن تكييفها لدراسات المستهدفة من الأحداث جنبا إلى جنب الربط الأخرى. كان تحسين عملية طويلة، حيث تم اختبار عدة أزواج التمهيدي في تركيزات مختلفة والعديد من التكرارات من المعلمات الدراجات على مدى بضعة أشهر. الملامح الرئيسية لبروتوكول هي التحقق من صحة خصوصية التمهيدي وتقدير على أساس المنحنيات القياسية مع تركيزات معروفة من المتغيرات لصق. QPCR النسبي بالتزامن ثبت مفيدة لطلبنا ولكن ليس من الضروري.

Protocol

ملاحظة: وردت الحمضات في الدم المحيطي دون تحديد المعلومات في اتفاق مع بروتوكول المعتمد (# 2013-1570) من جامعة ويسكونسن ماديسون مركز العلوم الصحية جنة المراجعة المؤسساتية. تم الحصول على توقيع الموافقة المسبقة من الجهات المانحة لاستخدام كل عينة في مجال البحوث.

1. إنشاء البلازميدات كما معايير قالب

  1. إنشاء الاشعال لamplicon تشمل كلا من المواقع لصق STAT3، مع 5'- مواقع KpnI وNheI تقييد (و5'-ملحقات) كما في الجدول 1A.
    ملاحظة: تم اختيار مواقع KpnI وNheI لتمكين إدراج ليتم ligated في ناقلات PET-28A تعديل مع المقاومة كانامايسين 25،26 أضيفت الموقع KpnI في موقع استنساخ متعددة.
  2. باستخدام الحمضات تبرعت حديثا، وإعداد عينات مزدوجة من 2.5 × 10 6 خلية / مل في مستنبت الخلية (روزويل بارك ميموريالمعهد ل (RPMI) 1640 المتوسطة). احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 و 10٪ الرطوبة.
    1. إعداد التكميلي (ج) من الحمض النووي من عينات (على الأقل 1 × 10 6 خلايا في الإعداد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي ومجموعات التوليف [كدنا].
  3. من قالب [كدنا أعدت في الخطوة 1.2.1، تضخيم STAT3 لصق المتغيرات باستخدام PCR التضخيم حسب الجدول 2A.
  4. حل amplicons في الاغاروز 2٪ تريس، خلات-ethylenediaminetetraacetate (تاي) هلام 27. فرق الإنتاج من هلام وتنقية وفقا لتعليمات هلام عدة الختان.
  5. amplicons قطع والبلازميد مع إنزيمات المناسبة تقييد (نظرة عامة للتقييد في اشارة 27)، وذلك باستخدام وحدات التخزين، حضانة مرات ودرجات الحرارة موصى بها من قبل مزود الانزيم. وتنقية كما في الخطوة 1.4. Ligate amplicons مقيدة إلى البلازميد في ظل ظروف الموصى بها من مزود.
  6. إعداد تابع سلبيرول (مقيدة DNA البلازميد دون إدراج ولكن مع يغاز) والسيطرة الايجابية (البلازميد غير المقيد مع المقاومة كانامايسين). تنفيذ تحويلات البلازميد القياسية من E. المختصة القولونية DH5α 28 باستخدام خليط من ربط 27.
  7. احتضان تحولت E. القولونية في مل لوريا، مرق (LB) المتوسطة 1 (أعدت وفقا لتعليمات 27) تهتز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. transformants انتشار على لوحات LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  8. اختيار عدة مستعمرات من α STAT3 وألواح STAT3 β استخدام المسواك العقيمة 27. نقل كل إلى 2 مل LB. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز.
  9. تنقية البلازميدات من الثقافات البكتيرية عن طريق اتباع التعليمات الواردة في مجموعة تنقية الحمض النووي. متجر البلازميدات في -20 أو -80 درجة مئوية.
  10. البلازميدات تسلسل من عدة مستعمرات من خلال إعداد 20 ردود الفعل التسلسل ميكرولتر. ماصة 3ميكرولتر العازلة رد فعل التسلسل، 2 ميكرولتر مزيج رد فعل التسلسل، 12 ميكرولتر الماء عالى النقاء، 1 البلازميد ميكرولتر كقالب و 2 ميكرولتر التسلسل التمهيدي.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم ناقلات PET-28A، استخدم التسلسل التمهيدي 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 ".
    1. تقييم electrophoretograms من البلازميدات ترميز كل متغير: Sα، Sβ، ΔSα وΔSβ 25.
  11. تركيز قدر من البلازميد النقي في نانوغرام / ميكرولتر. إذا قراءة الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وحساب تركيز الحمض النووي باستخدام قانون بير لامبرت (29):
    المعادلة 1
    حيث c = تركيز، A = الامتصاصية، ε (انقراض معامل) = 0.02 (ميكروغرام / مل) -1 سم -1 لالمزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي وL = طول المسار الضوء (عادة 1 سم).
  12. باستخدام الأوزان الجزيئية للSTAT3 لصق البديل [كدنا صباحاplicons وناقلات، وحساب عدد نسخة لكل ميكرولتر.
    ملاحظة: الوزن الجزيئي لكل زوج قاعدة (بي بي) ويقدر إلى 650 دا.
    المعادلة 2

2. تحليل التمهيدي خصوصية لالمطلق QPCR

  1. إعداد 1 في 10 سلسلة التخفيف من البلازميدات STAT3، مع ~ 10 أغسطس - 10 مارس نسخ لكل ميكرولتر (20 ميكرولتر) باستخدام الماء عالى النقاء. تركيز مقياس الأكثر تركيزا (~ 10 8 نسخة لكل ميكرولتر، راجع الخطوة 1.11).
  2. استخدام البلازميدات المخفف لإعداد أربعة أمزجة "غير المستهدفة" (أي، سيطرة سلبية STAT3 ΔSβ التي تحتوي على تركيزات متساوية من STAT3 Sα، ΔSα، Sβ ولكن لا ΔSβ) في 10 6 نسخ في ميكرولتر لكل منهما. إعداد "الهدف" المزيج مع تركيزات متساوية من كافة القوالب الأربعة كل في 10 6 نسخ في ميكرولتر.
  3. يعد حل زوج التمهيديالصورة لكل لصق البديل (انظر الجدول 1B والشكل 1) بجعل ~ 60 ميكرولتر من الاشعال كل في 7 تركيز ميكرومتر (تركيز النهائي في عينة سيكون 560 نانومتر).
  4. تخفيف الحمض النووي بوليميريز / ملزم dsDNA مزيج صبغ 7: 5 مع H 2 O. النقي
  5. إعداد الفحص 1 في لوحة 96-جيدا PCR كما هو موضح في قالب (الجدول 3).
    1. إضافة 21 ميكرولتر المخفف الحمض النووي بوليميريز / dsDNA ملزم مزيج صبغة، ثم 2 ميكرولتر من مزيج التمهيدي و 2 ميكرولتر من القالب (كما في الجدول 2B). بدلا من القالب، إضافة 2 ميكرولتر تصفيتها H 2 O لرقابة أي قالب (NTC) أيضا. إعداد ردود الفعل في مكررة لتقييم التكرار 30.
  6. لوحة ختم QPCR مع غطاء لاصقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 x ج على 12 درجة مئوية.
  7. في حالة استخدام البرامج المذكورة في المواد، وإنشاء التجربة كما هو موضح.
    1. تشغيل آلة QPCR وإدراج مختومة لوحة QPCR. انقر فوق ملف &# 62؛ جديد> التالي> حدد "كشف جديد"، واختيار المراسل، فاكهه تقضي وتوفير الاسم. اقامة "كشف جديد" لكل لصق البديل.
    2. حدد التالي ووضع معايير كما هو مطلوب على إعداد الصفحة نموذج لوحة، وضمان كميات يتم إدخالها في الجدول ويتم اختيار كشف عن المناسبة. انقر فوق إنهاء.
    3. إعداد الدراجات حسب الجدول 2B. ضمان مضان القراءة (لتحديد ط) يحدث أثناء C خطوة 72 درجة في كل دورة. حدد تشغيل.
    4. عند تشغيل كاملة، انقر فوق علامة التبويب نتائج> علامة التبويب التضخيم المؤامرة. تقييم مؤامرة إخراج التضخيم لتقييم جودة البيانات (ابحث عن مؤامرة الأسي، كما في الشكل 2).
      ملاحظة: تأكد من المؤامرات التضخيم هي في معظمها الأسية والتي يمكن تعيين عتبة دورة في الجزء الأسي من هذه المؤامرة. لا تتضخم ضمان NTCS ونقاط قياسية أخرى تثبت قيمة ط منخفضة مع ΔRn عالية.
    5. لإكسبأورط يؤدي إلى برنامج جداول البيانات، انقر فوق ملف> تصدير> نتائج.

3. تقييم المطلق QPCR الفحص النوعية والتكرار

  1. التكرار
    1. استخدام البيانات من الخطوة 2.7.5 لحساب الانحراف المعياري ط م (دورة عتبة مضان) القيم.
      المعادلة 3
      حيث N = عدد العينات (2 إذا فعلت في نسختين)، المعادلة 4 = العينة ط م و المعادلة 5 = عينة ط يعني. تأكد من أن الانحراف المعياري للقيم ط م من التكرارات هو ≤0.2. تأكد من أن القيم ط م ولكن في جميع الآبار المجلس الوطني الانتقالي هي أصغر من 38.
    2. إذا التكرار هو الفقيرة المعلمات الأمثل الدراجات إما عن طريق زيادة أو تقليل وقت الصلب.
  2. مؤامرة نسخة سجل خدرإيه (كما هو محدد في الخطوة 1.12 وأعدت في الخطوة 2.1) مقابل قيمة ط م لإنشاء منحنى القياسية. العائد على المعادلة التالية:
    المعادلة 6
    حيث ذ ط، م هو التدرج، x هو السجل (عدد النسخ) وب هو القيمة اعتراض.
    ملاحظة: إن قيمة R 2 من الانحدار الخطي يكون ≥0.95 لبيانات جيدة.
  3. حساب الكفاءة التضخيم باستخدام المنحنى القياسي والمعادلة:
    المعادلة 7
    ملاحظة: الهدف لكفاءة ≥75٪.
  4. حساب خصوصية من QPCR فحص 1 باستخدام صيغة جدا ل:
    المعادلة 8
    حيث Δ ط = ط جدا الهدف - ط م غير المستهدفة، واصفا الفرق في عدد دورة عتبة أمبير محددة وغير محددةlification
    يجب أن يتجاوز خصوصية أربعة أوامر من حجم ملاحظة: (أي عامل خصوصية ≥4).
    1. إذا خصوصية والفقراء، وتحسين طريق خفض تركيز التمهيدي. إعداد المقايسات (كما هو موضح في الخطوات 2،5-2،7) مع تركيزات التمهيدي النهائية تتراوح بين 100 نانومتر إلى 500 نانومتر.

4. إجراء فحوصات QPCR النسبية

  1. علاج الخلايا مع السيتوكينات لتعزيز النسخ.
    1. لالحمضات تبرعت حديثا، وإعداد عينات مزدوجة من 2.5 × 10 6 خلية / مل في مستنبت الخلية (المتوسط 1640 RPMI) وعلاج مع 50 نانوغرام / مل انترلوكين 3 (IL3) و / أو 50 نانوغرام / مل عامل نخر الورم α ( TNFα) لفترات تتراوح بين 3 و 6 و 9 و 20 ساعة على 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2 و 10٪ الرطوبة.
  2. إعداد كدنا] من عينات الحمضية (على الأقل 1 × 10 6 خلايا في الإعداد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي والتوليف [كدنا مجموعات. إعداد التخفيفات المسلسل من اثنين قسامات عينة [كدنا (مراقبة أو عينات الراحة)، مع مجموعة والتخفيف من "1" إلى تخفيف "1 في 1024".
    1. ل1 في 4 التخفيف، ماصة 1 ميكرولتر [كدنا و 3 ميكرولتر الماء عالى النقاء.
    2. ل1 في 16 التخفيف، ماصة 1 ميكرولتر من 1 في 4 تخفيف و 3 ميكرولتر الماء عالى النقاء، الخ
  3. إعداد PCR في لوحة 96-جيدا مع 25 ميكرولتر ردود الفعل كما الخطوات الموضحة 2،3-2،5 لكن مع عدة تجمعات التمهيدي لSTAT3 عموم وGUSB (انظر قالب في الجدول رقم 4).
  4. إضافة "كشف جديد" لGUSB واتبع الخطوات 2،6-2،7، وذلك باستخدام المعلمات الدراجات هو موضح في الجدول رقم c2.
  5. توليد المنحنيات القياسية (انظر الخطوات 3.2 و 3.3) لتحديد تركيزات التمهيدي تؤدي إلى 95-100٪ كفاءة التضخيم.
  6. إعداد لوحة مع عينات مستعدة كدنا] (من الخطوة 4.2) وتركيزات التمهيدي الأمثل(انظر الجدول رقم c2 للمعلمات ركوب الدراجات، والكواشف والجدول 5 96-جيدا طبق قالب).
  7. تنفيذ الخطوات 2،6-2،7. تكرار الفحص مرة واحدة على الأقل، والتحقق من جودة البيانات.
  8. حساب متوسط قيمة ط م من عينة مكررة سنت لكل STAT3 وGUSB التدبير المنزلي الجينات.
  9. الحصول على قيم Δ ط م لكل عينة.
    المعادلة 9
  10. تعيين عينة الراحة (عادة ما يكون أقل تركيز من نص الفائدة) كما عينة 0. حساب ΔΔ ط م 31 لكل عينة (هنا تسمى عينة X):
    معادلة 10
  11. حساب أضعاف الزيادة لكل عينة:
    معادلة 11
  12. استنساخ
    1. حساب معامل الاختلاف (CV) من عدد نسخ لعموم STAT3 وGUSB.
      معادلة 12
      حيث N = عدد العينات، = عدد النسخ احتساب عينة و= متوسط العينة. تأكد من أن السيرة الذاتية من كل عينة (فحوصات متعددة) هو ≤10٪.

5. تحليل البيانات المطلق QPCR للعينات غير محدد

  1. مقارنة القيم ط حصلت في QPCR النسبي (كما هو موضح في الخطوة 4.9) لGUSB التدبير المنزلي الجينات لضمان تركيز [كدنا عينات 'هي في غضون ذلك من حجمها.
    1. تمييع [كدنا وفقا لذلك (على سبيل المثال، إذا عينة 1 يحتوي على قيمة ط م من ~ 17.5، والقيم ط عينات أخرى "هي ~ 21، عينة 1 هي تقريبا 2 (21-17،5) = 11 مرات أكثر تركيزا إجراء 1: التخفيف 1 مع الماء عالى النقاء ضمن نفس النطاق دون تمييع أكثر من اللازم).
      ملاحظة: سوف تركيزات انطلاق مختلفة إلى حد كبير التحيز تحليل الانحدار الخطي (خطوة 4.12).
  2. إعداد مقايسة QPCR المطلق للعينات. إعداد مقايسة لوحة قالب 2A لSα وSβ حسب الجدول 6؛ وإعداد 2B فحص لΔSα وΔSβ حسب الجدول 7. إجراء فحوصات كما هو موضح في الخطوات 2.6-2.7.3 (والجدول 2B). كرر فحوصات مرة واحدة على الأقل.
  3. والتحقق من جودة البيانات والتصدير كما هو موضح في الخطوات 2.7.4-2.7.5.
  4. اقامة المطلقة QPCR 96 لوحة جيدا مع 25 ميكرولتر ردود الفعل باستخدام بادئات عموم STAT3 (الاشعال في الجدول 1C، القالب في الجدول 8) في 400 ميكرومتر ومزيج من كل البلازميدات أربعة أو البلازميد واحد في مجموع تركيزات المدرجة.
    ملاحظة: الكفاءة لا يهم لQPCR المطلق، ولكن تحسين كفاءة هذه الاشعال مهم لQPCR النسبي (الخطوة 4).
  5. لوحة ختم QPCR مع غطاء لاصقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 x ج على 12 درجة مئوية.
  6. إعداد "كشف جديد" لعموم- STAT3 كما في الخطوات 2.7.1-2.7.3.
  7. إنشاء ركوب الدراجات لعموم STAT3 كما في الجدول رقم c2 (نفس الشروط QPCR النسبي). ضمان مضان القراءة (لتحديد ط) يحدث أثناء C خطوة 72 درجة في كل دورة. تكرار الفحص مرة واحدة على الأقل لضمان التكاثر.
  8. والتحقق من جودة البيانات وتصدير (انظر الخطوات 2.7.4-2.7.5).
    1. إذا المؤامرات التضخيم ليست الأسي (انظر الشكل 2)، وتمييع عينة [كدنا] (01:10) وتكرار الفحص كما هو موضح (الخطوة 5.7).
  9. باستخدام معادلة المنحنى القياسي (انظر 3.2، الشكل 3) والقيم ط العينات، وحساب عدد النسخ من كل لصق البديل وSTAT3 عموم في كل عينة.
    معادلة 13
  10. سجل مؤامرة (المطلقة QPCR عدد النسخ القيم التي تم الحصول عليها لعموم STAT3) مقابل السجل (QPCR القيم في عدد النسخ المطلقة التراكمية لSTAالمتغيرات T3 لصق).
    ملاحظة: سوف الانحدار الخطي المثالي والمنحدر القيم على حد سواء أن يكون ~ 1.
  11. حساب التكرار (الخطوة 3.1) والتكاثر (الخطوة 4.13).

6. دمج المطلق والنسبي البيانات QPCR

  1. مضاعفة نسبة متغير مع مجموع STAT3 أضعاف الزيادة لحساب أضعاف الزيادة من كل لصق البديل.
  2. حساب الانحرافات المعيارية (انظر الخطوة 3.1.1) من القيم المطلقة والنسبية لحساب انتشار الخطأ. تحديد الخطأ المعياري للقياس (SEM) كما هو مبين:
    معادلة 14

Representative Results

سوف البيانات QPCR نوعية جيدة توليد مؤامرة التضخيم السيني (الشكل 2A)، مما يدل على زيادة هائلة في النصوص على مدار ركوب الدراجات. وجود الكثير من قالب يمكن أن يؤدي إلى خلفية عالية مضان، وهذا يعني تحديد خط أساس غير مناسب في الدورات القليلة الأولى. إذا كانت البيانات لا توفر منحنى أسي (الشكل 2B)، مزيد من التحسين ضروري (الموضحة في الخطوات 3.1 و 3.4). لمزيد من المعلومات حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها النتائج QPCR، الرجوع إلى مرجع 32. والمنحنيات القياسية الناتجة عن البلازميدات قالب تدريج تشير إلى كفاءة التضخيم (منحنى لSTAT3 Sα هو مبين في الشكل 3). وقد لوحظت الكفاءة بين 83 و 95٪ وفقا للشروط وصفها. المعادلة للخصوصية (الخطوة 3.4) تفترض الكفاءة المتساوية، التي من غير المرجح 25، وبالتالي فإن خصوصيةومن المرجح أن يكون أكبر مما تشير عامل خصوصية.

من أجل تقييم التطابق مستويات STAT3، تم قياس القيم المطلقة من كل من الخيارين لصق أربعة وكذلك على المستوى الكلي STAT3، وباستخدام بادئات الأخيرة تضخيم منطقة مشتركة بين جميع المتغيرات لصق أربعة (الشكل 4). من الناحية المثالية الانحدار الخطي (إشارة إلى ارتباط) والمنحدر (نسبة STAT3 عموم لمتغيرات لصق لخص) يجب على أن تكون قريبة إلى 1.

وتعرض البيانات QPCR المطلقة كما الرسوم البيانية الدائرية لإظهار نسب المتغيرات لصق أربعة مع مرور الوقت بعد التحفيز مع السيتوكينات (الشكل 5A). كان يستريح الحمضات (0 ساعة) أصغر نسبة STAT3 Sα، على الرغم من أن هذا الخيار كان دائما الأكثر وفرة. ضرب جزء من STAT3 المتغيرات β لصق (S ^6؛ + ΔSβ) من قبل جزء من المتغيرات لصق STAT3 ΔS (ΔSα + ΔSβ) أعطى باستمرار قيمة أقل من القيمة المسجلة تجريبيا لΔSβ. إذا كانت الأحداث الربط مستقلة، يتوقع المرء أن يضاعف جزء من ΔS المتغيرات التي كتبها جزء من المتغيرات بيتا من شأنه أن يعطي القيمة التي تتفق مع قيمة تجريبيا. مستويات أعلى من ΔSβ مما كان متوقعا من أحداث الربط المستقلة تقترح وجود تحيز شارك في الربط.

دمج البيانات QPCR المطلق والنسبي أظهرت أن مستويات كل المتغيرات لصق STAT3 زادت بعد التحفيز مع السيتوكينات IL3 وTNFα، مع مستويات تبلغ ذروتها 6 ساعات ما بعد التحفيز (الشكل 5B - ه). لثلاثة من المتغيرات لصق أربعة، كانت مستويات النص ارتفاع ما يقرب من 3 مرات في IL3 + TNFα الحمضات المعالجة (6 ساعات) مقارنة الحمضات في وسائل الإعلامفي نقطة زمنية واحدة. وكانت مستويات STAT3 Sα أعلى 3.5 مرة في IL3 + TNFα الحمضات المعالجة مقارنة الحمضات في وسائل الإعلام في هذه المرحلة الزمنية. كان ينظر إلى أعظم اليقين (أكبر الخطأ المعياري للقياس) في ΔSβ (الشكل 5E)، التي تضم أصغر جزء من إجمالي STAT3 في جميع العينات. وهذا لم يكن من المستغرب، وترتبط مستويات منخفضة مع القيم ط أعلى. تتطلب المزيد من الدورات للوصول إلى ودورة عتبة تفاقم حالة عدم اليقين بسبب الاختلاف دورة إلى دورة في كفاءة التضخيم.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للأزواج التمهيدي استخدامها لتنفيذ QPCR من المتغيرات لصق STAT3 وعموم STAT3 الاشعال تستخدم لتضخيم وتحديدا في كل من متغيرات STAT3 لصق (Sα، Sβ، ΔSα وΔSβ على التوالي) هي الصورة.hown. الاشعال إلى الأمام (STAT3 "S" و "ΔS") تمتد من تقاطع بين الإكسونات 21 و 22. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: المؤامرات التضخيم من البيانات QPCR (أ) المؤامرات التضخيم السيني يعني التضخيم موثوق بها. وقد تم الحصول على هذه البيانات من QPCR اثنين من التخفيفات المسلسل تحتوي على البلازميد STAT3 Sα، مع كل زوج من خطوط ملونة تمثل مستويات مضان من عينات مكررة المخفف على مدار 40 دورة (محور س). العينة الأكثر تركيزا (الأخضر والرمادي) تم تضخيمه بشكل كاف دورة 17 (مع صبغ يتناسب مع مضان، كما هو موضح على المحور الصادي dsDNA ملزم) أن تتجاوز قيمة مضان عتبة (baseliشمال شرق كما هو موضح السهم الأخضر). أن قيمة ط م ليكون 17. (ب) المؤامرات غير الأسي تشير إلى أن عتبة خلفية مضان لم ينشأ بشكل صحيح في الدورات القليلة الأولى. هذا يمكن أن يكون بسبب وجود المانع، أو قالب عالية المركزة أو الاشعال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: منحنى قياسي من السجل (عدد نسخة من STAT3 Sα) مقابل ط هناك علاقة خطية بين سجل من عدد نسخ وعتبة دورة كل STAT3 لصق البديل في (ط). خلق منحنى قياسي من البلازميد يقلد [كدنا] عينات، وبالتالييوفر قياس أفضل من منحنى التي تم إنشاؤها من amplicons PCR المخفف. البيانات المقدمة هي القيم ط م تم الحصول عليها من QPCR اثنين من التخفيفات المسلسل تحتوي على البلازميد STAT3 Sα. من هذا المنحنى، وعدد نسخة موجودة في كل عينة يمكن محرف، وحساب الكفاءة التضخيم (83.9٪). على الرغم من اعتراض Y- هي أقل دقة من منحدر، يوحي اعتراض أن 42.2 دورات يكون من الضروري أن تكون على يقين لا DNA الهدف الحالي. أشرطة الخطأ تشير SEM، ن = شيدت 3. منحنيات المقارنة لSTAT3 Sβ، ΔSα وΔSβ (لا يظهر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مقارنة بين عموم كميا مقابل التراكمية المتغيرات STAT3 لصق. وتراجع لصق STAT3 أضاف المتغيرات مقابل إجمالي STAT3 ينبغي أن يكون منحدر (نسبة البنكرياس لتراكمي) و R 2 قيمة (ارتباط) بالقرب 1. القيم من 17 عينة (الحمضات وDLBCL) وشملت. أشرطة الخطأ تشير SEM من س إلى ص القرارات، ن ≥ 2 لكل منهما. شخصية مقتبسة من إشارة 20. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: تقلبت STAT3 مستويات البديل لصق على مدار العلاج خلوى (أ) التخطيطات الدائرية تشير النسب المئوية لكل STAT3 لصق البديلفي الحمضات خلال فترة العلاج مع IL3 وTNFα. (ب - ه) التغيرات في المتغيرات لصق STAT3 في الحمضات تعامل مع مجموعات مختلفة من السيتوكينات، ويقاس من خلال الجمع بين البيانات QPCR النسبية والمطلقة STAT3 Sα (ب)، Sβ (ج)، ΔSα (د)، وΔSβ (ه) المستويات. تقلبت على مر الزمن بعد التحفيز. مستويات زادت في البداية، وتبلغ ذروتها 6 ساعات ما بعد التحفيز. مزيج IL3 + TNFα أثارت التعبير أعلى من كل المتغيرات لصق أربعة STAT3 من IL3 وحدها. SEM احتساب النقطة لكل البيانات يمثل انتشار الخطأ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1
الجدول 1: الاشعال تستخدم لتضخيم (أ)، المطلقة (ب) والنسبية (ج) الكمي PCR. الاشعال استنساخ لها تسلسل القيد و5'-ملحقات لقطع كفاءة. يشار إلى تقييد مواقع KpnI وNheI بالخط العريض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 2
الجدول 2. المعلمات PCR ركوب الدراجات (يسار) وأحجام كاشف (يمين) لتضخيم (أ)، نسبة (ب)، المطلقة (ج) الكمي PCR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

3 / 54473tbl3.jpg "/>
الجدول 3: قالب لالمطلق QPCR البلازميد معايرة الفحص ضروري هذا الاختبار لتقييم استنساخ والكفاءة، فضلا عن توليد المنحنيات القياسية من خلالها أقحم البيانات. ويمزج "غير المستهدفة" تعطي تقديرا للخصوصية. قد يكون الأمثل اللازم لتحقيق الاتساق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 4
الجدول 4: قالب لQPCR النسبي (STAT3 عموم والتدبير المنزلي GUSB الجينات) معايرة فحص خلافا QPCR المطلق، وهذه النقطة من هذا الاختبار هو تحديد الظروف التي كفاءة التضخيم هو ~ 100٪.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 5
الجدول 5: نموذج للالنسبي QPCR عينة فحص لقياس عموم STAT3 والجينات التدبير المنزلي GUSB تتكرر المنحنيات القياسية جنبا إلى جنب مع عينات للتأكد من كفاءة مماثلة من المقايسات الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 6
الجدول 6: قالب لالمطلق QPCR عينة فحص لقياس المتغيرات S تتكرر المنحنيات القياسية جنبا إلى جنب مع عينات للتأكد من المؤسسة فكرة قابلة للمقارنة. iciency من المقايسات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 7
الجدول 7:. قالب لالمطلق QPCR عينة فحص لقياس المتغيرات ΔS تتكرر المنحنيات القياسية جنبا إلى جنب مع عينات للتأكد من كفاءة مماثلة من المقايسات الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

الجدول 8
الجدول 8: قالب لالمطلق QPCR عينة فحص لقياس STAT3 عموم.large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Discussion

وضعنا هذا البروتوكول من أجل تقييم مستويات ونسب النصوص البديل STAT3 لصق في الحمضات والخلايا سرطان الغدد الليمفاوية ومعرفة ما إذا كانت التحفيز خلوى أثرت على مستويات وأبعاد. STAT3 غير ذات أهمية خاصة بسبب وظائفه عديد المظاهر وغير مؤكد، مع تقارير متضاربة حول ما اذا كان بمثابة oncoprotein أو القامع ورم في السرطان (إعادة النظر في المرجع 33). وقد أدت الاختلافات بين STAT3 α و β لصق البديل وظيفة تميزت سابقا 34،35، وبروتوكول لدينا سهل تدق إلى أسفل / إعادة التعبير التحليل الذي يشير إلى وجود الحاجة إلى النسبة المثلى من S وΔS النصوص 19.

سوف تقدير دقيق للمتغيرات لصق متميزة تسهيل مزيد من التحقيقات في وظيفة تتعلق STAT3 غير متجانسة للصق تكوين متغير. بروتوكول يدمج البيانات QPCR المطلقة والنسبية، والجمع بين قدرة أبالمذاب QPCR لحساب نسب لصق البديل، وQPCR النسبي لقياس التغيرات في التعبير STAT3 العام. هذا النهج يسمح احد لتمييز الفروق الدقيقة في تسلسل في وقت واحد قياس نسب الربط في موقعين لصق بديلة أكثر من 50 النيوكليوتيدات على حدة. تحديد نسب للأحداث الربط بشكل فردي لن يكون أسفرت عن استنتاج بارز أن وجدت وجود تحيز شارك في الربط هؤلاء أن مستويات ΔSβ أكبر مما كان متوقعا إذا استخدامات الموقعين وتقسم عشوائيا 25.

الأهم من ذلك، QPCR المطلق مع استخدام البلازميد منحنيات المعايرة تمكن الكمي (في الكفاءة دون المستوى الأمثل) من الاختلافات لصق التي تؤدي إلى تسلسل مشابهة إلى حد كبير. نتوقع رواية الربط خفية QPCR الفحص يجب أن تأخذ ما يقرب من شهرين على الوجه الأمثل. الخطوات الرئيسية في تطوير الاختبار هي إنشاء البلازميدات STAT3 المستخدمة في توليد المنحنيات القياسية لQPCR مطلقة؛ بتمرستحديد تسلسل التمهيدي الأمثل والمعلمات الدراجات لضمان خصوصية والتكاثر. ودمج البيانات QPCR النسبية مشتقة من قياس عموم STAT3 التعبير بالنسبة إلى التعبير GAPDH. العلاقة من عدد نسخ كميا من قبل عموم STAT3 مقابل الكمي التراكمي (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) يدل على أن بروتوكول ينتج نتائج يمكن الاعتماد عليها.

والتحذير من هذه التقنية هو عملية التحقق من الصحة واسعة النطاق. فمن الضروري لتقييم التباين داخل فحص (التكرار)، وتقلب interassay (استنساخ) وخصوصية. يحدد البروتوكول الطرق للحصول على المخرجات الرقمية لهذه المعايير. نحن اعتبرت كفاءة ≥75٪، عامل خصوصية ≥4، معامل الاختلاف (استنساخ) ≤10٪ وط الانحراف المعياري (التكرار) ≤0.2 العتبات مناسبة 30. والطفرات أو الحذف في تسلسل الأحماض الأمينية STAT3 1-690 لا تكون discoveأحمر من هذا البروتوكول، على الرغم من أنها قد تؤثر على نسب الربط. قد لا تكون نسب نسخة يتناسب مع proteoform نسب 36.

منذ عينات تختلف فيما بينها مبالغ تبدأ من إجمالي كدنا]، QPCR المطلق هو مناسبة لمقارنة أعداد نسخة من المتغيرات لصق ضمن عينة ولكن ليس للمقارنة بين عينة ما لم تقترن QPCR النسبي باستخدام الجينات التدبير المنزلي المعمول بها. وصف طريقة يتفق مع المبادئ التوجيهية MIQE QPCR لاستنساخ 30. قد تحتاج إلى تعديل للحصول على بيانات قابلة للتكرار إذا تم استخدام معدات أخرى المعلمات الدراجات PCR وتركيزات التمهيدي. مثالية خصوصية غير ممكن دون المساس بشكل كبير كفاءة، ولكن تم تضخيم الهدف بكفاءة أكبر من خلال أكثر من أربعة أوامر من حجمها.

يتم تضخيمه الخطي الحمض النووي أكثر سهولة من التعميم. إذا لم البلازميد بديل يوفر منحنيات معيار مرضية (R 2 <. 0.95)، والنظر في linearizing البلازميد التي كتبها تقييد موقع واحد قبل الكمي. تحسين QPCR أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات ذات نوعية جيدة (الشكل 1). معظم البروتوكولات QPCR تعتمد على خطوتين ركوب الدراجات، ويتم تحسين الآلات وفقا لذلك. يمكن أن تتفاقم غير موحدة تسخين كتلة التدفئة في ثلاث خطوات ركوب الدراجات، وأسهم في تدهور حالة التكرار. يجب تعيين فحوصات تحت ظروف معقمة مع نصائح مرشح ماصة والماء عالى النقاء، من الناحية المثالية في غطاء تدفق الصفحي مخصص. بسبب الملوثات يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير متناسقة، وينبغي وضع المقايسات تحت ظروف معقمة مع نصائح مرشح ماصة والماء عالى النقاء، من الناحية المثالية في غطاء تدفق الصفحي مخصص. لمزيد من المعلومات حول QPCR الأمثل، والرجوع إلى Bustin وآخرون. 32

قياس STAT3 قد يؤدي إلى مزيد من التبصر في عدد من السياقات. STAT3 السيارات ينظم الخاص بها التعبير 37، والبروتوكول المذكورة أعلاه قد يساعدلتوضيح ما إذا كانت نسب المتغيرات لصق STAT3 تساهم في تنظيم هذه الحلقة ردود الفعل الإيجابية. يمكن استخدام البروتوكول لدراسة التحولات في نسب البديل لصق كما لوحظ في الخلايا عند اختلاف الكثافة 38 أو عبر مسار التنمية: من المعروف أن STAT3 التغييرات α / β نسبة في مستوى البروتين أثناء تكون الدم 16. ساندين وآخرون. وجدت أن واحدة النوكليوتيدات تعدد الأشكال الربط منحازة intronic من اكسون 12 في STAT3 للمريض يعانون من متلازمة أيوب 39. فمن المتصور أن واحدة من العديد من تعدد الأشكال الموجودة في إنترونات بين اكسون 21 و 22، أو اكسون 22 و 23 قد تسهم في نسب الربط من ΔS / S وα / β على التوالي. ويمكن استخدام الاختبار لتحديد النصوص STAT3 في الخلايا السرطانية، حيث طفرات أو تغيرات في تنظيم الربط قد يدخل التحيز لعملية الربط 40. طفرات في عوامل الربط (مثل SF3B1)، بصفة مراقبإد في متلازمة خلل التنسج النقوي 41 قد يؤدي أيضا إلى التغييرات التي يمكن أن يقاس هذا البروتوكول.

وعلى نطاق أوسع، وهذا النهج بالكشف عن تحديدا شارك في الجمعية في الربط، وهي ليست مجدية مع التقليدية RNA تسلسل، ولا QPCR القياسية. في حين أن ظاهرة الربط اكسون يتعارضان توضح تنسيق القرارات الربط، وشارك في جمعية أحداث الربط الأخرى لم-مدروسة جيدا. وهناك طريقة بديلة وصفها مؤخرا، والتي تم تعديلها RNA تسلسل وذلك لاستجواب كامل طول كدنا]، وتشير الأحداث الربط البعيد هي أكثر بالتشارك تعتمد مما كان يعتقد سابقا 42.

يحتوي STAT3 موقع لصق جنبا إلى جنب المانحة. متقبل المواقع جنبا إلى جنب لصق أصبحت أكثر تواترا 43 ومبادئ بروتوكول المبينة يمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق لتطوير فحوصات للكشف عن تزامن NAGNAG الربط والأحداث الربط الأخرى في حدود 200 النيوكليوتيدات. الهياج الآخرينوتشمل التطبيقات المكاني الكمي للصدفة أخرى الخلافات تسلسل خفية، مثل indels أو مزدوجة / النوكليوتيدات الثلاثي 44.

Acknowledgments

فإن الكتاب أن نعترف المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI لمشروع برنامج المنحة على دور بالحمضيات في التهاب الشعب الهوائية وإعادة عرض: P01HL088584 (PI: N. جرجور)، وجامعة ويسكونسن مركز سرطان كاربوني وقسم الطب للحصول على تمويل جماعية. نشكر دوغلاس أنيس لاستنساخ المتغيرات STAT3 الأربعة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MJ Research PTC-200 Thermal Cycler GMI N/A Used for standard PCR
7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems N/A qPCR machine
GS-6R Beckman Coulter N/A centrifuge for 96-well plates
Nanodrop 2000 sprectrophotometer ThermoFisher Scientific N/A
RPMI-1640 medium Sigma Aldrich R8758 cell culture medium
PfuTurbo DNA Polymerase Agilent Technologies 600410 DNA polymerase for standard PCR
KpnI New England Biosciences R0142S
NheI New England Biosciences R0131S
SYBR Green PCR Master Mix Qiagen 330523 qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix
Rneasy Mini Kit Qiagen 74204 RNA extraction kit
SuperScript III First-Strand Synthesis System Invitrogen (ThermoFisher Scientific) 18080-044 cDNA synthesis kit
Primers Integrated DNA Technology N/A
NEBuffer 1.1 New England Biosciences B7201S
GenePure LE Agarose ISC BioExpress E-3120-500 component of TAE gel
Pipettors Major lab suppliers (MLS) N/A
Filter pipette tips Neptune Scientific BT10XL, BT20, BT200
EU One Piece Thin Wall Plate MidSci ABI7501
ThermalSeal A Sealing Film MidSci TSA-100 96 well plate seal
pET-Elmer (variant of pET-28a) Novagen; modified in Mosher lab N/A Details in PMID: 20947497
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system Promega A1460 Plasmid purification
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ThermoFisher Scientific 4337455 Sequencing kit
QIAEX II Gel Extraction kit Qiagen 20021 Amplicon purification
DH5α competent cells ThermoFisher Scientific 18265-017 available from several providers, see PMID: 2162051
kanamycin Research Products International Corp. K22000-5.0
Tris base ThermoFisher Scientific BP152-5 component of TAE buffer
Acetic acid, glacial ThermoFisher Scientific A38C-212 component of TAE buffer
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) E-5134 component of TAE buffer
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705 component of Luria Broth
Bacto Yeast extract, technical BD Biosciences 288620 component of Luria Broth
Sodium chloride ThermoFisher Scientific S271-10 component of Luria Broth
Sodium hydroxide ThermoFisher Scientific SS255-1 component of Luria Broth
Bacto Agar BD Biosciences 214010 component of Luria Broth plate
Lasergene SeqBuilder DNASTAR Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65 (2006).
  2. Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
  3. Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159 (2008).
  4. Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
  5. Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
  6. Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
  7. Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
  8. Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
  9. Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229 (2012).
  10. Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
  11. Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
  12. Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
  13. Srivastava, J., DiGiovanni, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer. Mol Carcinog. , (2015).
  14. Holland, S. M., et al. STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome. N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).
  15. Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
  16. Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
  17. Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
  18. Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
  19. Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184 (2016).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
  22. Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
  23. Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
  24. Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
  25. Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243 (2015).
  26. Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
  27. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
  28. Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
  29. Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
  30. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
  32. A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
  33. Zhang, H. F., Lai, R. STAT3 in cancer-friend or foe. Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).
  34. Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
  35. Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
  36. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  37. Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
  38. Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
  39. Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
  40. Oltean, S., Bates, D. O. Hallmarks of alternative splicing in cancer. Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).
  41. Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
  42. Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
  43. Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
  44. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).

Tags

علم الوراثة، العدد 116، STAT3، الربط البديلة، البلمرة الكمي سلسلة من ردود الفعل (QPCR)، جنبا إلى جنب الربط، مطلقة QPCR، الحمضية، المتغيرات لصق
دمج المطلق والنسبي البيانات الكمية PCR لتحديد STAT3 لصق النصوص البديل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Turton, K. B., Esnault, S., Delain,… More

Turton, K. B., Esnault, S., Delain, L. P., Mosher, D. F. Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts. J. Vis. Exp. (116), e54473, doi:10.3791/54473 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter