Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

O objetivo geral deste protocolo é quantificar as proporções e os níveis absolutos de transcritos variantes de splice STAT3 em eosinófilos. Este método pode abordar questões-chave no campo de regulação do splicing, como a co-associação de eventos de splicing distal e a identificação de condições que podem fazer com que as proporções do splicing em tandem sejam diferentes. A principal vantagem desta técnica são os padrões de plasmídeo que permitem a aquisição de dados absolutos e relativos de qPCR para que possamos determinar proporções e níveis gerais de quatro transcritos STAT3.

Em nosso caso, desejamos aprender como as quatro variantes STAT3 S alfa, S beta, delta S alfa e delta S beta mudam quando os eosinófilos são estimulados por citocinas. Embora este método possa fornecer informações sobre a composição do STAT3 dos eosinófilos, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células para as quais o cDNA pode ser obtido. Como S e delta S variam em apenas três nucleotídeos, tivemos que sacrificar a eficiência para alcançar especificidade em qualquer um dos padrões para cada variante.

Neste protocolo, o cDNA preparado a partir de eosinófilos humanos é usado como modelo para amplificar as variantes de splice STAT3. Depois de criar os plasmídeos conforme descrito no protocolo de texto, prepare reações de sequenciamento para sequenciamento de plasmídeos de várias colônias. Cada reação de 20 microlitros deve conter três microlitros de tampão de reação de sequenciamento, dois microlitros de mistura de reação de sequenciamento, 12 microlitros de água ultrapura, um microlitro de plasmídeo e dois microlitros de primer de sequenciamento.

Quando os resultados da sequenciação estiverem disponíveis, avaliar os electroforetogramas dos plasmídeos que codificam cada variante; S alfa, S beta, delta S alfa e delta S beta. Meça a concentração de DNA de plasmídeo puro em nanogramas por microlitro e calcule o número de cópias por microlitro. Iniciar este procedimento preparando uma série de diluições em cada 10 plasmídeos STAT3 utilizando água ultrapura.

Com aproximadamente 10 para o oitavo a 10 para o terceiro exemplares por microlitro. Meça a concentração da amostra mais concentrada. Use os plasmídeos diluídos para preparar quatro misturas não-alvo como controles negativos para cada variante de emenda de 10 elevado a sextas cópias por microlitro para cada variante.

Prepare uma mistura-alvo com concentrações iguais de todos os quatro modelos, cada um em 10 elevado a sextas cópias por microlitro. Prepare soluções de pares de primers para cada variante de emenda com 60 microlitros de primers, cada um com uma concentração de sete micromolares, para uma concentração final de 560 nanomolares na amostra. Dilua a DNA polimerase, mistura de corante de ligação de DNA de fita dupla, sete a cinco com água pura.

Configure o ensaio em uma placa de PCR de 96 poços seguindo este modelo. Primeiro adicione a cada poço 21 microlitros da DNA polimerase diluída, mistura de corante de ligação de DNA de fita dupla. Em seguida, adicione dois microlitros de mistura de primer e dois microlitros de molde.

Para cada poço de controle sem modelo, adicione dois microlitros de água filtrada em vez de modelo. Configure as reações em duplicata para avaliar a repetibilidade. Sele a placa qPCR com uma tampa adesiva e centrifugue por cinco minutos a 1.200 g a 12 graus Celsius.

Ligue a máquina qPCR e insira a placa qPCR selada. Se estiver usando o sistema de PCR em tempo real da ABI, configure o experimento conforme demonstrado. Clique em Arquivo, Novo, Avançar, selecione novo Detector, forneça um nome e escolha um Repórter e um Quencher.

Configure um novo detector para cada variante de emenda. Selecione Avançar e configure os padrões conforme solicitado na página Configurar placa de amostra, garantindo que as quantidades sejam inseridas na tabela e os detectores apropriados sejam selecionados. Clique em Concluir.

Configure o programa de ciclagem de PCR apropriado. Certifique-se de que a leitura de fluorescência para determinar os valores do ciclo limite ocorra durante a etapa de 72 graus Celsius de cada ciclo. Selecione Executar.

Quando a execução estiver concluída, clique na guia Resultados Guia Gráfico de Amplificação. Avalie o gráfico de Amplificação de Saída para avaliar a qualidade dos dados. Um gráfico exponencial indica amplificação confiável.

Exporte os resultados para um software de planilha. A análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto é fundamental para saber se o ensaio requer otimização adicional por uma questão de reprodutibilidade. O cDNA para este ensaio é preparado a partir de eosinófilos tratados com citocinas para promover a transcrição.

Preparar diluições em série de duas alíquotas de cADN de amostras, com um intervalo de diluição de um a um em 1,024. Configure o ensaio em uma placa de 96 poços com reações de 25 microlitros, conforme demonstrado para analisar a especificidade do primer, mas com várias concentrações de primer para pan STAT3 e um gene de manutenção GUSB. Um modelo é mostrado nesta tabela.

Insira a placa PCR selada na máquina qPCR. Configure o experimento usando o software, adicionando um novo detector para GUSB e usando o programa de ciclagem de PCR apropriado. Posteriormente, os resultados são usados para calcular o valor do ciclo limite para cada amostra, conforme descrito no protocolo de texto.

Para iniciar este procedimento, compare os valores do ciclo limite obtidos em qPCR relativo para o gene de manutenção GUSB e dilua o cDNA de acordo com a água ultrapura para garantir que todas as concentrações estejam dentro de uma ordem de magnitude. Configure os ensaios absolutos de qPCR das amostras em placas de 96 poços. Siga este modelo para S alfa e S beta e este modelo para delta S alfa e delta S beta.

Efectuar os ensaios como indicado anteriormente e repetir os ensaios pelo menos uma vez. Em seguida, configure uma placa absoluta de qPCR de 96 poços com reações de 25 microlitros usando primers pan STAT3 a 400 micromolares e uma mistura de todos os quatro plasmídeos ou um único plasmídeo seguindo este modelo. Sele a placa qPCR com uma tampa adesiva e centrifugue por cinco minutos a 1.200 g a 12 graus Celsius.

Insira a placa PCR selada na máquina qPCR e configure o experimento conforme mostrado anteriormente, adicionando um novo detector para pan STAT3. Configure os mesmos parâmetros de ciclo que para qPCR relativo. Depois de repetir o ensaio pelo menos uma vez, analise os resultados conforme descrito no protocolo de texto.

Dados de qPCR de boa qualidade gerarão um gráfico de amplicação sigmoidal, significando um aumento exponencial nos transcritos ao longo do ciclo. Esses dados foram obtidos a partir de qPCR de duas diluições seriadas de plasmídeo contendo STAT3 S alfa. Cada par de linhas coloridas representa os níveis de fluorescência de amostras diluídas duplicadas ao longo de 40 ciclos.

As curvas padrão geradas para os plasmídeos do calibrador de modelo indicarão a eficiência da amplificação. Nesta curva para STAT3 S alfa, a eficiência de amplificação foi de 83,9%Para avaliar a congruência dos níveis de STAT3, foram medidos os valores absolutos de cada uma das quatro variantes de splice, bem como o nível de STAT3 total. Idealmente, tanto a regressão linear quanto a inclinação devem estar próximas de um.

Os dados absolutos de qPCR são apresentados como gráficos de pizza para mostrar suas proporções das quatro variantes de splice STAT3 ao longo do tratamento com citocinas. A fusão de dados absolutos e relativos de qPCR demonstrou que os níveis de todas as variantes de splice STAT3 aumentaram após a estimulação com as citocinas IL3 e TNF alfa, com níveis atingindo o pico em seis horas. O agrupamento dos dados de todos os pontos de tempo revelou um viés pequeno, mas significativo, para a co-associação dos eventos de splicing beta e delta S.

Uma vez otimizados, os ensaios baseados nessa técnica podem ser realizados em quatro horas, se realizados corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em condições estéreis para evitar contaminação. As decisões de emenda que incluem ou excluem um códon são responsáveis por 20% da variação de emenda no quadro.

Nosso protocolo deve ser prontamente adaptável à quantificação de tais variações. Após seu desenvolvimento, essa técnica permitiu que Mao Zhang trabalhasse com meu grupo no grupo de Li-Shan Rue para controlar experimentos de reexpressão de knockdown de variantes STAT3 em células de linfoma ABC. Esses experimentos demonstraram que uma mistura de variantes S e delta S é necessária para a sobrevivência celular em cultura.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar qPCR absoluto e relativo e as condições apropriadas para distinguir e quantificar diferenças sutis de splicing.