Rápida em uma etapa enzimática Síntese e All-aquosa Purificação da trealose Análogos

Lisa M. Meints; Anne W. Poston; Brent F. Piligian; Claire D. Olson; Katherine S. Badger; Peter J. Woodruff; Benjamin M. Swarts

doi:10.3791/54485

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Artigo de método

Rápida em uma etapa enzimática Síntese e All-aquosa Purificação da trealose Análogos

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DOI:

10.3791/54485

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17 de fevereiro de 2017

Lisa M. Meints¹ , Anne W. Poston¹ , Brent F. Piligian¹ , Claire D. Olson¹ , Katherine S. Badger² , Peter J. Woodruff² , Benjamin M. Swarts¹

¹Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan University, ²Department of Chemistry, University of Southern Maine

Neste artigo

Resumo

Os análogos da trealose estão emergindo como moléculas importantes para aplicações bio(tecnológicas)lógicas e biomédicas. Descrevemos um protocolo otimizado para sintetizar e purificar enzimaticamente análogos da trealose que é simples, eficiente, rápido e ecologicamente correto. Sua aplicação à rápida produção e administração de uma sonda para a detecção de micobactérias é demonstrada.

Resumo

versões de trealose, ou análogos de trealose quimicamente modificados, têm aplicações em biologia, biotecnologia e ciência farmacêutica, entre outros campos. Por exemplo, análogos de trealose rolamento etiquetas detectáveis têm sido utilizados para detectar o Mycobacterium tuberculosis e pode ter aplicações como agentes de imagiologia de diagnóstico de tuberculose. versões hidroliticamente estáveis de trealose também estão sendo perseguidos devido ao seu potencial para uso como adoçantes não calóricos e agentes bioprotetoras. Apesar do recurso desta classe de compostos para diversas aplicações, o seu potencial permanece insatisfeita devido à falta de uma rota robusta para a sua produção. Aqui, relatamos um protocolo detalhado para a síntese de um só passo biocatalítico rápida e eficiente de análogos de trealose que ultrapassa os problemas associados com a síntese química. Através da utilização da enzima termoestável trealose sintase (t Ret) de Thermoproteus tenax, análogos de trealose pode ser generatEd num único passo a partir de análogos de glucose e glucose uridina difosfato com um rendimento elevado (até à conversão quantitativa) em 15-60 min. Um protocolo de purificação de não-cromatográfico simples e rápida, que consiste de diálise e centrifugação de permuta iónica, pode proporcionar muitos análogos de trealose de concentração conhecida em solução aquosa em menos de 45 min. Nos casos em que não reagiu análogo de glucose ainda permanece, purificação cromatográf ica do produto análogo de trealose pode ser realizada. No geral, este método fornece uma plataforma biocatalítico "verde" para a síntese acelerada e purificação de análogos de trealose que seja eficiente e acessível a não-químicos. Para exemplificar a aplicação do presente método, é descrito um protocolo para a síntese, todos aquoso purificação, e administração de um clique sonda química à base de trealose a micobactérias, todas as quais demorou menos de uma hora e permitiu a detecção de fluorescência de micobactérias. No futuro, prevemos que, entre other aplicações, este protocolo pode ser aplicado para a rápida síntese de sondas à base de trealose para diagnóstico de tuberculose. Por exemplo, de curta duração análogos trealose modificado com radionuclídeos (por exemplo, ¹⁸ trealose F-modificada) poderiam ser usados para modalidades de imagens clínicas avançadas como a tomografia por emissão de positrões tomografia-computadorizada (PET-CT).

Introdução

A trealose é um dissacárido não redutor simétrico que consiste em duas metades de glicose que são unidas por uma 1,1-α, ligação α-glicosídica (Figura 1A). Enquanto trealose está ausente de seres humanos e outros mamíferos, ele é normalmente encontrada em bactérias, fungos, plantas e invertebrados ^1. O principal papel da trealose na maioria dos organismos é proteger contra stresses ambientais, tais como dessecação ^1. Além disso, alguns agentes patogénicos humanos exigir trealose para virulência, incluindo o Mycobacterium tuberculosis causadoras de tuberculose, a qual utiliza trealose como um med....