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Artigo de método

Manipulação genética do patógeno de planta

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DOI:

10.3791/54522

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30 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma estratégia de substituição de genes robusta para manipular geneticamente o fungo Ustilago maydis smut. Este protocolo explica como gerar mutantes de deleção para investigar fenótipos de infecção. Ele pode ser estendido para modificar os genes de qualquer forma desejada, por exemplo, através da adição de uma sequência que codifica uma etiqueta de proteína fluorescente.

Resumo

Deleção do gene desempenha um papel importante na análise da função dos genes. Um dos métodos mais eficazes para interromper genes de forma direcionada, é a substituição de todo o gene com um marcador seleccionável através de recombinação homóloga. Durante a recombinação homóloga, a troca de DNA ocorre entre sequências com alta similaridade. Portanto, sequências genómicas flanqueadoras lineares um gene alvo podem ser utilizados para dirigir especificamente um marcador seleccionável para o local de integração desejada. extremidades rombas do construto eliminação activar sistemas de reparação do ADN da célula e, assim, promover a integração da construção, quer através de recombinação homóloga ou por não-homóloga-fim de aderir. Em organismos com recombinação homóloga eficiente, a taxa de supressão de gene bem sucedida pode chegar a mais de 50%, tornando esta estratégia de um sistema de interrupção de genes valioso. O fungo smut Ustilago maydis é um microorganismo modelo eucariótica mostrando como recombinat homóloga eficienteíon. Fora dos seus cerca de 6900 genes, muitos foram funcionalmente caracterizados com a ajuda dos mutantes de deleção, e repetiu falha de pontos de tentativas de substituição de genes em função essencial do gene. posterior caracterização da função gênica por marcação com marcadores fluorescentes ou mutações de domínios previstos também se baseia na troca de ADN através de recombinação homóloga. Aqui, apresentamos o U. maydis estratégia de geração de tensão em detalhe utilizando o exemplo mais simples, a deleção do gene.

Introdução

Ustilago maydis é um fungo fitopatogénico modelo que tem sido estudada extensivamente durante décadas 1,2. Ela existe em duas morfologias,, um estágio não-patogênica do tipo levedura e uma filamentosos, forma infecciosa 3. Descobertas revolucionárias universais, tais como mecanismos de recombinação e reparo de DNA homólogas foram feitas na fase de crescimento do tipo levedura do fungo 4. Além disso, o interruptor morfológico ao filamento e virulência infecciosas factores importantes para a infecção são bem caracterizado 5,6. O conhecimento molecular crescente sobre a biologia e virulência do fungo ferrugem se baseia em uma estratégia de substituição de genes simples 7-9 apoiado por uma excelente genoma anotação 10 e a facilidade de genética reversa usando, por exemplo, a coleção plasmídeo bem organizado pelo nosso instituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Padronizados, ensaios de infecção rápidas no milho seedlings permitem estudos detalhados de patogenicidade Fatores de 11.

O genoma de U. maydis contém cerca de 6900 genes 10. Para estudar a sua função, eles podem ser suprimidos individualmente ou em combinação, devido a um sistema de recombinação homóloga eficiente. Regiões de f lanqueamento de cerca de 1 kb contendo extremidades perfeitamente homólogas são ideais para as taxas de recombinação homóloga maior do que 50%, mas já de 250 pb com extremidades não homólogas permitir um certo grau de integração correcta da construção 9. Atualmente, cinco cassetes de resistência diferentes, hygR, cbxR, NATR, G418R, e phleor mediar resistência contra higromicina, carboxin, nourseothricin, G418 e fleomicina, são utilizados para seleccionar os transformantes 7,9. Além disso, a resistência à higromicina foi desenvolvido em uma cassete reciclável (FRT-hygR) que pode ser removido por a expressão transiente de uma recombinase FLP heterólogo 12. Isto permite a remoção da cassete de resistência e, portanto, em teoria modificações genéticas ilimitadas. Fleomicina é mutagénica 13, de modo que, com as novas cassetes, em particular, a cassete hygR reciclável, o uso de phleor está a diminuir. Quádruplos mutantes podem, portanto, ser geradas utilizando as outras quatro cassetes, mas para os mutantes quíntuplo, o sistema de DRF-hygR é recomendado 14.

Esta estratégia geral deleção do gene foi transferido com sucesso para outros fungos obscenidade como Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 e, portanto, oferece o potencial para futuras aplicações em organismos geneticamente ainda intratáveis com um sistema de recombinação homóloga eficiente. Além disso, os organismos que carecem de recombinação homóloga pode ser modificado para melhorar a engenharia genética, tal como exemplificado pela deleção de genes envolvidos em não-homóloga-end-unindo em Neurospora crassa 18,19.

Aqui nós descrevemos a estratégia de deleção do gene publicada por U. maydis 7,9 em detalhe experimental com foco na verificação rápida e precisa dos candidatos. Como um exemplo, usamos as quitinases de fungos e descrevem a geração de mutantes individuais, bem como a eliminação múltiplas estirpes 20,21. Quitinases são exemplos interessantes, porque actuam sobre quitina na parede celular rígida. remodelação da parede celular é necessária para modificações morfológicas durante a divisão celular, mudar para o crescimento filamentoso, e a formação de esporos. Assim, em fenótipos mutantes de deleção em todo o ciclo de vida pode ser esperado.

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Protocolo

1. Geração de deleção Construções

  1. Gerar um plasmídeo contendo a construção de eliminação (Figura 1) que compreende um respectivo flanco de 1 kb a montante (UF) e flanco a jusante (DF) cada e a cassete de resistência adequada flanqueada por locais de restrição de corte brusco.
    NOTA: Qualquer estratégia de clonagem pode ser utilizada (para clonagem ver referência 22) recomendamos Golden Gate clonagem de tais plasmídeos 9.
  2. Excisar o deleção a construção do plasmídeo utilizando um cortador fechado para se obter 1 ug de DNA da delecção construir 9. Purifica-se o construto de eliminação para eliminar a enzima e o tampão 22 por exemplo, por utilização de reagentes comerciais e seguir as instruções do fabricante.
    NOTA: O esqueleto do vector pode permanecer na mistura de transformação.

2. Preparação de Protoplastos

NOTA: Manter condições estéreis durante todos os momentos do eXperiment. A parede celular é uma forte barreira protectora que limita o acesso de moléculas para a membrana plasmática. Para permitir a captação do ADN contendo a construção de eliminação, a parede celular tem de ser removido por parede celular de enzimas que degradam numa reacção protoplasting. As etapas críticas em preparação de protoplastos são: 1) a estabilização osmótica do meio e 2) evitar o estresse mecânico sobre os protoplastos.

  1. Mark 2 ml tubos com um fundo redondo para congelar os protoplastos e arrefecê-los a -20 ° C. Iniciar uma pré-cultura em 3 ml Yeps-luz de uma placa fresca da estirpe com o fundo genético desejado. Incubar numa roda rotativa durante 24 horas a 28 ° C.
    NOTA: A tensão pode ser a SG200 solopathogenic estirpe 10, as estirpes de tipo selvagem, cepas teste como AB33 23, ou algum fundo mutante para a geração de mutantes duplas. Certifique-se a tensão está livre da resistência desejada.
  2. Diluir a cultura em 50 ml Yeps-luz em um piscar perplexok e incubar num agitador orbital a 28 ° C com 200 rpm.
    NOTA: O tempo de duplicação é de cerca de 2 horas para as estirpes de tipo selvagem. Permitir três duplicações mínimo.
  3. Crescer até fase exponencial. Assegure-se que a densidade óptica, medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600), é de cerca de 0,8 (0,6 a 1,0 é aceitável). Uma OD600 de 1,0 corresponde a cerca de 1 a 2 x 10 7 U. maydis células por ml.
  4. Verificar as células de contaminação sob um microscópio. Use ampliação de 40x. Agregar as células da cultura completo 50 ml durante 5 min, 1,500 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 25 ml de citrato de sódio, solução de sorbitol (SCS), centrifugar 5 min, 1500 xg, e rejeitar o sobrenadante.
    NOTA: contaminações bacterianas podem ser identificadas como células pequenas e que se deslocam com frequência. Contaminações fúngicas podem ser identificados com base em um formato diferente ou tamanho de célula em comparação com as células em forma de charuto de U. maydis.
  5. durante centrifugation preparar solução protoplasting (12,5 mg / ml Trichoderma lise enzimas, em SCS; preparar 3 ml por pellet celular; filtro de esterilizar através de um filtro de 22 mm; solução tem de ser fresco para a atividade enzimática ideal). SCS é um estabilizador osmótico para evitar a ruptura de protoplastos após a remoção da parede celular.
  6. Ressuspender o sedimento em 2 ml de solução protoplasting. Incubar durante 5 a 20 min à temperatura ambiente e sob o microscópio vá até 30 a 40% das células são redondas ou como cabeças de alfinete (Figura 2).
    NOTA: Execute todas as etapas no gelo a partir de agora e lidar com protoplastos com cuidado!
  7. Lavar 3x em 10 ml de frio (4 ° C) SCS, centrifugar a 1000 xg durante 5 min.
  8. Ressuspender o sedimento em 10 ml de sorbitol frio, solução TrisHCl, CaCl2 (STC), giram a 1.000 xg por 5 min, elimine o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 mL de STC frio, fazer alíquotas de 100 ul nos tubos arrefecidos. Congelar as alíquotas a -80 ° C até à sua utilização.

3. Transformação de U. maydis

NOTA: A transformação do U. maydis protoplastos invoca o polietileno glicol (PEG) método de transformação mediada por, o que é tecnicamente simples e oposição a electroporação ou transformação biolística não requer equipamento especializado.

  1. Prepare as placas com duas camadas de seleção (2 placas por reacção de transformação). A camada inferior contém o antibiótico em uma concentração duplicou. Pipetar 12 ml de RegLight contendo 400 ug / ml de higromicina (ou 300 ug / ml nourseothricin ou 4 ug / ml carboxina ou 1 mg / ml de G418) para uma placa de Petri. Evitar bolhas.
    NOTA: placas de camada inferior pode ser armazenado um par de dias a 4 ° C, mas se preparar a camada superior de fresco durante a transformação (ver abaixo).
  2. protoplastos descongelamento em gelo (1 tubo / transformação). Adicionar 1 ml de heparina (15 mg / ml). Adicionar 1 ug de DNA (constructo linearizado) ou 10 ul de H 2 O (controle de água). Incubar durante 10 min em gelo.
  3. Durante este tempo, para a camada superior, distribuídos 12 ml liquefeitos RegLight (ferver e arrefecer a 60 ° C) sobre a placa de fundo RegLight.
    NOTA: Esta camada não contém antibióticos.
  4. Adicionar 500 ul STC / PEG (polietileno glicol) para o tubo de transformação (3. 2) e mistura-se cuidadosamente por inversão do tubo. Incubar 15 minutos em gelo.
  5. Distribuir cada reacção de transformação em duas das placas RegLight de duas camadas. Espalhe cuidadosamente e lentamente com uma pipeta de vidro. Incubar as placas na posição vertical a 28 ° C durante 5 a 7 dias, até que os transformantes crescer como colónias. Obter cerca de 100-200 colónias por placa.
    NOTA: Os números mais baixos pode ser causado por protoplastos "maus" que ou contêm parede celular muito e, portanto, não podem ocupar DNA ou não pode regenerar. O primeiro pode ser testada por transformação com um plasmídeo auto-replicante, o último por meio de testes em placas de regeneração sem antibióticos.
  6. Preparar Yeps-Luz placas contendo o antibiótico apropriado a 200 ug / ml de higromicina (ou 150 ug / ml nourseothricin ou 2 ug / carboxina ml ou 500 ug / ml de G418; estas concentrações iguais a metade do usado para placas de fundo). Re-purificar com pelo menos 24 colónias transformantes putativos sobre estas placas. As colónias simples deve ser obtida. Ao mesmo tempo raia a linhagem original em mídia não-seletivo.
    NOTA: As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 1-2 semanas.

4. Verificação da Correta de exclusão Eventos

NOTA: As mutações são verificados num processo de três passos (Figura 1). Em primeiro lugar, que contêm candidatos a cópia de tipo selvagem do gene são excluídos por PCR. Em segundo lugar, a integração da cassete de resistência dentro do locus é verificada por PCR. Em terceiro lugar, a integração da cassete de resistência à única no locus desejado é verificada por análise de mancha de Southern. verificação estirpe cuidado é ESSEntial, de modo que os fenótipos mutantes verdadeiramente correlacionar com a supressão.

  1. Primeiro diagnóstico PCR 20
    1. Conceber iniciadores de emparelhamento no gene a ser suprimido que resultam num produto de 250-600 pb (Figura 1). Tais pequenos produtos são fáceis de amplificar por PCR em uma colónia, e tempo suficiente para a detecção na electroforese em gel padrão.
    2. Para cada um dos candidatos e a estirpe original como um controlo positivo, ressuspender um pouco (quantidade de uma cabeça de alfinete) de material de células de uma única colónia com um palito em 20 ul de NaOH 0,02 M. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
      Nota: Use novas colônias. Se as placas são mais velhos do que uma semana re-raia para obter uma nova colônia.
    3. Use 1 ul da suspensão de células para a PCR imediatamente. Executar uma reacção de PCR convencional e analisar fragmentos resultantes.
      NOTA: As amostras não pode ser armazenado.
      NOTA: Este teste de PCR para a presença do gene de tipo selvagem e, assim, permite a rápida identificação de cand negativoidates em que o gene de interesse não tiver sido substituído. Os clones produzindo bandas nesta reacção de PCR serão descartadas. Um tal clone negativo deve mesmo assim ser levado junto como um controle negativo adicional. Os candidatos sem um produto de PCR tem de ser analisada com mais profundidade. Para genes sem efeitos prejudiciais aproximadamente metade dos candidatos deve conter o gene de tipo selvagem, enquanto a outra metade não devem resultar numa banda. Isto corresponde a uma taxa de recombinação homóloga de 50%.
  2. Segunda PCR de diagnóstico
    1. Preparação do ADN genómico.
      NOTA: O ADN genómico (ADNg) podem ser preparados utilizando dois protocolos diferentes. O primeiro envolve reagentes tóxicos como o fenol e clorofórmio e, portanto, deve ser tratada apenas por investigadores experientes (descritos no 4.2.1.1 4.2.1.5 a), enquanto o segundo pode também ser tratado por menos experientes estudantes (descritos no 4.2.1.6 para 4,2. 1.11). Ambos os protocolos estão trabalhando de forma confiável. Passo 4.2.1.1 é idêntica tanto para PROTOCols.
      1. Inocular 5 ml Yeps-Light com cada candidato e incubar numa roda rotativa, durante 24 horas a 28 ° C. Queda de 2 ul da cultura sobre uma placa de CM. Manter a cultura estéril.
        NOTA: A seguir é um protocolo padrão (ATENÇÃO: passos tóxicos).
      2. Coloque 1 colher (~ 200 mL) de esferas de vidro HCl-lavada para tubos de 2 ml. Adicionar 2 ml de U. cultura maydis. Girar 12000 xg durante 5 min. Elimine o sobrenadante (pelete pode ser congelado nesta fase). Adicionar 500 ul de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25: 24: 1) para o sedimento. CUIDADO! O fenol é tóxico!
      3. Adicionar 500 ul Usti-lise-buffer 1. Agitar durante 6 a 10 min em um Vibrax a 1.000 rpm. Verificar se o sedimento de células foi ressuspenso completamente, mas evitar estendida agitação para evitar a ruptura do ADNg. Girar a 12.000 xg por 15 min. Transferir 400 ul da fase aquosa para o novo tubo de reacção (não toque na interfase).
      4. Adicionar 1 ml de 100% (v / v) de etanol. Inverta as 3x tubo para misturar, observar o calta de DNA que logo aparece. Girar a 12.000 xg por 5 min. Remover o sobrenadante e lava-se com 200 ul de EtOH a 70%. Não ressuspender o sedimento em esta fase.
      5. Remover o sobrenadante completamente (não deixe que o pellet secar completamente). Adicionar 50 ul de TE / RNase. Dissolver ADNg por agitação a 400 rpm a 50 ° C durante 10 min. Analise 2 ul do ADNg num gel de agarose a 0,8% 20.
        NOTA: Os passos abaixo compreendem um protocolo não-tóxico alternativo.
    2. Preparação alternativa de DNA genômico
      1. Coloque 1 colher (~ 200 ul) de HCl lavada esferas de vidro para tubos de 2 ml. Adicionar 2 ml de U. cultura maydis e centrifugação a 12.000 xg por 5 min. Elimine o sobrenadante (peletes pode ser congelado nesta fase).
      2. Adicionar 500 ul de tampão de lise Usti 2 ao peletizado. Agita-se durante 5 a 15 min num Vibrax a 1.000 rpm. Verificar se o sedimento de células foi ressuspenso completamente.
      3. Incubar os tubos a 65 ° C durante 15 a 20 min. usando approincubadoras adequadas destinadas a acolher tubos de 2 ml é crítica. Em seguida, colocá-lo em gelo por 5 min.
      4. Adicionar 100 ul de 8 M de acetato de potássio, de vórtice ou inverter 8 a 10 vezes. Girar 12.000 xg durante 15 min à temperatura ambiente.
      5. Transferir 500 ul do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml e adicionar 400 uL de isopropanol. Vortex ou invertido de 8 a 10 vezes. Girar 12.000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante e lava-se com 500 ul de EtOH a 70%. Girar 12000 xg durante 5 min.
      6. Mergulhe off sobrenadante completamente! Eventualmente, adicione uma breve centrifugação (10 seg) para remover o líquido residual. Deixar o sedimento de DNA seco durante 3 a 5 min. Adicionar 50 ul de TE / ARNase e incubar a 50 ° C durante 10 a 15 min a 400 rpm.
    3. PCR
      1. Design dois pares de iniciadores com um deles ligação fora dos flancos e a correspondente uma ligação no interior da cassete de resistência (F-f, V-R; RC-F, DF-R, A Figura 1) 9.
      2. Use 1 ul de uma diluição do ADNg de cada c 1:10andidate como um modelo em reacções de PCR 2 verificar a inserção correcta a montante ea jusante 9.
      3. Use reações de PCR padrão para cada candidato e analisar fragmentos 22 resultante.
        NOTA: Estes PCRs para testar a inserção da cassete de resistência no locus genómico correcto. Se os produtos são obtidos para ambos os lados, o candidato é provável uma inserção correcta. No entanto, também os candidatos que poderiam ser confirmados apenas um lado (a montante ou a jusante) deve ser realizada ao longo de uma análise mais aprofundada no caso de reações de PCR simplesmente falhou por um flanco.
  3. Verificação de Inserção Genomic correta por Southern Blot Analysis 22
    1. Digest 15 ul de ADNg (4.2.1) dos candidatos mutantes e a estirpe de tipo selvagem correspondentes / progenitora com uma enzima apropriada que corta fora do locus / construir e, além disso, cortes, quer no gene ou na cassete de resistência à levando a claramente distinguishable padrões (Figura 1) 8.
      NOTA: Nenhuma das bandas esperadas deve ser maior que 10 kb, de modo que eles se distinguem claramente dos DNA não digerido.
    2. Use a montante ea jusante do flanco como sondas. Para identificá-los, por exemplo, utilizar o kit de rotulagem PCR DIG ou qualquer método padrão similar. Misturar as sondas marcadas em uma proporção de 1: 1 molecular e realizar a transferência de Southern. Mantenha pelo menos dois transformantes corretas independentes.
      NOTA: O padrão de tipo selvagem deve ser claramente detectável na estirpe original e os clones corretos devem conter apenas as bandas esperadas. bandas adicionais só presentes nos candidatos indicar outras inserções da construção em um local errado. Tais clones devem ser descartados. O candidato negativo identificado na primeira PCR de diagnóstico devem conter as bandas de tipo selvagem e as bandas (imprevisíveis em tamanho) da construção de eliminação erradamente integrado.
  4. Os estoques de glicerol
    NOTA: stocks glicerol servem para manter os clones por anos em coleções de tensão. Pelo menos dois transformantes independentes deve ser mantido para cada mutante. Isto permite que comparam fenótipos que devem ser idênticos.
    1. Cresça 5 ml de culturas de estirpes mutantes confirmados em Yeps-luz numa roda rotativa durante 24 horas a 28 ° C Misturar 500 mL de cada cultura com 500 ul NSY-glicerol-forma. Inverta tubo até que a cultura e médio são bem misturados. Do glicerol no meio impede a formação de cristais de gelo.
    2. Congelar a -80 ° C. Re-raia uma parte da cultura congelada para testar se o estoque é funcional.

5. fenótipos microscópicas

  1. Cresça 5 ml de culturas de tipo selvagem e estirpes mutantes em Yeps-luz numa roda rotativa durante 12 horas a 28 ° C.
  2. No dia seguinte, dilui-se a cultura a uma DO600 de cerca de 0,1 e crescer até uma OD 600 entre 0,5 e 0,7. Uma OD600 de 1,0 correspgundos para cerca de 1 a 2 x 10 7 U. maydis células por ml.
  3. Inspecione a morfologia das células ao microscópio.
    NOTA: Healthy células aparecem em forma de charuto (Figura 4, WT). vacúolos pronunciados ou a formação de filamentos indicam que as células estão estressados.
    NOTA: Dependendo do fenótipo mutante esperado, a análise pode ser adaptado, por exemplo, se as estirpes repórter são utilizados no ensaio apropriada pode ser levada a cabo nesta fase. Se a morfologia das células é mudado análise estatística deve ser conduzido, por exemplo, para determinar o comprimento médio de célula.

Ensaio 6. Infecção

NOTA: O ensaio de infecção de plântulas foi visualizado anteriormente nesta revista 11. Ela pode ser levada a cabo usando, um fundo estirpe haplóide solopathogenic tais como SG200 10 ou através da mistura de parceiros de acasalamento compatíveis que são ambos portadores da mutação.

  1. Crescer pelo menos 40 plântulas de milho porestirpe por 7 dias de um ciclo de luz de 16 horas, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (dia / noite). Eles devem estar na fase de 3 folhas e 10-15 cm de altura, no dia da infecção.
  2. Dois dias antes da infecção, iniciar uma pré-cultura das estirpes em 5 ml Yeps-Light numa roda rotativa durante 24 horas a 28 ° C. Crescer uma cultura principal, em 50 ml Yeps-Light até DO600 = 1,0 (divisão celular rate = 2 horas, permitir que 3 divisões mínimo, pode ser feito O / N).
  3. Girar as células de cultura de 50 ml a 1500 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Lavar 3x com H 2 O. estéril Ressuspender as células em H 2 O esterilizada para uma DO 600 de 3,0. Se necessário, misturar os parceiros de acasalamento.
  4. Injectar 250 - 500 ul das suspensões de células para a haste de 7 dias de idade plântulas de milho que utilizam uma pequena seringa. Use H 2 O estéril como controle. Manter mudas infectadas durante um período adicional de 7-14 dias nas mesmas condições de luz e temperatura. Marcar o fenótipo de cada planta umaegundo saudável, clorose, formação de antocianina, pequenos tumores, tumores grandes, plantas mortas 10.
    NOTA: A pontuação pode ser feita tão cedo como 7 dias e repetida aos 14 dias a seguir a infecção ao longo do tempo.

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Resultados

As construções de deleção para todos os quatro genes codificados no quitinolíticas U. maydis genoma foram gerados pela Golden Gate clonagem de utilizar a cassete hygR para eliminação de cts1, o NATR para eliminação de CTS2, a cassete G418R pela exclusão de cts3 eo cbxR para eliminação de cts4 20. Um visão geral da estratégia de substituição genética é exemplificada pela eliminação de cts3...

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Discussão

Este protocolo descreve como gerar mutantes de deleção para estudos de genética inversa em U. maydis. O ponto de partida é uma construção de deleção que contém sequências que flanqueiam o gene de interesse que contém sequências de cerca de 1 kb a montante do início e a jusante do codão stop, assim como uma cassete de resistência adequada, tal como foi previamente optimizado 7,9 . As construções têm que ser gerados individualmente para cada gene e cuidadosamente verificada por erros de sequência antes...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Um agradecimento especial ao Dr. Benedikt Steuten para a leitura crítica do manuscrito. O trabalho original sobre as quitinases foi realizada pelo Dr. Thorsten Langner. O laboratório de VG é suportado pelo Cluster de Excelência em Ciências Vegetais (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, o laboratório de KS é suportado por BioSC. KB é suportado por BioSC. As atividades científicas do Science Center Bioeconomy (BioSC) foram apoiadas financeiramente pelo Ministério da Inovação, Ciência e Investigação no âmbito do NRW Strategieprojekt BioSC (No. 313 / 323-400-00213). LF é apoiado por uma bolsa de doutoramento da DFG International Research Training Group 1525 iGRADplant.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido aminobenzoico (Ácido Livre)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternativamente use o fornecedor local
Bacto peptonaBD211677alternativamente use o fornecedor local
Extrato de levedura Bacto BD212750alternativamente use o fornecedor local
CaCl2*2H2OGrü ssing GmbH10234alternativamente use o fornecedor local
Ca-Pantothenat (sal Hemi-Ca.)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Ácidos Casamino BD223050
ColinchloridSigma AldrichC-1879
Ácido cítricoChemSolute24.321.000alternativamente use o fornecedor local
CuSO4*5H2OFluka61240alternativamente use o fornecedor local
D(+)Sucrose Roth4621.1alternativamente use
o fornecedor local DNA degr. ácido livreSigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrü ssing GmbH10288alternativamente use o fornecedor local
Geneticin (G418) sal de dissulfatoSigma AldrichA1720
Trichoderma enzimas de liseSigma AldrichL1412
D (+) GlicoseCaelo2580alternativamente use o fornecedor local
Glicerina Fisher ChemicalG065015alternativamente usar o fornecedor local
H3BO3AppliChemA2940Substância perigosa. Verifique as instruções de segurança do fabricante.
Sal de heparina sódicaSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Substância perigosa. 
A KClVWR26764298alternativamente usar o fornecedor local
KH2PO4AppliChemA3620alternativamente usar o fornecedor local
MgSO4 sem águaMerck7487-88-9água é fundamental. Alternativamente, use o fornecedor local
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternativamente, use o fornecedor local
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternativamente use o fornecedor local
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternativamente use o fornecedor local
Na2SO4Grü ssing GmbH12174alternativamente use o fornecedor local
NaClFisher ChemicalS316060alternativamente use o fornecedor local
NaOHChemSolute13.751.000alternativamente use o fornecedor local
NH4NO3RothK299.1alternativamente use o fornecedor local
Ácido nicotínico (ácido livre)Sigma AldrichN-4126
Nourseotricina dihidrogenosulfato  Werner BioAgents5,001,000
Caldo de nutrientes Fornecedores locaisda Difco
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1) pH 6,7Sigma AldrichP3803Substância perigosa. Verifique as instruções de segurança do fabricante.
polietilenoglicol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Acetato de potássioAppliChem121479alternativamente usar o fornecedor local
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavina Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternativamente use
seringa pequenaBD300300do fornecedor local alternativamente use
o filtro estéril do fornecedor local, 22 µ mVWR28145-477em alternativa, utilizar o fornecedor local
SorbitolRoth6213.1em alternativa, utilizar o fornecedor local
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02em alternativa, utilizar o fornecedor local
tri-Na-Citrate,Fisher ChemicalS332060em alternativa, utilizar o fornecedor local
Tris- (hidroximetil)aminometanoVWR103156Xalternativamente use o fornecedor local
Cloridrato de TrisRoth9090.4alternativamente use o fornecedor local
Triton X-100 Serva 37240alternativamente use o fornecedor local
ZnCl2Fluka96470alternativamente use o fornecedor local
Composição das soluções/preparação do materialComposição das soluções
CarboxinEstoque: 5 mg/ml em metanol, concentração final: 2 µ g/ml
de placas0,25 % (p/v) Ácidos de Casamino, 0,1 % (p/v) Extrato de levedura, 1,0 % (v/v) Solução vitamínica de Holliday, 6,25 % (v/v); Solução de sal de Holliday, 0,05 % (p/v) de DNA degr. ácido livre, 0,15 % (m/v) NH4NO3, 2,0 % (m/v) Bacto Agar; ajustar para pH 7,0 usando 5 M NaOH; após a autoclavagem, adicione 1% de glicose 
Geneticina (G418)Estoque: 50 mg/ml em H2O, concentração final: 500 µ g/ml
de esferas de vidro lavadas com HCl (0,35-0,45 mm)Cubra as esferas de vidro com HCl concentrado (25%, 7,8 M) e incube por 60 min. Balance várias vezes. Decantar HCl (manter o líquido decantado) e lavar as esferas de vidro com HCl 3 M (manter o líquido decantado). Lave as contas de vidro várias vezes com H2O destilado duas vezes até que o pH seja 7 (o líquido não deve mais ser verde-amarelado). Aliquotar as contas de vidro e secá-las a 180 ° C. O HCl decantado deve ser neutralizado antes do descarte.
de heparina: 15 mg / ml
de sal Holliday16,0 e permil; (w / v) KH2PO4, 4,0 & (w / v) Na2SO4, 8,0 ‰ (w / v) KCl, 1,32 ‰ (w / v) CaCl2*2H2O, 8,0 ‰ (v/v) oligoelementos, 2,0 ‰ (w / v) MgSO4; solução vitamínica Holliday filtrada estéril
 0,1‰ (w / v) Tiamina, 0,05‰ (w / v) Riboflavina, 0,05‰ (w / v) Piridoxina, 0,2‰ (w / v) Ca-Pantothenat, (0,05‰ (w / v) Ácido aminobenzoético, 0,2‰ (w / v) Ácido nicotínico, 0,2‰ (w / v) Colinclorida, 1,0‰ (p/v) mio-inositol; pode ser armazenado a -20 & C
Estoque de: 50 mg / ml em PBS, concentração final: 200 µ g/ml
NourseotricinaEstoque: 200 mg/ml em H2O, concentração final: 150 µ g/ml
NSY-glicerol-meio0,8% (p/v) Caldo Nutritivo, 0,1% (p/v) Extrato de Levedura, 0,5% (p/v) Sacarose,  80,0% (v/v) 87% Glicerina (f.c. 69,6%) 
RegLight1,0% (p/v) Extrato de Levedura  0,4% (p/v) Bacto Peptona, 0,4% (p/v) Sacarose, 18,22% (p/v) Sorbitol, 1,5% (p/v) Ágar
SCS, pH 5,8Solução 1: 20 mM tri-Na-citrato, 1 M Sorbitol; colução 2: 20 mM Ácido cítrico, 1 M Sorbitol, adicione a solução 2 na solução 1 até que o pH 5,8 seja atingido; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2; filtro estéril
STC/PEG40 % (v/v) PEG em tampão STC 
Tampão TE, pH 81,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µ g/ml de RNaseA em tampão TE
Oligoelementos0,06‰ (w / v) H3BO3, 0,14‰ (w / v) MnCl*4H2O, 0,4 ‰ (w / v) ZnCl2, 0,4 ‰ (w / v) Na2MoO4*H2O:2, 0,1 ‰ (w / v) FeCl3*6H2O, 0,04‰ (w / v) CuSO4*5H2O
Trichoderma solução12,5 mg/ml SCS; filtro estéril; preparar pouco antes
de usar Tris-HCl pH 7,5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; verificar o pH e, se necessário, ajustar com HCl; autoclave
Tampão de lise de Usti 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM NaCl, 1% (p/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Não meça o pH usando o medidor de pH. 
Tampão de lise Usti 2mistura Tampão de lise Usti 1 com 1x TE na proporção de 1:1
YEPS-Light medium1,0% (p/v) Extrato de levedura, 0,4% (p/v) Bacto Peptona, 0,4% (p/v) Sacarose, para placas: 1,5% (p/v) Ágar Bacto
A Sem , a , , , CM Estoque solução higromicina de enzimas de lise

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