Artigo de método

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos, Ceratitis capitata

DOI:

10.3791/54528

⸱

1 de outubro de 2016

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Neste artigo

Resumo

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A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Resumo

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A mosca mediterrânica da fruta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) é uma espécie de pragas com altíssima relevância agrícola. Isto é devido ao seu comportamento reprodutivo: as fêmeas danificar a superfície externa de frutas e vegetais quando eles põem ovos e as larvas se alimentam chocado em sua polpa. Selvagem C. populações capitata são tradicionalmente controlada através de inseticidas e / ou abordagens eco-friendly, sendo o mais bem sucedido da Técnica do Inseto Estéril (SIT). O SIT baseia-se em massa criação, esterilização à base de radiação e liberação de campo dos homens que mantêm sua capacidade para acasalar, mas não são capazes de gerar descendência fértil. O advento ea subsequente rápido desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, juntamente com a disponibilidade da sequência do genoma de mosca do mediterrâneo, impulsionou significativamente a nossa compreensão da biologia desta espécie. Isto favoreceu a proliferação de novas estratégias para a manipulação do genoma, que can ser utilizada para o controle da população.

Neste contexto, embrião microinjeção desempenha um duplo papel na expansão da caixa de ferramentas para o controle da mosca do mediterrâneo. A capacidade para interferir com a função dos genes que regulam processos biológicos fundamentais, de facto, se expande a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a invasividade moscas mediterrânicas. Além disso, a capacidade de conseguir a transformação da linha germinal facilita a produção de múltiplas estirpes transgénicas que podem ser testados para futuras aplicações de campo em novas configurações de SIT. Com efeito, a manipulação genética podem ser usadas para conferir características desejáveis ​​que podem, por exemplo, ser utilizados para monitorizar o desempenho masculino estéril no campo, ou que podem resultar em letalidade fase precoce da vida. Aqui nós descrevemos um método para microinject ácidos nucleicos em embriões de mosca do mediterrâneo para atingir estes dois objetivos principais.

Introdução

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A mosca da fruta Mediterrânea (medfly) Ceratitis capitata é uma espécie cosmopolita que extensivamente danos frutas e culturas cultivadas. Pertence à família Tephritidae, que inclui várias espécies de pragas, tais como aqueles que pertencem aos géneros Bactrocera e Anastrepha. A mosca do mediterrâneo é a espécie mais estudados desta família, e tornou-se um modelo não só para o estudo das invasões de insetos 1, mas também para otimizar as estratégias de gestão de pragas 2.

A mosca do mediterrâneo é uma espécie multivoltina que podem atacar mais de 300 espécies de plantas selvagens e cultivadas 3,4. O dano é causado por ambos os adultos e as fases larvares: fêmeas acasaladas perfurar a superfície do fruto para oviposição, permitindo que microorganismos de afectar a sua qualidade comercial, enquanto que as larvas se alimentam sobre a polpa de fruta. Depois de três estádios larvares, larvas emergem a partir do hospedeiro e pupate no solo. Ceratitiscapitata exibe uma distribuição quase todo o mundo, incluindo a África, Médio Oriente, Austrália Ocidental, Central e América do Sul, Europa e áreas dos Estados Unidos 5.

As estratégias mais comuns para limitar infestações mosca do mediterrâneo envolvem o uso de inseticidas (por exemplo, Malathion, Spinosade) e a favor do meio ambiente técnica do inseto estéril (SIT) 6. A última abordagem envolve a libertação no meio natural de centenas de milhares de homens prestados esterilizado por exposição a irradiação ionizante. O acasalamento de tais machos esterilizados para fêmeas selvagens resulta em nenhuma descendência, causando uma redução no tamanho da população, o que levou à erradicação. Embora SIT tem se mostrado eficaz em várias campanhas em todo o mundo, suas principais desvantagens incluem os altos custos de criação e de esterilização de milhões de insetos para ser liberado. Marcação de indivíduos liberados é necessário distinguir estéril de insetos selvagens capturados no campo durantemonitoramento das atividades e atualmente é conseguido usando pós fluorescentes. Estes procedimentos são caros e têm efeitos colaterais indesejáveis 7.

A fim de otimizar e / ou a desenvolver abordagens mais eficazes para o controle desta praga, biologia medfly e genética têm sido amplamente explorada por inúmeros pesquisadores em todo o mundo. A disponibilidade da sequência do genoma medfly 8,9, irá facilitar novas investigações sobre as funções dos genes. RNA de interferência é uma ferramenta poderosa para tais estudos e isto pode ser conseguido através da microinjecção de ARNdc (ARN de cadeia dupla) ou siARN (pequeno ARN interferente). Esta técnica tem sido usada, por exemplo, para demonstrar que a cascata molecular determinação do sexo em C. capitata é apenas parcialmente conservada em relação ao de 10 de Drosophila.

O desenvolvimento de protocolos para microinject embriões mosca do mediterrâneo permitidos C. capitata para ser o primeiro nãoespécies de moscas -Drosophilid ser geneticamente modificados. Como os ovos são semelhantes aos de Drosophila, quer em termos de morfologia e resistência à dessecação 11, o protocolo para a entrega do DNA do plasmídeo em embriões pré-blastoderme primeiro desenvolvidos para D. melanogaster 12,13 foi inicialmente adaptada para uso em C. capitata. Estas primeiras experiências permitiu transformação de linha de germe de moscas mediterrânicas com base no elemento transponível Minos 11. Subsequentemente, o sistema original foi modificado utilizando 14 outras abordagens baseada em transposões. Este é o caso de piggyBac da Lepidoptera Trichoplusia ni 15. O protocolo já foi ainda mais otimizado e isto permitiu a transformação de outras espécies de tefritídeos 16-21 e também de muitos outros Diptera 22-31. Todos estes sistemas se baseiam na utilização de um / sistema de transformação plasmídeo ajudante vector binário típico: artificial, transpo defeituosofilhos contêm genes desejados são montados em ADN de plasmídeo e integrado no genoma do insecto, fornecendo a enzima transposase 32. Um número de linhas de mosca do mediterrâneo transgênicos foram gerados, com vários recursos, incluindo estirpes que transportam um gene letal dominante condicional que induz letalidade, estirpes produtoras do sexo masculino somente descendentes e, portanto, não exigindo estratégias de sexagem adicionais e estirpes com esperma fluorescente, o que pode aumentar a precisão da fase de monitoramento SIT 33-37. Embora a libertação na natureza de organismos transgênicos ocorreu em testes-piloto contra os mosquitos única 38,39, pelo menos uma empresa está avaliando uma série de linhagens transgênicas mosca do mediterrâneo para a sua utilização no campo 40.

Embrião microinjeção também pode favorecer o desenvolvimento de novas ferramentas de edição de genoma, tais como transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS), agrupados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CRISPR proteína associada 9 nuclease (Cas9) e endonucleases homing genes (HEGs), o que permitirá novos estudos evolutivos e de desenvolvimento, bem como a expansão da caixa de ferramentas da biotecnologia disponível. De edição de genoma abordagens já permitiu a geração de sistemas gene-drive em mosquitos 41, e sua transferência para o medfly é iminente. Aqui nós descrevemos um protocolo universal para microinjecting ácidos nucleicos em embriões mosca do mediterrâneo que podem ser úteis para todas as aplicações acima mencionadas.

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Protocolo

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1. Experimental Set-up

  1. requisitos insetário
    1. Manter todos C. vida capitata encena a 25 ° C, 65% de humidade e 12/12 horas de luz / fotoperíodo escuro.
    2. Coloque cerca de 1.500-2.000 pupas de mosca do mediterrâneo em um 6 L gaiola. Use uma gaiola com um latão malha em um lado com furos pequenos o suficiente para estimular a oviposição 42. Insira uma tira de esponja através de uma pequena abertura na base da gaiola para fornecer moscas com água por meio de ação capilar. Usar uma mistura de açúcar de levedura e (1:10) como fonte de alimento para os adultos (Figura 1A). Aumentar a quantidade de levedura (até 1: 3, fermento: açúcar) devem as fêmeas não conseguem pôr ovos.
    3. Colocar uma placa cheia de água abaixo da gaiola para recolher os ovos depositados através da malha. Como as fêmeas virgens podem ovipositam, aguarde até que as moscas são pelo menos 6-7 dias antes de coletar os ovos para os experimentos de microinjeção. Isto irá garantir que as fêmeas foram acasaladose que os ovos foram fertilizados.
    4. Recolher os ovos filtrando a água com um filtro net bem. Transferir os ovos a partir do filtro de uma caixa de plástico contendo alimento larval padrão (1,5 LH 2 O, 100 mL de HCl a 1%, 5 g de largo espectro antimicrobiano dissolvido em 50 ml de etanol, 400 g de açúcar, 175 g de levedura de cerveja desmineralizada, 1 kg de farelo de trigo mole) usando uma pipeta de Pasteur.
    5. Colocar cada caixa num contentor transparente, fechado com uma tampa de líquido para permitir a circulação do ar e contendo uma camada de farelo de favorecer a formação da pupa (Figura 1B).
    6. Após cerca de 10 dias, para verificar 3º instar larvas que emergem do alimento larval e saltar para dentro da camada de farelo de pupation.
    7. 24 horas depois, recolher as pupas em um pequeno copo usando uma escova macia e transferi-los para uma nova gaiola adulto. Adultos normalmente emergem 10 dias após pupation. A mosca emergente utiliza o ptilinum, uma bolsa inflável localizado em sua cabeça acima the base das antenas, para forçar para fora da extremidade do pupário. Após a emergência, o ptilinum cai permanentemente para dentro da cabeça.
  2. Preparação de 1 L alimento para larvas microinjectados
    1. Dissolve-se 2,5 g de ágar em 300 ml de H 2 O.
    2. Aquecer 500 ml de H 2 O em uma placa de agitação quente e dissolvem-se 4 g de benzoato de sódio, 4,5 ml de HCl a 37%, 42 g de extracto de levedura e 115 g de cenoura desidratada em pó.
    3. Adicionar à mistura uma solução de 2,86 g de agente antimicrobiano de largo espectro dissolvido em 10 ml de etanol absoluto.
    4. Distribuir o meio em 15 cm rodada placas de Petri e deixe esfriar. Se necessário, armazenar a 4 ° C.
  3. preparação da lâmina
    1. Coloque um 2 centímetros tira de fita dupla face em uma lâmina de microscópio (75 x 26 mm2) e marcar as bordas com um marcador de porcelana, para impedir a propagação do petróleo e consequente desidratação dos embriões injetados.
  4. Preparação de Ácido Nucleico
    1. Isolamento de DNA usando kits disponíveis comercialmente 34. Precipitar o plasmídeo usando etanol e re-suspensão em tampão de injecção (0,1 mM de tampão fosfato de pH 7,4, 5 mM de KCl) na concentração desejada.
    2. Purificar in vitro sintetizado longo dsRNA utilizando fenol-clorofórmio, precipitar utilizando isopropanol e re-suspensão em tampão de injecção 43.

2. Embrião Preparação

  1. Coloque uma bandeja cheia de água sob uma gaiola contendo 6-7 dia adultos de idade.
  2. Permitir que as fêmeas para oviposição por 30 min e depois recolher os embriões filtrando a água através de um filtro fino. Sempre mantenha o filtro em água para evitar a dessecação dos embriões.
  3. Dechorionate os embriões por imergindo o filtro durante 5 segundos numa solução de lixívia comercial a 50%.
  4. Lavar os embriões cuidadosamente por imergindo repetidamente o filtro em água ultrapura limpa (pelo menos4-5 vezes). Por último, coloque o filtro em água ultrapura limpo. Use os embriões dentro de no máximo 2 horas.
    NOTA: O tempo de microinjeção está relacionada com a necessidade de injetar embriões pré-blastoderme, durante uma fase de divisões nucleares antes celularização. Isto permite que o ADN injectado a tomar-se nos núcleos, especificamente para os núcleos de células germinativas primordiais que originaram os gâmetas. Em Drosophila, as células celularização no pólo começa a cerca de 90 minutos após a fertilização (a 25 ° C), com a formação de blastoderme ocorrendo cerca de 30 minutos mais tarde, 44, ao passo que no celularização medfly ocorre entre 9 e 12 horas 45,46.
  5. Orientação embrião em linhas
    1. Usando um pincel fino, recolher cerca de 50 embriões e colocá-los em um disco de papel de filtro preto encharcado com água.
    2. Sob um microscópio estereoscópico de dissecação, organizar os embriões em uma fileira na superfície superior da fita dupla face ema lâmina de microscópio utilizando um pincel fino (000) (Figura 1C).
      NOTA: Alinhar os embriões todos com a mesma orientação, como a injecção é executada no polo posterior, onde de linha germinal originam; pólo posterior é oposta à região da micrópila.
    3. Cobrir os embriões com uma camada de óleo clorotrifluoroetileno certificando-se de que o óleo não se derrame sobre a China fronteiras marcador (ver 1.3).
      NOTA: Antes de cobrir os embriões com óleo, um passo adicional pode ser realizada: os embriões podem ser dessecada durante alguns minutos para reduzir o seu teor de líquido e, assim, facilitar a entrada da solução de ADN injectado. Isto pode ajudar a evitar a rotura do embrião durante a injecção ou vazamento excessivo da solução injetadas, como uma consequência da pressão líquida de alta resolução.

Microinjeção 3. Embryo

  1. Encha uma agulha (1-2 ul) com ADN de plasmídeo ou solução ARNcd (1-2 mg / mL) utilizando uma micropipeta.
  2. conectar a agulha ao aparato de microinjecção, que controla o tempo de injecção (0,5 seg), a pressão (800 hPa) e a contrapressão (150 hPa).
  3. Realizar microinjecção sob um microscópio estereoscópico, utilizando um micromanipulador para controlar os movimentos da agulha (Figura 1D). Utilizar a platina do microscópio para mover a corrediça.
    1. Coloque o slide no palco do escopo.
    2. Inserir a ponta da agulha no pólo posterior do embrião (Figura 1E).
    3. Injectar a solução ativando o sistema de microinjeção com o pedal. O líquido injectado induz um aumento da pressão interna, resultando em um ligeiro movimento do embrião.
    4. Solte o pedal e imediatamente, mas com cuidado, retire a agulha do embrião.
    5. Observar um pouco de fuga citoplasmática no local da injecção.
      NOTA: Para discriminar entre potenciais efeitos letais de DNA / dsRNA / siRNA e mortalidade devido à pro microinjeçãoprocedimento em si, experiências de controlo devem ser executadas. Estes compreendem a injecção de apenas tampão, ou, no caso das experiências de genética inversa, de uma proteína fluorescente verde (GFP) -derived ARN de cadeia dupla (ARNcd-GFP), ou ARNsi.
  4. Após a injecção incubar os embriões a 25 ° C.

4. Procedimentos de Pós-injeção

  1. Dois dias após a injecção, verifique as lâminas para larvas eclodidas (Figura 1F) sob um microscópio estereoscópico. As larvas podem mover-se no óleo, mas precisa de ser transferido para alimentar larvas o mais rapidamente possível. Por esta razão, verifique as lâminas várias vezes ao dia.
  2. Usando um pincel fino (000), gentilmente transferir as larvas eclodiram ao alimento larval à base de cenoura. Transfira até um máximo de 200 larvas por cada placa de Petri.
  3. Incubar as larvas a 65% de humidade (25 ° C). Certifique-se de que a tampa não se ater ao prato, prejudicando a troca de ar.
  4. Mantenha as placas de Petri com a tampaprincipalmente fechado de modo que ainda existe fluxo de ar para as larvas. Para evitar a secagem excessiva, verifique os pratos diariamente e, se necessário, adicione água para compensar a evaporação.
  5. Coloque as placas de Petri em um recipiente clara fechada por uma tampa-net e contendo uma camada de farelo de favorecer pupation. Quanto à criação insetário rotina, 3º instar larvas salto para fora do alimento larval e pupate no farelo.
  6. Recolher o pupas e colocá-los em uma gaiola pequena para a criação de adultos e triagem (isto é Geração 0, G0). Traseira da progênie em alimento larval padrão.
  7. No caso de experimentos de transformação em células germinais, verificar possíveis indivíduos transformados na próxima geração (G1), como indivíduos injetados geralmente são quimeras. eventos de transposição, de facto, pode ter ocorrido em qualquer um dos núcleos do sincício embrionário, os quais irão formar, quer a da linha germinal ou a soma.
    1. Logo após a emergência, anestesiar indivíduos G1 usando CO 2 e verifique se transfeventos ormação sob um microscópio estereoscópico epifluorescência. Para rastrear a presença de fluorescência vermelha, use um filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), enquanto para a tela de fluorescência verde usar o filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Coloque indivíduos transformadas em uma pequena gaiola com adultos de tipo selvagem do sexo oposto e originam uma nova, inicialmente heterozigotos, tensão.

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Resultados

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Aqui relatamos duas aplicações de microinjecção de embriões dirigido para a caracterização funcional de um gene de interesse (caso 1), e na geração de estirpes transgénicas (Processo 2), respectivamente.

Entrega de dsRNA em embriões para desvendar a função do gene.

O gene innexin-5 codifica uma lacuna-junção que, em insectos, é expresso especificamente na g...

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Discussão

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Microinjecção de ácidos nucleicos em embriões de insetos é uma técnica universal que facilita tanto a análise da função dos genes e das aplicações biotecnológicas.

A publicação recente de sequências do genoma de um número crescente de espécies de insectos leva a uma necessidade urgente de ferramentas para a caracterização funcional de genes de função ainda desconhecida. ARN de interferência tem provado ser um dos métodos mais valiosos para inferir funções moleculares 49 e facilita...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do Laboratório "Insect Genetics and Genomics", em particular a Lorenzo Ghiringhelli, que trabalhou no desenvolvimento, adaptação e manutenção da criação da mosca nos últimos trinta anos. Parte dos resultados representativos deste artigo foram reimpressos de N. Biotechnology, 25(1) por Scolari F. et al., Marcação de esperma fluorescente para melhorar a luta contra o inseto-praga Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, com permissão da Elsevier (número de licença 3796240759880). Este trabalho recebeu apoio da Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 x tampão0,1 mM tampão fosfato pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNAFenol-Clorofórmio purificado
larval padrão1,5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g de agente antimicrobiano de amplo espectro usado em produtos farmacêuticos dissolvidos em 50  ml de etanol, 400 g de açúcar, 175 g de levedura de cerveja desmineralizada, 1 kg de farelo de trigo mole
para larvas de cenoura2,5 g de ágar, 4 g de benzoato de sódio, 4,5 ml de HCl a 37%, 42 g de extrato de levedura, 115 g de cenoura em pó, 2,86  g de agente antimicrobiano de amplo espectro, água para 1 L
de extrato de(1:10)
Lâminasde microscópio Sigma-AldrichZ692247
Agulhas de injeção Eppendorf5242956000
MicroloadersEppendorf5242956003
Fita
Whatman Papel circular pretoSigma-AldrichZ695505
BleachDiluite 1:2 antes do uso
Pincel (000)
MicromanipuladorNarishigeMN-153
MicroinjetorEppendorfFemtojet
Gaiolas
Óleo de clorotrifluoroetilenoSigma-AldrichH8898
Ceratitis capitataA cepa usada é ISPRA
de injeção Alimento Alimento levedura e açúcar para alimentos adultos deslizante duplapara adultos

Referências

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