Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Resumo

A mosca-das-frutas do Mediterrâneo Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) é uma praga mundial da agricultura. Uma compreensão mais profunda de sua biologia é fundamental para controlar as populações de moscas e, assim, reduzir o impacto econômico. A microinjeção de embriões é uma ferramenta fundamental que permite tanto a transformação da linha germinativa quanto os estudos genéticos reversos nesta espécie.

Resumo

A mosca mediterrânica da fruta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) é uma espécie de pragas com altíssima relevância agrícola. Isto é devido ao seu comportamento reprodutivo: as fêmeas danificar a superfície externa de frutas e vegetais quando eles põem ovos e as larvas se alimentam chocado em sua polpa. Selvagem C. populações capitata são tradicionalmente controlada através de inseticidas e / ou abordagens eco-friendly, sendo o mais bem sucedido da Técnica do Inseto Estéril (SIT). O SIT baseia-se em massa criação, esterilização à base de radiação e liberação de campo dos homens que mantêm sua capacidade para acasalar, mas não são capazes de gerar descendência fértil. O advento ea subsequente rápido desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, juntamente com a disponibilidade da sequência do genoma de mosca do mediterrâneo, impulsionou significativamente a nossa compreensão da biologia desta espécie. Isto favoreceu a proliferação de novas estratégias para a manipulação do genoma, que can ser utilizada para o controle da população.

Neste contexto, embrião microinjeção desempenha um duplo papel na expansão da caixa de ferramentas para o controle da mosca do mediterrâneo. A capacidade para interferir com a função dos genes que regulam processos biológicos fundamentais, de facto, se expande a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a invasividade moscas mediterrânicas. Além disso, a capacidade de conseguir a transformação da linha germinal facilita a produção de múltiplas estirpes transgénicas que podem ser testados para futuras aplicações de campo em novas configurações de SIT. Com efeito, a manipulação genética podem ser usadas para conferir características desejáveis ​​que podem, por exemplo, ser utilizados para monitorizar o desempenho masculino estéril no campo, ou que podem resultar em letalidade fase precoce da vida. Aqui nós descrevemos um método para microinject ácidos nucleicos em embriões de mosca do mediterrâneo para atingir estes dois objetivos principais.

Introdução

A mosca da fruta Mediterrânea (medfly) Ceratitis capitata é uma espécie cosmopolita que extensivamente danos frutas e culturas cultivadas. Pertence à família Tephritidae, que inclui várias espécies de pragas, tais como aqueles que pertencem aos géneros Bactrocera e Anastrepha. A mosca do mediterrâneo é a espécie mais estudados desta família, e tornou-se um modelo não só para o estudo das invasões de insetos ^1, mas também para otimizar as estratégias de gestão de pragas ^2.

A mosca do mediterrâneo é uma espécie multivoltina que podem atacar mais de 300 espécies de plantas selvagens e cultivad....

Protocolo

1. Experimental Set-up

1. requisitos insetário
   1. Manter todos C. vida capitata encena a 25 ° C, 65% de humidade e 12/12 horas de luz / fotoperíodo escuro.
   2. Coloque cerca de 1.500-2.000 pupas de mosca do mediterrâneo em um 6 L gaiola. Use uma gaiola com um latão malha em um lado com furos pequenos o suficiente para estimular a oviposição ^42. Insira uma tira de esponja através de uma pequena abertura na base da gaiola para fornecer moscas com água por meio de ação capilar. Usar uma mistura de açúcar de levedura e (1:10) como fonte de alimento para os adultos (Figura 1A). Aumentar a q....

Resultados

Aqui relatamos duas aplicações de microinjecção de embriões dirigido para a caracterização funcional de um gene de interesse (caso 1), e na geração de estirpes transgénicas (Processo 2), respectivamente.

Entrega de dsRNA em embriões para desvendar a função do gene.

O gene innexin-5 codifica uma lacuna-junção que, em insectos, é expresso especificamente na g.......

Discussão

Microinjecção de ácidos nucleicos em embriões de insetos é uma técnica universal que facilita tanto a análise da função dos genes e das aplicações biotecnológicas.

A publicação recente de sequências do genoma de um número crescente de espécies de insectos leva a uma necessidade urgente de ferramentas para a caracterização funcional de genes de função ainda desconhecida. ARN de interferência tem provado ser um dos métodos mais valiosos para inferir funções moleculares ⁴⁹ e facilita.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 x tampão			0,1 mM tampão fosfato pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA			Fenol-Clorofórmio purificado
		larval padrão	1,5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g de agente antimicrobiano de amplo espectro usado em produtos farmacêuticos dissolvidos em 50  ml de etanol, 400 g de açúcar, 175 g de levedura de cerveja desmineralizada, 1 kg de farelo de trigo mole
		para larvas de cenoura	2,5 g de ágar, 4 g de benzoato de sódio, 4,5 ml de HCl a 37%, 42 g de extrato de levedura, 115 g de cenoura em pó, 2,86  g de agente antimicrobiano de amplo espectro, água para 1 L
de extrato de			(1:10)
Lâminas	de microscópio Sigma-Aldrich	Z692247
Agulhas de injeção	Eppendorf	5242956000
Microloaders	Eppendorf	5242956003
Fita
Whatman Papel circular preto	Sigma-Aldrich	Z695505
Bleach			Diluite 1:2 antes do uso
Pincel (000)
Micromanipulador	Narishige	MN-153
Microinjetor	Eppendorf		Femtojet
Gaiolas
Óleo de clorotrifluoroetileno	Sigma-Aldrich	H8898
Ceratitis capitata			A cepa usada é ISPRA

de injeção Alimento Alimento levedura e açúcar para alimentos adultos deslizante duplapara adultos