Nós descrevemos um de alto rendimento, multiplex, e ensaio de líquido cefalorraquidiano proteômica alvo (CSF) desenvolvido com potencial para a tradução clínica. O teste pode quantificar potenciais marcadores e os factores de risco para a neurodegeneração, tais como as variantes de apolipoproteína E (E2, E3 e E4), e medir a sua expressão alélica.
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Artigo de método
A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas doenças neurodegenerativas ainda faltam tratamentos efetivos. biomarcadores confiáveis para a identificação e classificação destas doenças será importante para o desenvolvimento de futuras terapias inovadoras. Muitas vezes, os potenciais novos biomarcadores não torná-lo para a clínica devido a limitações no seu desenvolvimento e custos elevados. No entanto, proteômica alvo utilizando a reação múltipla Monitoramento Cromatografia Líquida-tandem / Espectrometria de Massa (MRM LC-MS / MS), especificamente usando triplos espectrômetros de massa quadrupolo, é um método que pode ser utilizado para avaliar rapidamente e validar biomarcadores para a tradução clínica em laboratórios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma tem sido amplamente utilizado para a medição de pequenas moléculas em laboratórios clínicos, mas que é o potencial para analisar proteínas, que faz com que seja uma alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked Immunosordobrado Assay) baseados em métodos. Descrevemos aqui como proteómica direccionada pode ser usada para medir os marcadores multiplexados de demência, incluindo a detecção e quantificação do factor de risco conhecido apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).
A fim de tornar o ensaio adequado para a tradução, que se destina a ser rápido, simples, altamente específica e de custo eficaz. Para conseguir isso, cada etapa no desenvolvimento do ensaio tem de ser optimizado para as proteínas individuais e os tecidos são analisados. Este método descreve um fluxo de trabalho típico incluindo várias dicas e truques para o desenvolvimento de um proteómica alvo MRM LC-MS / MS para a tradução .
O desenvolvimento do método é otimizado usando versões costume sintetizados de peptídeos quantotypic trípticos, que calibrar o MS para detecção e, em seguida, cravado no CSF para determinar a identificação correta do peptídeo endógeno na separação cromatográfica antes da análise no MS. Para atingir absolute de quantificação, padrão interno de versões marcadas com isótopos estáveis de péptidos com marcadores de sequências curtas de aminoácidos e de ácido contendo um local de clivagem de tripsina, são incluídas no ensaio.
Introdução
O impacto cada vez maior de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, demência de Lewy e Doença de Parkinson, está se tornando um problema sócio-económico em muitos países 1. Há uma necessidade em biomarcadores adicionais que podem ser utilizados para identificar e classificar os pacientes nas fases iniciais da doença, e para monitorizar quaisquer potenciais novos tratamentos. O objetivo geral deste método é criar um pipeline genérico para uma forma simplificada, econômico e rápido de validação de marcadores CSF potenciais de neurodegeneração. O objecto consiste em utilizar a proteómica orientadas ou péptido MRM LC-MS / MS como um método faci....
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Protocolo
NOTA:. Um esquema do protocolo geral descrito aqui é dada na figura 1 Todas as amostras utilizadas para o desenvolvimento deste método são amostras de diagnóstico clínico excedentes e ter aprovação ética do comitê de Londres Bloomsbury Ética.
Figura 1. Esquema ilustrando o processo geral de criação de um CSF MRM direcionados LC-MS / MS ensaio. Peptídeos marcador candidato para avaliação são seleccionados a partir de proteínas alvo. Através da utilizaç....
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Resultados
Utilizando o método descrito acima, um ensaio multiplex alto rendimento de 10 minutos consistindo de 74 peptídeos de 54 proteínas foi desenvolvido, como um ensaio para os marcadores dos distúrbios neurodegenerativos doença de Alzheimer e demência de Lewy (LBD) 8. A Figura 3 mostra um cromatograma em multiplex publicada previamente 8 dos marcadores peptídicos significativos do ensaio. Os péptidos incluídos no ensaio e as suas transições quantitativos.......
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Discussão
Tal como acontece com todos os ensaios baseados em MS, os passos críticos no método são a determinação das quantidades apropriadas e exactas dos padrões internos. Se quantificação absoluta está sendo usado, então as quantidades corretas de peptídeos cravado na curva padrão também são fundamentais.
O nosso ensaio não requer a precipitação do CSF ou o uso de qualquer tipo de limpa degraus ou de dessalinização antes da análise por MS - é um método inteiramente reacção de um só recipiente. Dev.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado e facilitado por meio da iniciativa de pesquisa GOSomics pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde, Centro de Pesquisa Biomédica do Great Ormond Street Hospital e Centro de Espectrometria de Massa Biológica da UCL no Instituto de Saúde Infantil da UCL com doações gentis da Fundação Szeban Peto. O Centro de Pesquisa de Demência é um centro de coordenação de pesquisa de Alzheimer no Reino Unido. Os autores reconhecem o apoio da Alzheimer's Research UK, da Unidade de Pesquisa Biomédica de Demência NIHR Queen Square, do Centro de Pesquisa Biomédica da UCL / H e do Centro de Neurologia Experimental Leonard Wolfson.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetonitrila (ACN), grau LC-MS | Ácido fórmico Fisher | A955-1 | |
| , grau LC-MS, | A117-50 | ||
| Sigma | D5545 - 5 g | ||
| de ácido clorídrico, 37% p/p | VWR | BDH3028 - 2,5 LG | |
| Iodoacetamida | Sigma | I1149 - 5 g | |
| de hidróxido de sódio (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Tripsina, grau de sequenciamento, | modificado Promega | V5113 | |
| Ácido trifluoroacético (TFA), grau LC-MS | Fisher | A116-50 | |
| Ureia | Sigma | U0631- 500 g | |
| Água, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Peptídeos sintetizados personalizados dessalinizados 1-4 mg | Genscript | aminoácido | |
| [13C; 15N] peptídeos personalizados | Genscript | personalizado | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Tioureia | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Pré-coluna VanGuard | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ m Coluna de 2,1 x 50 mm | Águas | 186007114 | |
| Enolase de Levedura | Sigma | E6126 | |
| 300 μ l frascos de vidro com tampa de rosca transparente | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Tampas de rosca com fenda em Y | Secador de Congelamento Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Edwards Mudulyo | Mudulyo | ||
| Concentrador/Velocidade de vácuo | Eppendof | concentrador plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S espectrômetro de massa | Waters | ||
| Acquity Sistema UPLC | Waters |
Referências
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al.
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Reimpressões e permissões
