Artigo de método

A High Throughput, multiplexados e alvejado proteômica CSF Ensaio para quantificar Neurodegenerativas Biomarkers e apolipoproteína E isoformas Estado

DOI:

10.3791/54541

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20 de outubro de 2016

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1Centre for Translational Omics, Genetics and Genomic Medicine Deptartment, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Dementia Research Centre, Institute of Neurology, University College London, 3Clinical Neurochemistry Laboratory, Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 4Neurology Unit, Department of Pathophysiology and Transplantation, University of Milan, 5Great Ormond Street Hospital for Children, University College London

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos um de alto rendimento, multiplex, e ensaio de líquido cefalorraquidiano proteômica alvo (CSF) desenvolvido com potencial para a tradução clínica. O teste pode quantificar potenciais marcadores e os factores de risco para a neurodegeneração, tais como as variantes de apolipoproteína E (E2, E3 e E4), e medir a sua expressão alélica.

Resumo

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Muitas doenças neurodegenerativas ainda faltam tratamentos efetivos. biomarcadores confiáveis ​​para a identificação e classificação destas doenças será importante para o desenvolvimento de futuras terapias inovadoras. Muitas vezes, os potenciais novos biomarcadores não torná-lo para a clínica devido a limitações no seu desenvolvimento e custos elevados. No entanto, proteômica alvo utilizando a reação múltipla Monitoramento Cromatografia Líquida-tandem / Espectrometria de Massa (MRM LC-MS / MS), especificamente usando triplos espectrômetros de massa quadrupolo, é um método que pode ser utilizado para avaliar rapidamente e validar biomarcadores para a tradução clínica em laboratórios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma tem sido amplamente utilizado para a medição de pequenas moléculas em laboratórios clínicos, mas que é o potencial para analisar proteínas, que faz com que seja uma alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked Immunosordobrado Assay) baseados em métodos. Descrevemos aqui como proteómica direccionada pode ser usada para medir os marcadores multiplexados de demência, incluindo a detecção e quantificação do factor de risco conhecido apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).

A fim de tornar o ensaio adequado para a tradução, que se destina a ser rápido, simples, altamente específica e de custo eficaz. Para conseguir isso, cada etapa no desenvolvimento do ensaio tem de ser optimizado para as proteínas individuais e os tecidos são analisados. Este método descreve um fluxo de trabalho típico incluindo várias dicas e truques para o desenvolvimento de um proteómica alvo MRM LC-MS / MS para a tradução .

O desenvolvimento do método é otimizado usando versões costume sintetizados de peptídeos quantotypic trípticos, que calibrar o MS para detecção e, em seguida, cravado no CSF ​​para determinar a identificação correta do peptídeo endógeno na separação cromatográfica antes da análise no MS. Para atingir absolute de quantificação, padrão interno de versões marcadas com isótopos estáveis ​​de péptidos com marcadores de sequências curtas de aminoácidos e de ácido contendo um local de clivagem de tripsina, são incluídas no ensaio.

Introdução

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O impacto cada vez maior de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, demência de Lewy e Doença de Parkinson, está se tornando um problema sócio-económico em muitos países 1. Há uma necessidade em biomarcadores adicionais que podem ser utilizados para identificar e classificar os pacientes nas fases iniciais da doença, e para monitorizar quaisquer potenciais novos tratamentos. O objetivo geral deste método é criar um pipeline genérico para uma forma simplificada, econômico e rápido de validação de marcadores CSF potenciais de neurodegeneração. O objecto consiste em utilizar a proteómica orientadas ou péptido MRM LC-MS / MS como um método facilmente modificável para avaliar múltiplas proteínas biomarcadores potenciais a partir de experiências de descoberta. Estes podem ainda ser multiplexados através de uma separação cromatográfica rápida (<10 minutos) e avaliados. Dentro desta tela multiplex de biomarcadores neurodegenerativas, incluímos a demência conhecido fator de risco apolipoproteína isoforma E4 (ApoE4), de modo que você pn determinar, simultaneamente, o seu estatuto e nível de expressão, pelo que eliminando a necessidade de testes de genotipagem separados 2. LC MS / MS é rotineiramente usado como o método de escolha para a quantificação exacta moléculas pequenas em relação aos outros métodos, tais como ELISA ou radioimunoensaio (RIA). Esta mudança no uso da tecnologia MS para análise de proteínas, tem sido impulsionada principalmente por problemas com as tecnologias baseadas em imuno. Estes incluem cruzada especificidade, variação entre lotes, a vida útil limitada, e o custo elevado. Portanto, proteômica alvo está rapidamente se tornando uma alternativa cada vez maior aos métodos de anticorpos baseados tais como Western blot, RIA e ELISA. No entanto, a capacidade de multiplexar diversos marcadores em um ensaio, é a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos baseados em imuno 3. A técnica é aplicável a muitos tecidos e tem sido utilizada como uma estratégia de validação para estudos diversos proteomics, incluindo o plasma e urina 4 5,6.

o technique pode ser aplicado a qualquer laboratório que tenha acesso e experiência no uso de espectrômetros de massa triplo quadrupolo. projeto peptídeo é relativamente simples, com o crescente uso de bancos de dados de código aberto. O competitivo mercado de síntese de peptídeos personalizados torna muito mais acessível. peptídeos pesados, no entanto, são caros e, portanto, os marcadores devem ser avaliadas em um pequeno grupo antes de se mudar para uma escala maior. Existe um potencial de crescimento para a técnica a ser utilizado nas configurações de diagnóstico clínico, com a maioria dos grandes hospitais tendo plataformas baseadas em triplo quadrupolo, que pode ser facilmente adaptado para executar os ensaios proteomic segmentados. Um exemplo desta aplicação do método, tornando-se na definição de diagnóstico de rotina, é a sua aplicação recente de rastreio mancha de sangue recém-nascido para a anemia falciforme 7.

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Protocolo

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NOTA:. Um esquema do protocolo geral descrito aqui é dada na figura 1 Todas as amostras utilizadas para o desenvolvimento deste método são amostras de diagnóstico clínico excedentes e ter aprovação ética do comitê de Londres Bloomsbury Ética.

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Figura 1. Esquema ilustrando o processo geral de criação de um CSF MRM direcionados LC-MS / MS ensaio. Peptídeos marcador candidato para avaliação são seleccionados a partir de proteínas alvo. Através da utilização de péptidos sintetizados costume, um método de multiplex de LC-MS / MS de destino é criado. Após a avaliação, o ensaio pode ser utilizado para avaliar a eficácia de potenciais marcadores de neurodegeneração.

1. Peptide Selection and Design

NOTA: Critérios para um péptido marcador é que ele deve ser exclusivo (proteotípicos (quantotypic). Para determinar se um peptídeo é único ou não, a ferramenta 'explosão' busca no site da UniProt (http://www.uniprot.org/blast/) pode ser usado.

  1. Definir uma lista de proteínas-alvo (marcadores), ou seja, da ApoE (ver Tabela 2).
    NOTA: Se o marcador foi identificado a partir de anteriores experiências de perfis proteômicos 8, em seguida, selecione o peptídeo que lhe dá a melhor resposta a partir desse conjunto de dados.
  2. Se esta informação não estiver disponível, usar sites de código aberto, como in silico digestão com tripsina de proteínas-alvo, usando uma ferramenta de software como o MS-Digest.
  3. Escolha do péptido que é tríptica e não suscetíveis a modificação pós-traducional.
    Nota: Esta informação pode ser verificada no site da UniProt www.uniprot.org. Evitar péptidos propensas a modificação química durante a preparação da amostra de LC-MS.
  4. Ordenar a síntese de costume dos peptídeos escolhidos.
    NOTA: peptídeos marcador pode ser personalizado sintetizado por várias empresas comerciais. Para o péptido ApoE quantotypic utilizado para medir os níveis totais de ApoE foi determinada como sendo AATVGSLAGQPLQER. As sequências peptídicas proteotípicos utilizados para determinar as variantes E2 e E4 são os péptidos trípticos para a posição 158 (RLAVYQAGAR e CLAVYQAGAR) e a posição 112 (LGADMEDVCGR e LGADMEDVR), respectivamente.

2. Preparação de ptidos

NOTA: Para selecionar as melhores transições quantitativos, a detecção da matriz (CSF) precisa ser otimizado. A maneira mais eficiente de optimizar péptidos multiplexados é criar conjuntos de péptidos em concentrações conhecidas. Estes agrupamentos podem, então, ser utilizado para o desenvolvimento de métodos e curvas padrão.

  1. Ressuspender péptidos sintéticos (detalhes de péptidos são apresentados na Tabela 2) a 1 mg estoque / mlconcentração de acordo com instruções do fabricante. Por padrão, se as instruções não estão disponíveis, os péptidos ressuspender em 50:50 (v / v) de acetonitrilo (ACN) / H 2 O.
  2. Preparar as diluições 1:10 do péptido a partir da concentração da piscina e 1,000 pmol de cada péptido para um tubo de microcentrífuga de ligação baixa. Seca-se para baixo num concentrador Speed-Vac o conjunto final e armazenar a -20 ° C. Prepare várias piscinas para uso futuro.
  3. Alíquota de 100 ml de CSF em tubos de ligação baixas. Liofilizar a CSF.
  4. Ressuspender uma alíquota de 1,000 pmol de péptidos combinados em tampão de digestão (Tris HCl a 100, pH 7,8, 6 M de ureia, 2 M tioureia, 2% ASB14) para se obter concentrações de 10 e 1 pmol / uL.
  5. Pico a péptidos reunidos numa das mL alíquotas liofilizados de 100 CSF a 0, 1, 2, 5, 10 e 15 concentrações de pM. Adiciona-se 20 ng de proteína não relacionada intacto, tais como enolase levedura para actuar como um padrão interno e de controlo para a eficiência da digestão de trypsin.
  6. Encher as alíquotas de LCR com digerir tampão a um valor final de 20 mL. Vórtice.
  7. Adicionar 1,5 uL de ditiotreitol (30 mg em 1 ml de Tris-HCl 100, pH 7,8) e agitar à temperatura ambiente durante 1 h.
  8. Adiciona-se 3 ul de iodoacetamida (35 mg em 1 ml de Tris-HCl 100, pH 7,8) e agitar à temperatura ambiente durante 45 min no escuro.
  9. Adicionar 165 ul de ddH 2 O.
  10. Adicionar 10 ul de 0,1 ug / ul de solução de tripsina modificada de grau de sequenciação ressuspensas em tampão de 50 mM de bicarbonato de amónio, pH 7,8. Incubar em um banho de água a 37 ° CO / N e parar a digestão por congelação amostras. Loja digere a -20 ° C até estar pronto para análise.

3. Optimização de MS Detecção Péptido

  1. Copiar e colar a sequência do péptido a ser optimizada, para um software apropriado, por exemplo, Horizonte 9. Clique sobre a sequência do péptido para obter as informaçõesde iões de massa ião precursor e produto esperado.
  2. Diluir os peptídeos de concentração de ações (ver secção 2.1) ainda mais para 1 ng / ml de concentração para o desenvolvimento do método MS.
  3. Diretamente infundir os peptídeos no espectrômetro de massa a uma taxa de fluxo otimizado (normalmente 0,1-0,8 ml / min) e com 0-5% de energia de colisão.
  4. Adquirir espectro de MS, a fim de identificar os íons precursores de cargas múltiplas experimentais 8. Escolha o íon precursor (m / z) que dá mais intensidade (doubly- ou íons precursores triplamente carregados são aconselhados).
  5. Reinfuse o péptido e aplicar a energia de colisão para fragmentar o péptido por induzida por colisão-dissociação (CID). Otimizar as energias cone e colisão para obter o melhor padrão de fragmentação (iões do fragmento unicamente ou duplamente carregadas e massa de iões de fragmento de preferência maior do que ion pai, são aconselhados).
  6. Verifique se as transições obtidos experimentalmente corresponder transições geradas in silico </ Em> (tal como descrito no passo 3.1). Salvar a lista de transição no arquivo método MRM usando pelo menos 2 transições mais intensos por íon precursor. Incluem 2 transições: 1 para a quantificação e 1 para a confirmação no ensaio final.
    NOTA: Alguns fabricantes de MS têm uma função (ou seja, Waters Intellistart) para MRM automatizado ou otimização análise SRM. Se possível infundir peptídeos com fases móveis combinados a 50 - 70% ACN com 0,1% de FA.

4. LC-MRM Desenvolvimento Método

NOTA: Analisar a mistura de péptidos sintéticos por um sistema de cromatografia líquida (UPLC) acoplado ao triplo espectrómetro de massa de quadrupolo Ultra Performance. Certifique-se a fonte está limpo. Solvente A é DDH 2 0 com 0,1% de FA; Solvente B é ACN com 0,1% de FA.

  1. Usar o sistema de LC-MS equipado com uma coluna UPLC embalado com C-18 de fase (1,6 um de diâmetro, 90 poros Å, 2,1 mm x 50 mm de comprimento) e ligado a uma pré-coluna da mesma fase.
  2. Degelo digere CSF no gelo, centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos e de transferência de 60 mL em 300 ml frascos de pastilhas de vidro e armazenar o resto de volta a -20 o C.
  3. Injectar a concentração mais elevada de ponto da curva padrão, utilizando 10 min 1 - gradiente ACN linear de 40% (ver Tabela 1 para definições de gradiente)
  4. Abra o cromatograma e retenção nota tempo resultante e duas transições (quantitativo) de topo mais intensos por peptídeo com todas as transições criadas na etapa 3.
  5. Com base nessas informações, atualizar um método MRM 10 min (criado no passo 3.6) com canais cronometrados para medir peptídeos (ver Figura 2 para um exemplo). Para manter a sensibilidade, manter cada canal com pontos por pico superior a 8 e tempo de permanência superior a 0,01 seg para, pelo menos, uma transição para cada péptido.
  6. Incluir 'atrasos de solventes' no método MRM: uma no início, até 10 segundos antes da primeira eluição de pico eoutra no final do método, 20 segundos depois do último pico de eluição. Faça isso selecionando "atrasos de solventes" em eventos de método no arquivo método MS.
  7. Executar a curva padrão através do método MRM cronometrado e garantir que não haja interferência picos inespecíficos com transições (gerados no passo 3.6) por verificação de linearidade.
  8. Determinar se os péptidos são detectáveis ​​através da execução de controle de pool não-cravado e CSF doença através do método.
  9. Remover os péptidos que se encontram abaixo do limite de detecção do ensaio.

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Figura 2. Exemplo de uma dinâmica MRM MS Method. Temporizado canais de transições de peptídeos podem ser agrupados de acordo com os tempos de retenção estabelecidos. Activar MRMs deve ser incorporada uma forma temporizada como os péptidos marcadores seleccionados eluir a partir da coluna de cromatografia, minimiza o número de TRAnsitions ao longo de um período de tempo e aumenta a sensibilidade do ensaio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. A adição de padrões internos

NOTA: Como descrito anteriormente 10, padrões internos marcados com isótopos estáveis podem ser incluídos no ensaio. Devido à custa destes padrões, é aconselhável primeiro avaliar os peptídeos na matriz.

  1. Determinar os peptídeos ideais otimizados para detecção no LCR: escolher os péptidos que são as mais recorrentes, com maior intensidade e sem picos de interferência.
  2. Desenho péptidos correspondente para incluir 13 C 15 N etiquetas de aminoácidos pesados que aumentam a massa do péptido de pelo menos 6 Da relação ao peptídeo endógeno. Além disso, adicionar uma marca de 4 - 6 aminoácidos adicionais, quer ao N ou C-terminal da cadeia pesada pepmaré de controlar para a digestão tríptica.
  3. Diluir padrões internos marcados com isótopos estáveis ​​em tampão de digestão (veja o passo 2.4). Determinar a quantidade ideal de padrão interno marcada com isótopo estável, que será cravada em CSF por cravação em vários níveis, dependendo dos abundancies anteriormente observados durante o desenvolvimento. Destinam-se a atingir cerca de 1: 1 proporção de padrão marcado com isótopo estável de péptido endógeno.
    NOTA: padrões internos marcados com isótopos estáveis ​​podem ser sintetizados por várias empresas comerciais.

6. LC-MRM Ensaio de amostras de doentes CSF

  1. Pico optimizado quantidade de padrões marcados com isótopos estáveis ​​em 100 uL de CSF e liofilizar a mistura.
  2. Ressuspender o CSF ​​em 20 ul de tampão digest e realizar a digestão conforme descrito nos pontos 2.7 - 2.10.
  3. Analisar as amostras utilizando o método LC-MRM desenvolveu na etapa 4.
  4. Para a análise quantitativa, execute o pep padrãomarés em concentrações de 0 -15 pmol de uma curva padrão. Ver passo 2.5 para a preparação da curva padrão.

Análise 7. Os dados

NOTA: quantitativo de dados baseia-se na relação da intensidade da linha de base de padrões internos de pico (péptidos marcados) pesado. Informações detalhadas sobre a análise de dados / MRM SRM foi previamente descrito 10. dados de relação pode então ser utilizado numa curva padrão para determinar os níveis absolutos ou calcular-los a partir da concentração de péptido adicionado pesada-rotulados.

  1. Analisar dados LC-MRM utilizando software padrão dos espectrômetros de massa dos fabricantes 10. Como alternativa, use software Skyline para analisar os dados quantitativos MRM 10.
  2. Verifique a sensibilidade do prazo, verificando a resposta de um padrão interno, tais como a enolase levedura cravado ou um padrão marcado com isótopos estáveis ​​em cada corrida. Assegure-se que o coeficiente de variação (CV) não é maior do que25%.
  3. rever manualmente a anotação de dados para garantir a precisão. Analisar cada péptido e relação a um padrão interno marcada com isótopo estável adequada, ou seja, utilizar a versão marcada com isótopo estável do péptido, se disponível.
  4. Para obter os valores absolutos de 100 pmol por uL de CSF, executar o rácio de dados através de curvas padrão apropriadas que foram executados ao mesmo tempo.
  5. Calcular o coeficiente de variação (CV). CV para cada péptido deve ser inferior a 25% e inferior a 15% para péptidos elevados abundantes.
    NOTA: valor pmol Absolute por 100 valores CSF ul pode ser usado na análise estatística jusante subsequente.

8. A apolipoproteína E isoformas Estado

NOTA: Para determinar o estado de isoforma ApoE, a presença dos péptidos correspondentes pode ser realizada pela determinação da presença de cada isoforma.

  1. Considere o ApoE em 100 ul de limiar CSF de> 1.000 de sinal-to-ruído como positivo para esse péptido. Ver Figura 5 para os péptidos necessários / ausentes para determinar o estado de um paciente isoforma. Determinar a expressão alélica através do cálculo da% de cada uma das isoformas da ApoE ao total de expressão.

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Resultados

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Utilizando o método descrito acima, um ensaio multiplex alto rendimento de 10 minutos consistindo de 74 peptídeos de 54 proteínas foi desenvolvido, como um ensaio para os marcadores dos distúrbios neurodegenerativos doença de Alzheimer e demência de Lewy (LBD) 8. A Figura 3 mostra um cromatograma em multiplex publicada previamente 8 dos marcadores peptídicos significativos do ensaio. Os péptidos incluídos no ensaio e as suas transições quantitativos...

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Discussão

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Tal como acontece com todos os ensaios baseados em MS, os passos críticos no método são a determinação das quantidades apropriadas e exactas dos padrões internos. Se quantificação absoluta está sendo usado, então as quantidades corretas de peptídeos cravado na curva padrão também são fundamentais.

O nosso ensaio não requer a precipitação do CSF ​​ou o uso de qualquer tipo de limpa degraus ou de dessalinização antes da análise por MS - é um método inteiramente reacção de um só recipiente. Dev...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado e facilitado por meio da iniciativa de pesquisa GOSomics pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde, Centro de Pesquisa Biomédica do Great Ormond Street Hospital e Centro de Espectrometria de Massa Biológica da UCL no Instituto de Saúde Infantil da UCL com doações gentis da Fundação Szeban Peto. O Centro de Pesquisa de Demência é um centro de coordenação de pesquisa de Alzheimer no Reino Unido. Os autores reconhecem o apoio da Alzheimer's Research UK, da Unidade de Pesquisa Biomédica de Demência NIHR Queen Square, do Centro de Pesquisa Biomédica da UCL / H e do Centro de Neurologia Experimental Leonard Wolfson.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acetonitrila (ACN), grau LC-MSÁcido fórmico FisherA955-1
, grau LC-MS,A117-50
Sigma D5545 - 5 g
de ácido clorídrico, 37% p/pVWR BDH3028 - 2,5 LG
Iodoacetamida   Sigma I1149 - 5 g
de hidróxido de sódio (NaOH)FisherS318-500
Tripsina, grau de sequenciamento,modificado PromegaV5113
Ácido trifluoroacético (TFA), grau LC-MSFisherA116-50
UreiaSigmaU0631- 500 g
Água, LC-MS ULTRA ChromasolvFluka14263
Peptídeos sintetizados personalizados dessalinizados 1-4 mgGenscriptaminoácido
[13C; 15N] peptídeos personalizadosGenscriptpersonalizado
ASB 14Merck Millipore182750 - 25 g
TioureiaSigmaT7875 - 500 g
Tris baseSigmaT6066
Pré-coluna VanGuardWaters186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ m  Coluna de 2,1 x 50 mmÁguas186007114
Enolase de Levedura SigmaE6126
300 μ l frascos de vidro com tampa de rosca transparenteFisher scientific03-FISV
Tampas de rosca com fenda em Y Secador de Congelamento Fisher scientific9SCK-(B)-ST1X
Edwards Mudulyo Mudulyo
Concentrador/Velocidade de vácuoEppendof concentrador  plus 5301
Xevo -TQ-S espectrômetro de massaWaters
Acquity Sistema UPLCWaters
Dithiothreitol (DTT) Fisher fortemente marcado personalizado Sistema

Referências

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