Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Resumo

Descrevemos aqui um método para gerar microarrays de antígenos personalizáveis que podem ser usados para a detecção simultânea de autoanticorpos séricos IgG e IgM de humanos e camundongos. Essas matrizes permitem alto rendimento e detecção quantitativa de anticorpos contra quaisquer antígenos ou epítopos de interesse.

Resumo

Autoanticorpos, que são anticorpos contra autoantígenos, estão presentes em muitos estados de doença e podem servir como marcadores para a atividade da doença. Os níveis de autoanticorpos para antígenos específicos são normalmente detectados com a técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, a triagem de múltiplos autoanticorpos com ELISA pode ser demorada e requer uma grande quantidade de amostra de pacientes. A técnica de microarranjo de antígenos é um método alternativo que pode ser usado para rastrear autoanticorpos de forma multiplex. Nesta técnica, os antígenos são dispostos em lâminas de microscópio especialmente revestidas com um microarrayer robótico. As lâminas são sondadas com amostras de soro do paciente e, posteriormente, anticorpos secundários marcados com fluorescência são adicionados para detectar a ligação de autoanticorpos séricos aos antígenos. As reatividades de autoanticorpos são reveladas e quantificadas por varredura das lâminas com um scanner que pode detectar sinais fluorescentes. Aqui descrevemos métodos para gerar microarrays de antígenos personalizados. Nossas matrizes atuais são impressas com 9 pinos sólidos e podem incluir até 162 antígenos detectados em duplicata. As matrizes podem ser facilmente personalizadas alterando os antígenos na placa de origem usada pelo microarrayer. Desenvolvemos um esquema de detecção de anticorpos secundários de duas cores que pode distinguir as reatividades de IgG e IgM na mesma superfície da lâmina. O sistema de detecção foi otimizado para estudar a ligação de autoanticorpos humanos e murinos.

Introdução

Os autoanticorpos estão presentes em muitos estados de doença e muitas vezes podem ter atividade patogênica direta¹. A identificação de autoanticorpos é importante para o diagnóstico de determinadas doenças, para o prognóstico do desfecho da doença e para a classificação de pacientes que podem se beneficiar de terapias específicas². Os autoanticorpos são tipicamente identificados no soro do paciente usando a técnica ELISA; no entanto, a triagem de múltiplos antígenos com essa técnica é trabalhosa e consome uma grande quantidade de amostra de pacientes. Novas tecnologias são, portanto, necessárias para traçar o perfil dos autoanticorpos em maior escala.

A técnica de microarray de antígeno é uma tecnologia proteômica que permite que os autoanticorpos sejam perfilados de forma multiplex³. Na primeira etapa desse processo, uma biblioteca de antígenos é disposta em uma superfície de lâmina usando um microarrayer robótico. As lâminas são sondadas com soro diluído e, em seguida, anticorpos secundários marcados com fluorescência são adicionados. As reatividades de anticorpos são visualizadas por varredura das lâminas com um scanner de microarray e quantificadas por intensidades fluorescentes. Os microarrays de antígenos oferecem múltiplas vantagens sobre a técnica ELISA na triagem de autoanticorpos: 1) eles requerem apenas microlitros de soro para traçar o perfil de autoanticorpos para vários antígenos simultaneamente, 2) eles usam antígenos com moderação, pois apenas nanolitros de antígeno são detectados nas matrizes, 3) eles têm sensibilidade aprimorada³ em comparação com ELISA e 4) eles permitem o simultâneo ainda, detecção separada de mais de um isotipo de anticorpo. Microarrays de antígenos têm sido usados para traçar o perfil de autoanticorpos em doenças autoimunes, como artrite reumatoide, esclerose múltipla e lúpus eritematoso sistêmico^4-6. Em todas essas três doenças, uma nova visão sobre a patogênese da doença foi obtida a partir do perfil de autoanticorpos em larga escala com as matrizes.

Aqui descrevemos um protocolo para gerar microarrays de antígenos usando lâminas revestidas de nitrocelulose. Uma variedade de antígenos, incluindo proteínas, peptídeos e lisados celulares, pode ser disposta nas lâminas usando esta técnica. As matrizes podem ser facilmente personalizadas incluindo antígenos de interesse na placa de origem que contém a biblioteca de antígenos. Além disso, mostramos como um par de anticorpos secundários pode ser usado para separar as reatividades de IgG e IgM na mesma superfície da lâmina. Agora otimizamos essa técnica para medir autoanticorpos em humanos e camundongos.

Protocolo

1. diluindo Antígenos e gerando Antigen Microarrays

1. Diluir antigénios em PBS para uma concentração final de 0,2 mg / ml. Imprimir até 162 antígenos únicos em duplicado com uma configuração microarrayer com 9 pinos. Incluem antigénios de IgG e IgM na biblioteca antigénio como controlos positivos. Incluem apenas PBS como controlo negativo.
2. Adicionar 20 ul de cada antigénio para a placa de fonte de 384 poços. Adicionar antígenos para a placa de fonte em grupos que espelham a configuração da cabeça de impressão (por exemplo, organizar antígenos em grupos de 9, quando 9 pinos são utilizados para impressão).
3. placa fonte Cubra com papel alumínio e congelar a -80 ° C até que esteja pronto para imprimir arrays.
4. Limpar os pinos microarrayer sólidos, incubando-as num banho de ultra-sons com água desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pinos no rack para secar e em seguida, organizar pinos no cabeçote microarray. Para 9 pinos, use uma configuração de 3 x 3.
5. microarrayer Programa de impressão gerido pela definição do número de pinos na cabeça de impressão,número de lâminas de imprimir, o número de pastilhas em cada lâmina, e o número de pontos em replicado para cada antigénio. Normalmente, utilize 9 pinos, 70 slides, 2 almofadas / slides, e 2 pontos em replicado para cada antigénio. microarrayer programa para sonicate pinos na água entre diferentes grupos de antígenos.
6. placa fonte descongelar e placa, em seguida, centrifuga-se durante 1 min a 100 x g. Coloque placa de fonte no local designado na microarrayer. Retirar a parte da folha que está cobrindo o primeiro grupo de antigénios a ser impresso.
7. Organizar os slides não impressos na superfície arrayer e executar o programa de impressão. lâminas de impressão em temperatura ambiente com umidade definida no arrayer a 55 - 60% com a construção em umidificador da máquina matriz.
8. Depois de cada grupo de antígenos é impresso em todos os slides, pause o microarrayer. Cobrir os antigénios que foram impressas apenas com uma folha (para evitar a evaporação) e descobrir o próximo grupo de antigénios a ser impresso. Continue programa de impressão.
9. Depois de todos os antígenos foram impressas, fonte de cobertura de plcomeu com novo pedaço de papel alumínio e congelar a -80 ° C. Coloque slides impressos na caixa slide e selo de vácuo. As lâminas podem ser usados ​​no dia seguinte ou até um mês mais tarde.

2. Sondagem Antigen Microarrays com soro diluído

1. Coloque slides em quadros usando câmaras de incubação. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio (2,5% [vol / vol] de soro de vitelo fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 em PBS) a cada superfície de matriz.
2. Coloque película adesiva sobre o quadro e coloque em um recipiente fechado, com um pedaço de tecido molhado. Incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo.
3. Diluir as amostras de soro de 1: 100 em tampão de bloqueio. Aspirar solução a partir de matrizes de bloqueio e adicionar 500 ul de amostra diluída a cada superfície de matriz.
4. Cubra com filme adesivo e incubar durante 1 hora a 4 ° C com agitação.
5. Diluir anticorpos secundários em tampão de bloqueio. Para os estudos humanos, dilui-se um anticorpo de IgG de cabra Cy3 anti-humano marcado para 0,33 ug / ml e marcado com Cy5 de um anticorpo de cabra anti-humaN anticorpo IgM para 0,25 ug / ml. Para os estudos de rato, dilui-se uma cabra marcado com Cy3 de anticorpo IgG anti-rato a 0,38 ug / mL e um anticorpo marcado com Cy5 anti-murganho de cabra IgM para 0,7 ug / ml.
6. Aspirar as amostras a partir de matrizes e lavar superfícies de matriz 4 vezes com tampão de lavagem (0,1% de Tween 20 em PBS). Pour tampão para a slides e agite rapidamente.
7. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio para lavar cada superfície de matriz e incubar 10 min à TA com agitação. etapa de lavagem Repita mais duas vezes.
8. Adicionar 500 uL de anticorpo secundário diluído a cada superfície de deslizamento e cobrir com película adesiva. Incubar 45 min a 4 ° C com agitação.
9. Aspirar mistura de anticorpo secundário a partir de lâminas e lavar 4 vezes como acima. Lave as lâminas 3 vezes com 700 ul de tampão de bloqueio / diluição como acima.
10. Retirar as lâminas de quadros e coloque em porta-lâminas de metal que está imerso em PBS. Incubar 20 min a RT com agitação orbital. Coloque no novo recipiente de PBS e incubar mais 20 mcom agitação.
11. Lugar porta-lâminas no recipiente de água deionizada 15 seg. Coloque em rack em um novo recipiente de água e incubar mais 15 seg.
12. Para lâminas secas, lugar porta-lâminas em um adaptador de placa de ELISA em centrífuga e girar a 220 xg por 5 min a RT.
13. Colocar as lâminas na caixa à prova de luz até que esteja pronto para a digitalização.

3. A digitalização Antigen Microarrays e exportação de dados

1. Digitalizar slides usando um scanner de microarray que podem detectar sinais fluorescentes Cy3 e Cy5. A fim de ajustar os níveis de tubo fotomultiplicador (PMT) do scanner, pré-digitalizar um slide que só foi sondado com anticorpos secundários.
   Nota: Esta corrediça deve ter a biblioteca antigénio completo impresso nele incluindo positivo (IgG e IgM), bem como controlos negativos (PBS). A pré-digitalização é uma digitalização de baixa resolução que permite que o usuário rapidamente para encontrar as configurações ideais PMT.
2. Defina os valores de PMT de modo que os recursos humanos IgG (no canal Cy3) e o zumbidouma características IgM (no canal Cy5) têm um semelhante mediana intensidade de fluorescência menos de fundo (MFI-B) (tipicamente 40.000). Os níveis PMT são definidos pressionando o botão "hardware". Uma vez definido, manter essas configurações PMT constante.
3. Digitalizar os slides experimentais sobre os dois canais, premindo o botão "Scan". Salve as imagens de slides (ambos os canais) após cada digitalização.
4. Coloque o slide a ser analisados ​​no software microarray usando o botão "file".
5. Carregar o arquivo de lista de matriz gene (GAL) utilizando o botão "file". O arquivo GAL tem o layout da matriz com as identidades das características da matriz.
6. Coloque o modelo de matriz sobre a imagem digitalizada para que as matrizes características corresponder ao modelo, tanto quanto possível.
7. Alinhar recursos em todos os blocos com o modelo premindo o botão "align". O programa vai encontrar geralmente o contorno das características circulares, mas alguns ajustes manuais podem ser necessárias. Estes ajustes podem ser feitos através da introdução do modo de recurso. O software terá, então, calcular um MFI-B para cada um dos antigénios.
8. Use o botão "Arquivo" para exportar estes resultados como um arquivo de texto.

4. Analisando dados matriz com análise da significância dos microarrays (SAM)

1. Carregar arquivos de texto individuais em excel e identificar as colunas que têm MFI-B para os canais Cy3 e Cy5.
2. Calcule a média dos recursos duplicados.
3. Para qualquer negativo MFI-B, substitua o número negativo com 10. Transformar dados dividindo-primas MFI-B por 100 e, em seguida, calculando log de base 2.
4. Analisar log de ​​dados transformados com análise da significância dos microarrays (SAM), como descrito anteriormente ^7.
5. Para um estudo com dois grupos (por exemplo, controles saudáveis ​​versus pacientes), etiqueta um grupo "1" e o grupo "2." Use uma de duas classes, a análise não emparelhado na SAM para identificar os antígenos reacções que são significantly diferente entre os dois grupos (valor q <0,05).
6. Use um software de clustering e de geração de calor mapa para fazer imagens para a apresentação ^8.

Resultados

Os antigénios são dispostos em uma placa de 384 poços e impresso em lâminas por um microarrayer robótico como mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra as lâminas colocados num quadro com câmaras de incubação e uma corrediça digitalizada após o processamento. A Figura 3 mostra as lâminas de controlo positivas e negativas. O slide negativo apenas deve ser sondado com anticorpos secundários, ea lâmina de controlo positivo é sondada com soro ...

Discussão

O protocolo aqui descrito permite a quantificação de auto-anticorpos, utilizando a técnica de microarray antigénio. microarrays Antigen oferecem várias vantagens sobre ELISA convencional na pesquisa de auto-anticorpos. Primeiro de tudo, uma variedade de antigénios, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, e os lisados ​​celulares podem ser dispostas sobre as lâminas revestidas com nitrocelulose, permitindo, assim, para o rastreio multiplexado de auto-anticorpos. Além disso, apenas microgramas de antigénio são n...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ribossômico P0	Diarect	14100	diluir para 0,2 mg / ml em PBS
humano IgG	Jackson Immuno	009-000-003	diluir para 0,2 mg / ml em
PBS humano IgM	Jackson Immuno	009-000-012	diluir para 0,2 mg / ml em
PBS camundongo IgG Sigma-Aldrich		I5381	diluir para 0,2 mg / ml em
PBS camundongo IgM	Biolegend	401601	diluir para 0,2 mg/ml em PBS
DNA de fita dupla	Sigma-Aldrich	D1626	diluir para 0,2 mg/ml em PBS
DNA de fita simples	Sigma-Aldrich	D8899	diluir para 0,2 mg/ml em
PBS microarrayer	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	muitos tipos de arrayers são
adequados pinos de impressão sólidos	Arrayit Corporation	SSP015
software para microarrayer robótico	Virtek	Chipwriter Pro
Lâminas FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10485317
estrutura FAST	GVS Northa America	10486001
câmaras de incubação FAST (2 Pad)	GVS Northa America	10486242
placas de 384 poços	Seladoras de placas Whatman	7701-5101
VWR		60941-062
tampas	de placas de alumínioVWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Soro fetal de bezerro	Invitrogen	12483020
Cy3 cabra anti-humano IgG	Jackson Immuno	109-165-096	use estoque de trabalho em 50% glyercol
Cy5 cabra anti-humano IgM	Jackson Immuno	109-175-129	use estoque de trabalho em 50% glyercol
Cy3 cabra anti-rato IgG	Jackson Immuno	115-165-071	uso de estoque de trabalho em 50% glyercol
Cy5 cabra anti-rato IgM	Jackson Immuno	115-175-075	uso de estoque de trabalho em 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices Axon	4200A
Microarray software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Software de mapa de calor	eisenlab.org	Treeview 1.60
Software estatístico de microarray	Universidade	de Stanford SAM 4.0 (Análise de Significância de Microarrays)