Artigo de método

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

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DOI:

10.3791/54546

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17 de setembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo para detecção colorimétrica de E. coli usando um teste decisivo modificado que aproveita uma DNAzima, urease e esferas magnéticas de clivagem de RNA.

Resumo

Há uma demanda crescente por métodos simples, mas ainda eficazes, que possam ser usados para detectar patógenos específicos para aplicações no local de atendimento ou em campo. Esses métodos precisam ser fáceis de usar e produzir resultados confiáveis que possam ser facilmente interpretados por especialistas e não profissionais. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz, pois relata o pH de uma amostra de teste por meio de uma simples mudança de cor. Desenvolvemos uma abordagem para aproveitar o teste decisivo para detecção bacteriana. O método explora uma DNAzyme de clivagem de RNA específica da bactéria para realizar duas funções: reconhecer uma bactéria de interesse e fornecer um mecanismo para controlar a atividade da urease. Através do uso de esferas magnéticas imobilizadas com um conjugado DNAzyme-urease, a presença de bactérias em uma amostra de teste é transmitida para a liberação da urease das esferas para a solução. A urease liberada é transferida para uma solução de teste para hidrolisar a ureia em amônia, resultando em um aumento de pH que pode ser visualizado usando o teste decisivo clássico.

Introdução

Os patógenos bacterianos são uma das principais causas de morbidade e mortalidade global. Surtos de infecções hospitalares, patógenos transmitidos por alimentos e contaminantes bacterianos no meio ambiente representam ameaças sérias e contínuas à saúde e segurança públicas. Para prevenir esses surtos, são necessárias ferramentas eficazes que permitam a detecção de patógenos em tempo hábil em uma variedade de configurações. Testes simples, mas ainda eficazes, portáteis e econômicos, são muito cobiçados, especialmente em regiões suscetíveis a surtos, mas que não podem pagar por instalações de teste caras. 1-3 Embora exista uma infinidade de métodos para detectar bactérias, muitos deles não são adequados como ferramentas de triagem ou teste no local porque exigem longos tempos de teste, instrumentos caros e procedimentos de teste complicados.

Os testes colorimétricos são particularmente atraentes para aplicações de campo ou de ponto de atendimento, pois as mudanças de cor podem ser facilmente detectadas a olho nu. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz. Embora seja uma tecnologia muito antiga, ainda hoje é amplamente utilizada devido à sua simplicidade e eficácia. Surpreendentemente, este teste simples nunca havia sido modificado para alcançar a detecção de outros analitos antes de desenvolvermos recentemente uma abordagem de modificação deste teste para testes de E. coli. 4

O teste de tornassol expandido para E. coli emprega três componentes adicionais: um DNAzyme de clivagem de RNA ativado por E. coli (EC1), 5 urease e esferas magnéticas. DNAzymes referem-se a moléculas sintéticas de DNA de fita simples com atividade catalítica. 6 Eles podem ser isolados de pools de DNA de sequência aleatória usando seleção in vitro. 7,8 Eles são altamente estáveis e podem ser produzidos de forma econômica usando síntese automatizada de DNA de alta eficiência. 9 Por essas razões, as DNAzimas, particularmente as DNAzimas de clivagem de RNA, foram amplamente examinadas para aplicações de biossensores. 6,10,11 Sensores DNAzyme de clivagem de RNA foram desenvolvidos para detectar íons metálicos,12-16 pequenas moléculas,17,18 patógenos bacterianos5,19-21 e células cancerígenas. 22 Dada a grande disponibilidade de DNAzimas de clivagem de RNA induzidas por alvo, qualquer ensaio que utilize uma DNAzima pode ser potencialmente expandido para detectar uma gama diversificada de analitos.

A urease é escolhida por sua capacidade de hidrolisar a ureia em amônia,23,24 resultando em um aumento de pH. A urease também é altamente eficiente, estável e passível de conjugação com outras biomoléculas. Portanto, postulamos que um conjugado de um DNAzyme de clivagem de RNA com urease permitiria o uso do teste decisivo para a detecção de outros alvos. 5

A ação da DNAzima de clivagem de RNA é retransmitida para o aumento do pH mediado pela urease através do uso de esferas magnéticas que são imobilizadas com o conjugado DNAzyme-urease. Como a atividade do DNAzyme sob investigação é estritamente dependente de E. coli, a presença dessa bactéria na solução de teste resultará na liberação de urease dos grânulos magnéticos para a solução, que é então retirada e usada para hidrolisar a ureia em uma solução repórter que contém um corante sensível ao pH. O resultado final deste procedimento é uma mudança de cor que pode ser convenientemente relatada pelo corante ou papel de pH.

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Protocolo

1. Preparação de Reagentes e Buffers

  1. Ácido m-0,5 etilenodiaminotetracético (EDTA)
    1. Numa proveta de 2 litros, adicionar 186,1 g de EDTA em 800 ml de água desionizada-destilada (ddH2O). Ajustar o pH da solução a 8,0 usando peletes de NaOH. Adicionar ddH2O para um volume final de 1,0 L e transferir a solução para um frasco de vidro autoclavável para esterilização em autoclave e armazenar a 4 ° C.
  2. EDTA 10 × tampão Tris-borato (10x TBE)
    1. Em um copo de plástico de 4 L, adicionar 432 g de base Tris, 200 g de ácido bórico, 80 ml ​​de 0,5 M de EDTA (pH 8,0) e ddH2O para um volume final de 4 L. mistura utilizando uma barra de agitação até que todos os componentes são dissolvidos. Transferir a solução para garrafas de vidro de 1 L de autoclavagem e armazenar a 4 ° C.
  3. 10% de poliacrilamida desnaturante da
    1. Em um copo de plástico de 4 L, adicione 1681,7 g de ureia, 400 ml de 10x TBE, 1 L de 40% de acrilamida / bisacrilamida (29: 1) e solução de ddH2O até ao fvolume de inal é de 4 L. Mix usando uma barra de agitação até que a ureia é dissolvido. Transferir a solução para 1 L frascos de vidro âmbar e armazenar a 4 ° C.
  4. 2x Gel carregando Buffer (2x GLB)
    1. Em um copo de vidro de 200 ml, adicionar 44 g de ureia, 8 g de sacarose, 10 mg de azul de bromofenol, 10 mg de cianol de xileno FF, 400 ul de sulfato de dodecilo de sódio a 10%, e 4 ml de 10 x TBE. Adicionar ddH2O para um volume final de 40 ml e dissolve-se os componentes com aquecimento suave a 50 ° C, enquanto se mistura com uma barra de agitação magnética. Transferência alíquota de 1 ml para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a 4 ° C.
      NOTA: O uso anterior requer breve aquecimento a 90 ° C para redissolver qualquer sólido.
  5. 1 M de Tris-cloridrato (Tris-HCl) (pH 7,5)
    1. Em um frasco de vidro, adicionar 12,1 g de Tris-base e 70 ml de ddH2O e misturar até o sólido estar dissolvido. Ajustar o pH para 7,5 utilizando ácido clorídrico 1 M (HCl). Adicionar ddH2O para um volume final de 100 ml, autoclave e STOre a 4 ° C
  6. 5 M de cloreto de sódio (NaCl)
    1. Em um frasco de vidro, dissolver 58,4 g de NaCl em 150 ml de ddH 2 O. Ajustar o volume para 200 ml com DDH 2 O. Armazenar a 4 ° C.
  7. Tampão de Eluição de DNA
    1. Em um frasco de vidro, misturar 2,0 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,5), 8,0 ml de NaCl 5 M e 0,4 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0). Ajustar o volume a 200 ml com ddH2O, autoclave e armazenar a 4 ° C.
  8. 1 H 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) (pH 7,4)
    1. Em um frasco de vidro, dissolver 2,38 g de HEPES em 80 ml ​​de ddH 2 O. Ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH 5 N e adicionar ddH2O para um volume final de 100 ml.
  9. 1 M de cloreto de magnésio (MgCl2)
    1. Em um frasco de vidro, adicionar 2,03 g de MgCl 2 -6H 2 O e levar o volume até 100 ml com ddH 2 O.
  10. Tampão de Reacção (RB)
    1. Num tubo de 50 ml, adicionar 50 ul de HEPES 1 M (pH 7,4), 1,5 ml de NaCl 5 M, 0,75 mL de 1 M de MgCl2, e 5 ul de Tween-20. Adicionar ddH2O para um volume final de 50 ml. Misturar a solução e filtra-se para outro tubo cónico utilizando um filtro de seringa-driven (0,22 um) e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
  11. Tampão de Ligação (BB)
    1. Num tubo de 50 ml, adicionar 500 ul de Tris-HCl 1 M (pH 7,5), 8,8 g de NaCl, 50 ul de 1 M de MgCl2, e 5 ul de Tween 20. Adicionar ddH2O para um volume final de 50 ml. Misturar a solução e filtra-se para outro tubo cónico utilizando um filtro de seringa-driven (0,22 um) e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
  12. Solução substrato (SS)
    1. Num tubo de 50 ml, adicionar 5,8 g de NaCl, 3 ml de 1 M de MgCl2, 1,5 g de ureia, e 40 ml de ddH 2 O. Ajuste o pH da solução para 5,0 utilizando HCl a 10 mM. Uma vez que a solução não é tamponada, ajustar o pH usando HCIcuidadosamente através da adição de pequenas alíquotas de HCl. Adicionar ddH2O para um volume final de 50 ml.
    2. Misturar a solução e filtra-se para outro tubo cónico utilizando um filtro de seringa-driven (0,22 um) e armazenar a 4 ° C até à sua utilização.
  13. Luria Bertani (LB) Caldo
    1. Numa proveta, dissolver 20,0 g LB pó em 1 L de ddH 2 O. Transfira para uma garrafa de vidro, autoclave, e armazenar a 4 ° C.
  14. 1,5% de agar LB
    1. Em um balão de 250 ml, adicionar 1,5 g de agar e 100 ml de caldo LB. Autoclave e armazenar a 4 ° C.
  15. As placas de agar
    1. Redissolve-se o agar LB num forno de microondas e arrefecer a solução até ~ 50 ° C. Verter a solução em placas de Petri, tornando ~ 5 placas e permitir-lhes a solidificar.

2. Síntese e purificação de E. coli- responsiva ADNzima EC1

  1. Síntese de EC1 by Template Mediated enzimática Ligadura
    1. purificar commercially oligonucleótidos sintetizados BS1, DE1, e T1 (sequências proporcionadas na Tabela 1) em 10% de electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (dPAGE) de acordo com protocolos padrão.
    2. Prepare um estoque de 100 M de BS1, DE1 e T1. Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
    3. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 38,5 mL de ddH2O, 5 ul de DE1, e 5 ul de 10 x T4 tampão de reacção de cinase de polinucleótidos fornecidos pelo fornecedor da enzima (Tris-HCl 500 (pH 7,6), MgCl2 100, ditiotreitol 50 mM (DTT), 1,0 mM de espermidina).
    4. Adicionar 1 ml de adenosina trifosfato (ATP) (100 mM). Adicionam-se 5 unidades de cinase de polinucleótido de T4 (10 U / ul). Misturar por pipetagem cuidadosamente a mistura de reacção.
    5. Incubar a reacção a 37 ° C durante 30 min.
    6. Extingue-se a reacção por aquecimento a 90 ° C durante 5 min.
    7. Adicionar 118 uL de ddH2O, 5 ul de BS1, e 5 ul de T1. Aquece-se a reacção a 90 ° C durante 2 min e, em seguida, arrefecer até à temperatura ambiente ao longo de 10 min.
    8. Adicionar 20 ul de 10 x T4 ADN ligase de tampão de reacção fornecido pelo fornecedor da enzima (Tris-HCl 400 (pH 7,8), MgCl2 100 mM, DTT a 100 mM, ATP 5 mM). Adicionam-se 10 unidades de ligase do DNA de T4 (5 U / uL) e mistura-se cuidadosamente por pipetagem.
    9. Incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
    10. Adicionar 20 ul de 3 M de acetato de sódio (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul de etanol frio a 100%. Misture a solução por agitação em vórtice e colocar o tubo num congelador a -20 ° C durante 30 min.
    11. Centrifuga-se o microcentrifuga a 20000 xg durante 20 min a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.
    12. Lava-se a pastilha com etanol frio a 70% e centrifuga-se novamente a 20000 xg durante 10 min a 4 ° C. Mais uma vez, remove-se o sobrenadante e secar o sedimento sob vácuo durante 10 min.
    13. Ressuspender o ADN com 15 uL de ddH2O e, em seguida, adicionar 15 ul de 2x GLB.
    14. Vortex vigorosamente e aquecer a 90 ° C durante2 min. Purifica-se o ADN de comprimento completo por 10% dPAGE como descrito abaixo.
  2. Configurando 10% dPAGE
    1. placas limpas dois de vidro (um prato completo e um entalhadas), duas de 0,75 mm de espessura espaçadores, e um pente de 12 poços. Lay uma placa de vidro em uma superfície plana, com dois espaçadores de cada lado e a placa entalhada no topo. Corte as duas placas em conjunto, utilizando os quatro grampos fornecidos pelo fornecedor.
    2. Em um copo de plástico de 150 ml, verter 40 mL de 10% dPAGE, 40 ul de tetrametiletilenodiamina (TEMED) e 400 ul de persulfato de amónio a 10% (APS). Misturar os componentes e despeje a solução entre as placas lentamente.
    3. Insira o pente e, em seguida, permitir que o gel para polimerizar durante 10 minutos. Uma vez que o gel é polimerizado, retire lentamente o pente e lavar os poços com DDH 2 O.
    4. Montar as placas num aparelho de electroforese em gel. Use uma placa de metal para dissipar o calor gerado para evitar o superaquecimento.
    5. Despeje TBE 1x para as câmaras superiores e inferiorese assegurar que as cavidades são bem submerso no tampão. Lavar os poços com TBE 1x, utilizando uma pipeta ou uma seringa.
    6. Definir o aparelho para executar a 35 mA e pré-run durante 15 minutos antes de colocar as amostras.
  3. Eluição de ligado EC1 de 10% dPAGE
    1. Seguindo o passo 2.2.6, correr o gel a 35 mA até o corante de fundo (azul de bromofenol) atinge o fundo da placa de vidro. Isso deve demorar cerca de 1,5 horas. Desligue a alimentação e retire as placas do aparelho.
    2. Coloque as placas em algumas folhas de toalhas de papel e retire cuidadosamente os espaçadores das placas de vidro. Remova cuidadosamente a placa de vidro superior e enrole o gel com filme plástico.
    3. Virar o gel sobre para remover a segunda placa de vidro e cubra com filme plástico novamente. Tome cuidado para evitar rugas do filme plástico.
    4. Visualizar o produto ligado utilizando sombreamento de UV (260 nm), o que irá produzir 4 bandas de DNA distintas (EC1 totalmente ligado, DE1, BS1, e T1).
    5. Excise a banda superior (EC1) com uma lâmina de barbear estéril e transferir para um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga. Esmagar o gel com uma ponta de pipeta estéril (200 tamanho da ponta ul) até que ele se transforma em uma pasta fina. Adicionar 550 ul de tampão de eluição de ADN, cobrir o tubo com folha de alumínio para proteger o fluoróforo incorporado, e agitar durante 15 min.
    6. Centrifugar a solução de gel a 20000 xg durante 5 min e transferir cuidadosamente 400 ul do sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Evitar retirar pedaços de gel durante a pipetagem.
    7. Para o tubo de microcentrífuga com o sobrenadante transferido adicionar 40 uL de NaOAc 3 M (pH 5,2), e 1,0 ml de etanol frio a 100%. Misture a solução por agitação em vórtice e colocar o tubo num congelador a -20 ° C durante 30 min.
    8. Centrifuga-se o microcentrifuga a 20000 xg durante 20 min a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.
    9. Lava-se a pastilha com etanol frio a 70% e centrifuga-se novamente a 20000 xg durante 10 min a 4 ° C. Mais uma vez, remover osobrenadante e secar o sedimento sob vácuo durante 10 min.
    10. Determinar a concentração de EC1, medindo a absorvância de UV a 260 nm. Adicione um estoque de 10? M e armazenar a amostra a -20 ° C até à sua utilização.

3. Conjugação de urease para ADN

  1. Preparação de 4- (N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC) da
    1. Dissolve-se 1 mg de SMCC em 676 ul de DMSO. Vortex e colocar no gelo até o uso.
  2. Preparação de urease da
    1. Dissolve-se 1 mg de urease em 1 ml de 1 x PBS (sem Mg2 + ou Ca2 +). Colocar em gelo até à sua utilização.
      NOTA: cristalizado urease é lento para dissolver e mistura suave é necessária para evitar a desnaturação.
  3. Síntese de ADN em urease (UrDNA)
    1. Adicionar 10 uL de 100 uM LD1 para um tubo de microcentrífuga de 2,5 ml. Adicionar 140 uL de ddH2O, 40 ul de PBS 10x, e vortex.
    2. Adicionar 80,5 ul de SMCC stac, 159,5 ul de DMSO, vórtice, e centrifuga-se brevemente usando uma centrífuga de bancada.
    3. Incubar a 37 ° C durante 60 min. Evitar a condensação sob a tampa de microcentrífuga.
    4. Adicionar 200 ul de 1x PBS, 60 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2), e 1,5 ml de etanol frio a 100%. Misture a solução por vórtice e incubar à temperatura de -20 ° C durante 30 min.
    5. Centrifugar a solução a 20000 xg durante 20 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e o sedimento secar sob vácuo. Evitar o excesso de secagem.
    6. Para o sedimento seco adicionar 400 ul de estoque de urease e incubar à temperatura ambiente durante 5 h.
    7. Transferir 200 ul de conjugado em bruto a uma coluna de centrífuga de filtro pré-lavada 100K MWCO. Centrifugar a coluna a 14000 xg durante 5 min.
    8. Transferir os restantes 200 ul de conjugado em bruto para a coluna e centrifugar a 14000 xg durante 5 min. Remova a coluna e colocá-lo de cabeça para baixo em um novo tubo de 2.0 ml de microcentrífuga ( "tubo de coleta").
    9. CentrifUGE o tubo de recolha (com a coluna invertida) a 1000 xg durante 2 min. Remover o tubo de recolha e adicionar 30 ul de 1x PBS para a coluna centrífuga de lavar a membrana para recuperação adicional de conjugados.
    10. Mais uma vez inverter a coluna e colocar de volta para o tubo de recolha. Centrifuga-se o tubo de recolha (com a coluna invertida) a 1000 xg durante 2 min. Retirar e descartar a coluna.
    11. Armazenar o UrDNA a 4 ° C até à sua utilização.

4. Montagem de EC1 e UrDNA sobre esferas magnéticas

  1. Misturar o estoque esférulas magnéticas (MB) bem e transferir 100 ul de suspensão MB para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Colocar o tubo de microcentrífuga num suporte magnético cremalheira para isolar o MB.
  2. Remover o sobrenadante por pipetagem e adicionar 150 ul de tampão (BB) de ligação ao tubo. Remover o tubo do suporte e toque cuidadosamente o tubo para ressuspender o MB a uma solução homogénea. Evite espirrar a suspensão à top do tubo ou tampa. Se isso acontecer, use uma centrífuga de bancada para girar rapidamente o resíduo de volta para a suspensão.
  3. Repita o passo 4.2 mais duas vezes.
  4. A esta suspensão adiciona 10 ul de EC1 10? M. Misturar cuidadosamente tocando no tubo.
  5. Incubar a solução com agitação suave durante 30 min. Toque no tubo a cada 2-3 minutos, para evitar a precipitação do MB.
  6. Colocar o tubo de microcentrífuga para trás sobre a grelha magnética para isolar o MB e remover o sobrenadante por pipetagem. Lava-se a MB três vezes com 150 ul de BB (tal como descrito no passo 4.2).
  7. Uma vez que a lavagem estar completa, a suspensão MB em um total de 150 ul de BB. A esta solução, adicionar 15 ul de UrDNA e aquecer a solução a 45 ° C durante 2 min. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente e incubar durante 2 horas.
  8. Colocar o tubo de microcentrífuga para trás sobre a grelha magnética para isolar o MB e remover o sobrenadante por pipetagem.
  9. Adicionar 100 ul de tampão de reacção (RB). Retirar tele microcentrífuga tubo do rack magnético e ressuspender cuidadosamente o MB.
  10. Lave os MB mais três vezes repetindo o passo 4.9.
    NOTA: O sobrenadante lavada pode ser rapidamente testado para determinar se não hibridada UrDNA ainda está presente, que pode resultar em um sinal falso positivo. O teste pode ser feito por adição de 10 ul de ureia 50 mM e 10 uL de 0,04% de vermelho de fenol na solução de lavagem. Continuar a lavagem do MB até que a solução de lavagem não causar uma mudança de cor. A suspensão de 100 ul é armazenado a 4 ° C até à sua utilização.

5. Preparação de células bacterianas 20

  1. A cultura E. coli de Stocks
    1. Placa E. coli K12 (MG1655) em LB placas de agar de um estoque de glicerol sob uma chama ou em uma cabine de segurança biológica.
    2. Usando uma ponta de pipeta estéril, gentilmente tocar o estoque de glicerol e levemente raia a superfície de uma placa de agar para evitar a perfuração do ágar LB.
    3. Inverta os listradosplaca e incubar a 37 ° C durante 14 h.
    4. Selar a placa com parafilme e armazenar a 4 ° C durante um máximo de 3 semanas.
  2. A cultura E. coli para contagem celular
    1. Num tubo de cultura de 14 mL estéril, preparar 2 ml de caldo LB.
    2. Utilizando uma ponta de pipeta estéril, escolher uma única colónia da placa de agar estrias preparado no passo 5.1 e transferi-lo para o tubo de cultura.
    3. Incubar a cultura a 37 ° C e agitar a 230 rpm durante 14 horas.
    4. Serialmente dilua a cultura bacteriana, em intervalos de 10 vezes.
    5. Para cada amostra diluída, placa uniformemente cinco alíquotas de 100 ul em placas de agar LB separadas. Inverter as placas e incuba-se a 37 ° C durante 14 h.
    6. Contar as células de cada amostra para obter a concentração de células médio de cada diluição.
      NOTA: 10 7 células são muitas vezes utilizados para configurar um teste de referência para E. coli como este nível de E. coli pode desencadear uma cor rápida change. No entanto, um teste executado adequadamente pode detectar tão baixo quanto 500 células, como discutido na secção Resultados.
  3. Preparando E. As células de E. coli for Testing
    1. Para obter uma suspensão de células desejada, transferir 1 ml da cultura estoque para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Centrifugar as células a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
    3. Adicionar 10 ul de tampão de reacção para a pelete de células e ressuspender as células. Sonicar a suspensão de células durante 5 min. Transferir a suspensão de células para uma caixa de gelo durante 5 min.
    4. Sonicar a suspensão de células durante mais 5 min.
    5. Centrifugar a suspensão de células a 13.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Utilizar o sobrenadante para o ensaio (10 ul).

6. Teste Litmus

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, pré-lavagem do tubo por adição de vortex e 100 ul de tampão de reacção (RB) no tubo de microcentrifuga edescartando o tampão.
  2. Transferência de 15 ul de EC1 montados (protocolo 4) para o tubo de microcentrífuga lavada.
  3. Lavam-se as esferas magnéticas, colocando o tubo de microcentrífuga em uma cremalheira magnética. Remover o sobrenadante por pipetagem. Retire o tubo de microcentrífuga do rack, adicione 100 ml de RB, e ressuspender cuidadosamente as esferas magnéticas.
  4. Lave os MB mais duas vezes repetindo o passo 6.3.
  5. Colocar o tubo de microcentrífuga para trás sobre a grelha magnética, remover o sobrenadante e adicionar 10 uL da E. coli amostra preparada a partir do passo 5.3.
  6. Misturar a amostra e magnéticos pérolas cuidadosamente batendo suavemente no tubo de microcentrífuga.
  7. Incubar a reacção a temperatura ambiente durante 1 h.
  8. Para a reacção, adicionar 90 uL de ddH2O e coloque o tubo de microcentrífuga para um rack magnético.
  9. Após cerca de 3 minutos de separação magnética, transferir cuidadosamente a 85 ul de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Retirar o sobrenadante lentamente aevitar a coleta de quaisquer esferas magnéticas.
  10. Para o tubo de microcentrífuga de cima adicionar 15 ul de 0,04% de vermelho de fenol e 100 ul de solução de substrato.
  11. Tirar uma fotografia em intervalos de tempo específicos para registrar a mudança de cor.
    NOTA: A mudança no pH também pode ser monitorado usando um medidor de pH com um microeletrodo. O pH de partida deverá ser de aproximadamente 5,2-5,5 (a solução é amarelo). Se não, a solução pode ser ajustado pela adição de Tampão Acetato de 1 mM, pH 5,0).

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Resultados

O princípio do teste decisivo bacteriana é explicado na Figura 1 O ensaio utiliza três materiais principais:. Uma ADNzima de clivagem de ARN que é activado por uma bactéria específica, urease e esferas magnéticas. A ADNzima é utilizado como o elemento de reconhecimento molecular para alcançar a detecção altamente específica de uma bactéria de interesse. A urease e esferas magnéticas são usados ​​para alcançar transdução de sinal da actividade ARN-clivagem da ADNzima. Ist...

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Discussão

A tradução da acção da actividade de clivagem de ARN de uma ADNzima bactéria responde a um teste decisivo é tornada possível através da utilização de urease e separação magnética, como ilustrado pela Figura 1. Embora a manifestação do teste decisivo modificado para detecção de bactérias é feito com uma E. coli dependente de RNA-clivagem ADNzima, 5,19,20 o projeto pode ser estendido geralmente para qualquer ADNzima de clivagem de RNA. Dada a grande disponibilidade de DNAzymes de cliva...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O financiamento para este projeto de pesquisa foi fornecido pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) por meio de uma Bolsa de Descoberta para YL.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)VWR AMRESCO0105
Pellets de hidróxido de sódio (NaOH)BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
Ácido bóricoAMRESCO0588
UreiaVWR AMRESCOM123
Solução de acrilamida/bisacrilamida a 40% (29:1)BIO BASIC CANADA INC.A0007
SucroseBioshop Canadá inc.SUC507
Azul de bromofenolBioshop Canada inc.BRO777
xilenecyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% de dodecil sulfato de sódioBioshop Canada inc.SDS001
Ácido clorídrico (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Cloreto de sódio (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Cloreto de magnésio (II) hexahidratadoVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adenosina Trifospahte (ATP)AMRESCO0220
Acetato de Sódio trihidratado (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
EtanolÁlcoois ComerciaisP016EAAN
Tetrametilenoetilenodiamina (TEMED)AMRESCO0761
10% de persulfato de amônio (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimetilsulfóxido (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04% de vermelho de fenolSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 tampão de reação de polinucleotídeo quinaseLucigen30061-1
10x T4 tampão de reação de DNA ligase T4Basics CanadaB1122-B
T4 DNA ligase (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) CaldoAMRESCOJ106
ÁgarAMRESCOJ637
T4 polinucleotídeo quinase (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrífugaBeckman Coulter, Inc.
Placas de vidroCBS scientificngp-250nr
espaçadores de 0,75 mm de espessuraCBS scientificVGS-0725r
pente de 12 poçosCBS scientificVGC-7512
Lâmpada UVUVP95-0017-09
Espectrofotômetro (NanoVue)GE HealthcareN / A
Placa de metalCBS scientificCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Aparelho de eletroforese em gelCBS scientificASG-250
Placas de PetriVWR International25384-342
100 kDa MWCO filtros centrífugosEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Rack de Separação MagnéticaNew England BioLabsS1506S
Tubos de microfugaSarstedt72.69
Filtro de seringa (0.22 μ m)VWR International28145-501
Tubo de cultura de 14 mlVWR International60818-725
Incubadora de cultura de célulasEppendorf ScientificM13520000
Branson Limpador ultrassónicoBransonN/A
Camera (Canon Powershot G11)CanonN/A
Tubo cónico de 50 mlVWR International89004-364
Bio 392187

Referências

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