Descrevemos um protocolo para detecção colorimétrica de E. coli usando um teste decisivo modificado que aproveita uma DNAzima, urease e esferas magnéticas de clivagem de RNA.
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Artigo de método
Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Há uma demanda crescente por métodos simples, mas ainda eficazes, que possam ser usados para detectar patógenos específicos para aplicações no local de atendimento ou em campo. Esses métodos precisam ser fáceis de usar e produzir resultados confiáveis que possam ser facilmente interpretados por especialistas e não profissionais. O teste decisivo para pH é simples, rápido e eficaz, pois relata o pH de uma amostra de teste por meio de uma simples mudança de cor. Desenvolvemos uma abordagem para aproveitar o teste decisivo para detecção bacteriana. O método explora uma DNAzyme de clivagem de RNA específica da bactéria para realizar duas funções: reconhecer uma bactéria de interesse e fornecer um mecanismo para controlar a atividade da urease. Através do uso de esferas magnéticas imobilizadas com um conjugado DNAzyme-urease, a presença de bactérias em uma amostra de teste é transmitida para a liberação da urease das esferas para a solução. A urease liberada é transferida para uma solução de teste para hidrolisar a ureia em amônia, resultando em um aumento de pH que pode ser visualizado usando o teste decisivo clássico.
Introdução
Os patógenos bacterianos são uma das principais causas de morbidade e mortalidade global. Surtos de infecções hospitalares, patógenos transmitidos por alimentos e contaminantes bacterianos no meio ambiente representam ameaças sérias e contínuas à saúde e segurança públicas. Para prevenir esses surtos, são necessárias ferramentas eficazes que permitam a detecção de patógenos em tempo hábil em uma variedade de configurações. Testes simples, mas ainda eficazes, portáteis e econômicos, são muito cobiçados, especialmente em regiões suscetíveis a surtos, mas que não podem pagar por instalações de teste caras. 1-3 Embora exista uma infinidade de métodos para detec....
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Protocolo
1. Preparação de Reagentes e Buffers
- Ácido m-0,5 etilenodiaminotetracético (EDTA)
- Numa proveta de 2 litros, adicionar 186,1 g de EDTA em 800 ml de água desionizada-destilada (ddH2O). Ajustar o pH da solução a 8,0 usando peletes de NaOH. Adicionar ddH2O para um volume final de 1,0 L e transferir a solução para um frasco de vidro autoclavável para esterilização em autoclave e armazenar a 4 ° C.
- EDTA 10 × tampão Tris-borato (10x TBE)
- Em um copo de plástico de 4 L, adicionar 432 g de base Tris, 200 g de ácido bórico, 80 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0) e ddH2O para um volume final de 4 L. mis....
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Resultados
O princípio do teste decisivo bacteriana é explicado na Figura 1 O ensaio utiliza três materiais principais:. Uma ADNzima de clivagem de ARN que é activado por uma bactéria específica, urease e esferas magnéticas. A ADNzima é utilizado como o elemento de reconhecimento molecular para alcançar a detecção altamente específica de uma bactéria de interesse. A urease e esferas magnéticas são usados para alcançar transdução de sinal da actividade ARN-clivagem da ADNzima. Ist.......
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Discussão
A tradução da acção da actividade de clivagem de ARN de uma ADNzima bactéria responde a um teste decisivo é tornada possível através da utilização de urease e separação magnética, como ilustrado pela Figura 1. Embora a manifestação do teste decisivo modificado para detecção de bactérias é feito com uma E. coli dependente de RNA-clivagem ADNzima, 5,19,20 o projeto pode ser estendido geralmente para qualquer ADNzima de clivagem de RNA. Dada a grande disponibilidade de DNAzymes de cliva.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O financiamento para este projeto de pesquisa foi fornecido pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) por meio de uma Bolsa de Descoberta para YL.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
| Pellets de hidróxido de sódio (NaOH) | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
| Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
| Ácido bórico | AMRESCO | 0588 | |
| Ureia | VWR AMRESCO | M123 | |
| Solução de acrilamida/bisacrilamida a 40% (29:1) | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
| Sucrose | Bioshop Canadá inc. | SUC507 | |
| Azul de bromofenol | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
| xilenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
| 10% de dodecil sulfato de sódio | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
| Ácido clorídrico (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
| Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
| Cloreto de magnésio (II) hexahidratado | VWR AMRESCO | 0288 | |
| Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
| Adenosina Trifospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
| Acetato de Sódio trihidratado (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
| Etanol | Álcoois Comerciais | P016EAAN | |
| Tetrametilenoetilenodiamina (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
| 10% de persulfato de amônio (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
| Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
| Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
| 1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
| 0,04% de vermelho de fenol | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
| 10x T4 tampão de reação de polinucleotídeo quinase | Lucigen | 30061-1 | |
| 10x T4 tampão de reação de DNA ligase T4 | Basics Canada | B1122-B | |
| T4 DNA ligase (5 U/μ l) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
| Luria Bertani (LB) Caldo | AMRESCO | J106 | |
| Ágar | AMRESCO | J637 | |
| T4 polinucleotídeo quinase (10 U/μ l) | Lucigen | 30061-1 | |
| E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
| Centrífuga | Beckman Coulter, Inc. | ||
| Placas de vidro | CBS scientific | ngp-250nr | |
| espaçadores de 0,75 mm de espessura | CBS scientific | VGS-0725r | |
| pente de 12 poços | CBS scientific | VGC-7512 | |
| Lâmpada UV | UVP | 95-0017-09 | |
| Espectrofotômetro (NanoVue) | GE Healthcare | N / A | |
| Placa de metal | CBS scientific | CPA165-250 | |
| Vortex | VWR International | 58816-123 | |
| Aparelho de eletroforese em gel | CBS scientific | ASG-250 | |
| Placas de Petri | VWR International | 25384-342 | |
| 100 kDa MWCO filtros centrífugos | EMD Millipore | UFC510024 | |
| Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
| Rack de Separação Magnética | New England BioLabs | S1506S | |
| Tubos de microfuga | Sarstedt | 72.69 | |
| Filtro de seringa (0.22 μ m) | VWR International | 28145-501 | |
| Tubo de cultura de 14 ml | VWR International | 60818-725 | |
| Incubadora de cultura de células | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
| Branson Limpador ultrassónico | Branson | N/A | |
| Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
| Tubo cónico de 50 ml | VWR International | 89004-364 |
Referências
- Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
- Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (20....
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Reimpressões e permissões
