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Artigo de método

Infecção experimental com

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⸱

DOI:

10.3791/54554

⸱

16 de novembro de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Resumo

L. monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva que é uma causa da doença de origem alimentar em humanos. A infecção experimental de ratinhos com este patogénio tem sido altamente informativos sobre o papel das células do sistema imune inata e adaptativa e citocinas específicas na imunidade do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares. Produção de IFN-γ por células inatas durante a infecção com L. monocytogenes subletal é importante para a activação de macrófagos e de controlo no início do patógeno 1-3. Além disso, a produção de IFN-γ por linfócitos memória adaptativa é importante para aprontar a activação de células inatas sobre reinfecção 4. A L. monocytogenes modelo de infecção, portanto, serve como uma grande ferramenta para investigar se novas terapias que são projetados para aumentar a produção de IFN-γ ter um impacto sobre respostas de IFN-γ in vivo e têm efeitos biológicos produtivos, tais como aumento da depuração bacteriana ou melhorar a sobrevivência do mouse a partir deinfecção. Aqui descrito é um protocolo de base para a forma de realizar infecções intraperitoneais de murganhos C57BL / 6J com a estirpe de L. monocytogenes EGD e para medir a produção de IFN-γ pelas células NK, células NKT, e adaptativas linfócitos por citometria de fluxo. Além disso, os procedimentos são descritos em: (1) crescimento e preparar as bactérias para inoculação, (2) medir a carga bacteriana no baço e no fígado, e (3) medida a sobrevivência dos animais a pontos finais. Os dados representativos são também fornecidos para ilustrar a forma como este modelo de infecção pode ser utilizado para testar o efeito de agentes específicos nas respostas de IFN-gama para L. monocytogenes e sobrevivência dos ratinhos com esta infecção.

Introdução

IFN-γ é uma citocina que é crucial para mediar a imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares e para controlar o crescimento do tumor 5. A importância desta citocina na resistência bacteriana é evidente na observação de que os seres humanos com mutações na via de sinalização de IFN-γ são altamente susceptíveis à infecção com micobactérias e salmonelas 6. De modo semelhante, os ratinhos deficientes em IFN-γ ou os defeitos exibem receptor de IFN-γ na resistência à micobactérias 7-9 e outros patogénios intracelulares, incluindo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, 13 Salmonella typhimurium, e certos vírus 11. Em adição aos agentes patogénicos que combatem, IFN-γ desempenha um papel fundamental na defesa contra hospedeiro-14 tumores. Embora uma maior produção de IFN-γ é benéfica no contexto da infecção ou cancro, a produção prolongada desta citocina tem sido associada to o desenvolvimento de auto-imunidade sistémica 15-17 e a aceleração da diabetes do tipo I no modelo de ratinho diabético não obeso 18.

As principais fontes de IFN-γ incluem células NK, células NKT, γδ células T, células T auxiliares 1 (Th1), e linfócitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto a imunidade inata e adaptativa por: (1) para cima de regulação de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e expressão II, (2) aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias em células que apresentam antigénios, (3) de macrófagos aumentando factores de fagocitose e a produção de citocinas pró-inflamatórias e microbicidas (por exemplo, óxido nítrico e espécies reactivas de oxigénio), (4) promover a diferenciação de células T CD4 + naive em células efectoras Th1, (5) promover a troca de classe de anticorpo para a imunoglobulina ( Ig) 2a e IgG3 (no rato), (6) indução da produção de quimiocinas para recrutar células imunes para os locais de Infection, e (7) o aumento de células NK e respostas CTL 5,19. Dada a importância crucial de IFN-γ na resposta do hospedeiro a infecções e tumores, recombinante IFN-γ foi testado como um tratamento para várias infecções e doenças malignas (revisto em 19). No entanto, porque a administração sistémica de IFN-γ ou promover a citoquina Th1 interleucina-12 (IL-12) está associada a efeitos colaterais e toxicidade relacionada com a dose 19,21, há interesse no desenvolvimento de estratégias alternativas para aumentar a produção de IFN-γ pela células do sistema imunológico. O desenvolvimento de novos produtos biológicos e moléculas pequenas requer em ferramentas de rastreio in vivo para testar se tais agentes de aumento da produção de IFN-γ durante uma resposta imune e se isto traduz-se efeitos biológicos significativos, tais como aumentos de sobrevivência do animal.

A infecção experimental de ratinhos com a bactéria L. monocytogenes gram-positiva tem sido um modelo para instrumentaldecifrar o papel do IFN-γ no hospedeiro-imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares 1,22. Infecção de camundongos com o patógeno por via intravenosa ou por via intraperitoneal (ip) leva à rápida disseminação da bactéria para o baço e fígado, onde eles se tornam internalizadas pelos macrófagos residentes e hepatócitos com cargas bacterianas pico no baço ocorrem entre 3 e 4 dias pós- infecção 1,3,22. Produção de IFN-γ por células NK é importante para a activação de macrófagos e resistência precoce contra o agente patogénico 3; No entanto, em doses infecciosas elevados, a produção de IFN-γ também pode ser prejudicial para a depuração de agentes patogénicos 23. As células NKT são também uma fonte de IFN-γ no baço e no fígado durante o controlo de início de patógenos 2,24 e essa produção foi mostrado para amplificar a produção de IFN-γ por outros tipos de células, incluindo células NK 2. Por outro lado, mais tarde, que actuam linfócitos T adaptativos, células T CD8 + em particular, são importantes para mediar a folga do patógeno ea protecção contra 1,4,22 re-infecção.

Este modelo de infecção tem sido atraente para os investigadores para uma série de razões (revisto em 1). Em primeiro lugar, a infecção com o agente patogénico é altamente reprodutível e induz uma forte resposta imunitária Th1 e celular. Em segundo lugar, durante a infecção subletal, carga bacteriana está concentrado no fígado e baço, onde ele pode ser facilmente medido. Em terceiro lugar, o agente patogénico pode ser manuseado com segurança sob condições de segurança biológica de nível 2 (BSL2). Em quarto lugar, o organismo e a resposta imune que gera têm sido extensivamente caracterizados. Finalmente, uma variedade de estirpes mutantes e geneticamente modificadas têm sido desenvolvidos que estão disponíveis para uso.

Descrito aqui é um protocolo básico para inoculação de camundongos C57BL / 6J com a estirpe EGD de L. monocytogenes 25 e para medir IFN - γ rerespos- por NK, NKT, e os linfócitos adaptativos pós-infecção. Também é descrito como para medir a carga bacteriana no baço e no fígado após a infecção subletal e para realizar estudos de sobrevivência após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico. Finalmente, os dados representativos são mostrados de como este protocolo pode ser utilizado para pesquisar o efeito de novos tratamentos sobre as respostas de IFN-y e sobrevivência do ratinho de infecção por L. monocytogenes.

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Protocolo

Declaração de segurança

Este protocolo descreve a infecção de ratinhos com L. monocytogenes vivo. O patógeno é tratado com segurança sob condições BSL2 por pessoal treinado que não estão imunocomprometidos. pessoas imunodeprimidas incluem mulheres grávidas, idosos e indivíduos que estão infectadas pelo HIV ou que tenham condições crônicas que necessitam de tratamento com terapia imunossupressora. O pessoal deve vestir um revestimento protetor laboratório ou vestido, luvas, máscara e proteção para os olhos ao manusear amostras infectadas. O trabalho aqui descrito foi realizado sob condições BSL2 abrigo de um certificado (# 32876) que foi emitido pela University Health Network (UHN) Biossegurança escritório. Carcaças de camundongos infectados ou quaisquer tecidos não utilizados foram duplamente ensacados e eliminados de resíduos de risco biológico. Gaiolas de camundongos infectados também foram descontaminados em autoclave.

Declaração de ética

Os ratos foram mantidos e infectados em um quarasala de ntine dentro de instalações para animais UHN e foram tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Canadian Council on Animal Care. Todos os procedimentos em ratos foram realizadas sob uso de animais protocolo número 3214 que foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais UHN. Devido a considerações éticas, a morte não foi utilizada como um ponto final para estudos de sobrevivência. A dose LD 50 modificado descrito aqui para L. monocytogenes infecção foi determinada como sendo a dose para a qual 50% dos ratos alcançado parâmetros específicos, que consistia em uma perda de 20% no peso do corpo ou que mostra, pelo menos, dois dos seguintes sinais clínicos: letargia, pele arrepiou, postura arqueada, dificuldade para respirar, olhos baços ou afundados. Os ratos foram sacrificados quando chegaram endpoints através de exposição ao dióxido de carbono (CO 2), de acordo com as diretrizes da instalação UHN.

1. Preparação de Stocks glicerol para armazenamento a longo prazo

NOTA: Este procedimento descreve como stocks de glicerol daEGD estirpe de L. monocytogenes são preparados a partir de um estoque de glicerol originais. Passos que têm o potencial de gerar aerossóis deve ser realizada dentro de uma cabine de segurança biológica certificada (BSC).

  1. Prepare placas de agar de infusão de cérebro e coração (BHI) para o crescimento bacteriano. Para este adicionar 3,8% (w / v) de caldo de BHI e 1,5% (w / v) de agar para bidestilada H2O (ddH2O). líquido autoclave. Uma vez que o ágar arrefecer para 50 ° C, distribuir líquido em placas de petri bacterianas (25 mL / prato) e deixou placas secas (descoberta) na BSC, durante 1 h.
    NOTA: Transferência de agar BHI em um banho de água a 50 ° C após a autoclavagem para evitar a solidificação antes do vazamento placas. Armazene placas BHI a 4 ° C de cabeça para baixo (com o lado da mídia em cima) até que esteja pronto para uso.
  2. Prepare a mídia de BHI líquido. Para isso, misturar 3,8% (w / v) de caldo BHI em ddH 2 O. autoclave.
  3. Remover estoque de glicerol congelados da estirpe L. monocytogenes EGD do congelamento -80 ° CR e descongelação até à temperatura ambiente.
  4. Mergulhe uma ponta de pipeta estéril no estoque de glicerol descongelados e imediatamente raia a ponta e para trás através de uma seção de uma placa BHI. Esta é a raia primário.
  5. Vire a placa de 90 ° C e utilizando uma nova ponta de pipeta, arraste através da primeira etapa e espalhá-lo para o próximo ¼ da placa (esta é a raia secundário). Repita mais uma vez para fazer a raia terciário.
  6. Ligue placa de cabeça para baixo e incubar a 37 ° C durante a noite. colónias uniformes individuais devem ser obtidos no último conjunto de estrias e visível entre 16 e 24 horas.
  7. Dispensar 10 ml de caldo BHI estéril em uma ventilada 50 tubo estéril ml. Escolha uma colônia de L. monocytogenes a partir da placa utilizando uma ponta de pipeta estéril e inocular o caldo. Incubar a cultura numa incubadora a 37 ° C com agitação orbital durante a noite ou até DO600 = 1,0 com configurações a 225 rotações por minuto (rpm).
    NOTA: O vidro ou pla descartávelbalões de Erlenmeyer de STIC pode também ser utilizado para cultura de bactérias. Independentemente do tipo de recipiente utilizado, certifique-se de que é estéril, ventilado e que o volume de cultura não exceda 20% do volume total do recipiente para garantir arejamento adequado das bactérias.
  8. Preparar stocks de glicerol estéril através da mistura de glicerol a 100% com a cultura bacteriana líquida durante a noite a uma razão de 1: 1. Distribua a mistura bacteriana / glicerol em 2 ml frascos criogênicos (500 mL / frasco) e frascos de transferência para -80 ° C congelador para armazenamento.
    NOTA: Os métodos de banco de grânulo pode também ser usado em lugar dos stocks de glicerol para armazenar bactérias. Por este método, microesferas porosas são inoculadas com uma cultura pura de L. monocytogenes e são armazenadas a -80 ° C. Cada grânulo pode ser utilizada para inocular uma cultura fresco conforme necessário. Veja a lista de materiais para mais informações.

2. Determinação da curva de crescimento de L. monocytogenes em Cultura Dia

NOTA: Este procedimento descreve como gerar a curva de crescimento de L. monocytogenes que é utilizado para estimar as unidades formadoras de colónias (CFU) para os estudos de infecção. Todos os passos que têm o potencial de gerar aerossóis deve ser realizada dentro de um BSC certificada.

  1. Tome 100? L de cultura durante a noite gerado no Passo 1,7-10 mL de meio BHI num tubo ventilado de 50 ml e crescer a 37 ° C numa incubadora com agitação (225 rpm, inclinada em ângulo de 45 °). Utilizar um tubo não inoculado como controlo.
  2. Aqui amostras de 0,5 ml da cultura em intervalos de hora em hora (1, 2, 3, 4, 5, 6 h, etc.). Dilui-se cada aliquota de 1: 1 (v / v) com meio BHI numa cuvete de plástico. Pipeta cima e para baixo para misturar. Medir a densidade óptica (OD) a 600 nm (OD600) usando um espectrómetro. Continuar a cultura de bactérias até DO600 = 1.
  3. Ao mesmo tempo, tomar uma amostra de 100 ul da cultura e diluiu-se com 900 ul de meios BHI numa esterilizado de 1,5 mL MICRocentrifuge tubo (esta é a diluição 10 -1). Centrifugar as bactérias a 6000 xg durante 5 min, e o sobrenadante aspirado.
  4. Lavar as bactérias duas vezes por ressuspensão do sedimento em 1 ml de meio BHI, a centrifugação durante 5 min a 6000 xg, e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 1 ml de mídia BHI. Prepara-se uma série de diluições de 10 vezes desta amostra em meio BHI (10 -2 a 10 -9). Espalhe 100 ul de cada diluente em placas de agar BHI separadas. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C em uma incubadora.
  5. No dia seguinte, escolher placas que têm entre 30-300 colônias. Descartar o resto. Contar as colónias sobre estas placas. A Tabela 1 mostra um exemplo de contagens obtidas na aliquota que foi feita quando DO600 = 0,84. Neste exemplo, uma das placas (isto é, 10 -6 diluição) tinham contagens de colónias entre 30-300 e foi utilizado para a CFU / ml cálculo.
    NOTA: Placas com maiorde 300 colônias não são utilizados, uma vez que a superlotação pode impedir o crescimento de bactérias e também torna difícil discernir e enumerar as colónias individuais. Placas com contagens <30 também não são usados, porque os pequenos erros na técnica de diluição ou à presença de contaminantes pode ter um grande impacto sobre a precisão das contagens na extremidade inferior do intervalo.
  6. Dividir o número de colónias por o volume plaqueadas e depois multiplicar pelo factor de diluição para obter o valor / ml CFU por uma diluição em particular. No exemplo na Tabela 1, a contagem na diluição de 10 foi -6 70. dividir este valor por 0,1 ml para obter o valor / ml CFU para a cultura diluída. Em seguida, multiplicar esse valor pelo factor de diluição (10 6) para se obter o valor / ml CFU da cultura não diluída (7,0 x 10 8).
  7. Traça-se a DO600 (eixo y) em função do tempo em horas (eixo do x) para identificar a fase logarítmica de crescimento de 26.
    NOTA: Este Curv crescimentoe fornece uma estimativa da CFU / ml de cultura dia quando cultivados a uma certa leitura OD. Escolha uma OD 600 de leitura que está na fase logarítmica de crescimento que pode ser utilizado como um alvo OD 600 para o cultivo de culturas dia. Estes dados podem ser agora utilizados para estimar o CFU em uma cultura de inoculo para a preparação (Processo 3).

3. Preparação do inóculo para a Infecção experimental com L. monocytogenes

NOTA: Este processo descreve a preparação do inoculo infeccioso a partir de uma cultura dia em que foi iniciada a partir de uma cultura durante a noite (preparado no Processo 2). Todos estes passos são realizados na BSC, a menos que indicado de outra forma.

  1. Calcular o número de CFU necessária para a infecção com base no número de ratinhos e desenho experimental do estudo. Adicionar um volume adequado de meios BHI para um balão de Erlenmeyer ou cultura em tubo ventilado estéril.
    NOTA: O UFC de bactérias prepared será dependente do tipo de experiência realizada. Para estudar NK e respostas de células NKT durante a infecção, cada rato é inoculado com 10 5 CFU de bactérias (Processo 6). Se estudar as respostas de células T à infecção ou adaptativas medindo a carga bacteriana, cada rato é inoculado com 2 x 10 4 CFU de bactérias (Processo 8). Se estudar a sobrevivência de endpoints, cada rato é inoculado com a dose LD 50 do patógeno (que é de 10 5 CFU para o sexo masculino e 1,5 x 10 5 CFU para o sexo feminino, consulte Procedimento 9).
  2. Inocular o tubo contendo meio BHI com 100? L de cultura durante a noite. Incubar a cultura numa incubadora a 37 ° C agitação orbital (225 rpm) até 600 OD de destino for atingido. Transferir o conteúdo da cultura para um tubo de centrífuga estéril.
  3. Centrífuga bactérias em um sedimento durante 5 min a 6000 x g utilizando uma centrífuga. Aspirar o sobrenadante utilizando um vácuo ligada a um balão de armadilha contendo lixívia.
  4. Lave o peletizado duas vezes com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS), a centrifugação (5 min a 6000 xg) em meio.
  5. Aspirar a segunda lavagem e dilui-se bactérias na concentração apropriada em PBS 1x para entregar o CFU de interesse para cada rato num volume de 200 ul.
    NOTA: É melhor utilizar uma fonte comercial de estéril 1x PBS para as bactérias de lavagem e para a preparação do inoculo, uma vez que material de vidro de laboratório pode introduzir contaminantes imunológicas, tais como lipopolissacáridos.

4. Infecção experimental de camundongos com L. monocytogenes

NOTA: Este procedimento descreve como para infectar ratos com o inóculo preparado no Procedimento 3 e como verificar a CFU entregues no inoculo. Manipulação de ratos e injeções são realizadas em um BSC.

  1. Encomendar um número suficiente de camundongos C57BL masculino ou feminino / 6J para a sua experiência. encomendar também camundongos para servir como controles não infectados.
  2. Permitir ratos paraaclimatizar durante uma semana antes da inoculação bacteriana.
    NOTA: Este é porque o estresse associado com o transporte dos animais pode desencadear um aumento transitório na produção de hormônios de estresse e linfopenia 27,28.
  3. No dia da inoculação, obter um peso corporal basal para cada rato e gravá-lo no caderno de anotações.
  4. No BSC, misturar a suspensão bacteriana para cima e para baixo usando uma pipeta esterilizada para assegurar que as bactérias estão uniformemente distribuídos e, em seguida, tomar-se 200 uL do inoculo para uma seringa de 1 ml de engenharia de segurança equipada com uma agulha 25 G.
  5. Injectar um rato ip com 200 ul de inoculo preparada (por exemplo, 10 5 CFU por infecção de células NK, Processo 6). Para este procedimento, Scruff camundongos com a mão menos dominante, agarrando a pele solta em volta dos ombros do rato. Depois de garantir que o mouse é bem contido, injetar o mouse no quadrante inferior do abdómen, imediatamente lateral à midline para evitar a bexiga.
  6. Descarte a agulha e seringa em um recipiente de risco biológico farelos.
  7. Repita os passos 4,3-4,6 até que todos os ratinhos são injectados. Realizar passos semelhantes com 1x PBS injetado ratos (controles não-infectados).
    NOTA: Uma vez que o UFC é uma estimativa baseada na curva de crescimento, também é uma boa prática para verificar o UFC real no inóculo. Por isso, se preparar 3 - 4 diluições diferentes de inoculo preparada (utilizando uma série de diluição de 10 vezes) que se espera irá resultar em colónias contáveis. Espalhe 100 ul de cada diluente numa placa de agar BHI e incuba-se durante a noite a 37 ° C. Contar as colónias e calcular os reais CFU / ml tal como descrito no Procedimento 2.

5. Preparação de L. monocytogenes mortas pelo calor de Estudos imunitário

NOTA: Todos os passos que têm o potencial de gerar aerossóis são realizadas dentro do BSC.

  1. Crescer cultura dia até OD 600 valores are chegou a essa estão dentro da fase logarítmica. Dispense cultura em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
  2. Incubar os tubos em um 70 ° C num banho de água durante 1 hora para matar as bactérias.
  3. Lavar as bactérias duas vezes com PBS 1x como nos Passos 3.3 e 3.4. Ressuspender em meio RPMI completo estéreis, contendo soro fetal de vitelo (FCS) (ver arquivo suplementar para uma receita) a uma concentração de 4 x 10 6 / ml. Aliquota bactérias mortas em frascos de 2 mL estéreis criogénicos e armazenar a -80 ° C.
  4. Confirmar a morte das bactérias por difusão 100 ul de preparação de bactérias mortas por calor em placas de agar de BHI e incubou-se durante a noite a 37 ° C.
    NOTA: Estas bactérias mortas pelo calor deve estar pronto para estimular linfócitos em cultura no Procedimento 8. Se houver colônias que crescem na placa de ágar BHI, repita procedimento de matar de calor.

6. Medição de respostas de IFN-gama por células NK e NKT durante a infecção

NOTA: Este procedimento descreve como medir as respostas de IFN-gama por células NK e NKT em ratinhos às 24 h após a infecção com 10 5 UFC de L. monocytogenes. Esta dose é utilizado porque induz fortes respostas de IFN-gama por células NK e NKT no baço 24. Realizar todas as etapas do BSC. Para ajudar a manter a viabilidade celular, manter as células em gelo, sempre que possível e usar tampões geladas.

  1. Inocular ratinhos, tal como descrito no Procedimento 4, com 10 5 CFU de L. monocytogenes. Ao mesmo tempo, injectar os ratinhos de controlo não infectados ip com um volume igual de PBS 1x.
  2. Euthanize ratos às 24 h após a inoculação por inalação de CO2 de acordo com as diretrizes institucionais.
  3. Deite-se cada rato em seu lado direito e molhar a pele com etanol 70% usando uma garrafa.
  4. Utilizando uma pinça assépticas ou estéreis e tesouras difíceis de corte, inciso a pele logo abaixo da parte inferior da caixa torácica.
  5. Spray para baixoa camada de músculo exposta com 70% de etanol. O baço deve ser visível debaixo da camada muscular (ponta de seta aberta na Figura 1).
  6. Utilizando uma pinça assépticas ou estéreis e uma tesoura fina, inciso a camada muscular para revelar o baço. Agarram delicadamente o baço com a pinça e usar uma tesoura fina para cortar o baço longe da envolvente do tecido conjuntivo.
  7. Coloque o baço em um tubo cônico de 15 ml contendo estéril 1x PBS.
  8. Half-encher os pratos de Petri com estéril 1x PBS. Dissociar o baço através de um coador de células de nylon de 70 uM para a placa de petri usando a extremidade plana de uma seringa estéril de 3 ml.
  9. Transferir a suspensão de esplenócitos em um tubo de 15 ml estéril limpo usando um estéril 10 ml pipeta sorológica.
  10. Centrifugar as amostras a 335 xg durante 10 min a 4 ° C.
  11. Aspirar o sobrenadante para um balão de armadilha contendo lixívia. Solte o pellet celular sacudindo o tubo com um dedo ou arrastando o tubo inferiorfrente e para trás ao longo de uma superfície ondulada (por exemplo, o fluxo de entrada de ar no BSC).
  12. Lisar glóbulos vermelhos por adição de 1,5 ml de cloreto de amónio-potássio-(ACK) tampão de lise (ver Suplementar Arquivo 1 para a receita) para cada baço. Após exactamente 1 min e 15 segundos, encher o tubo com 1x PBS para parar a lise celular.
  13. Centrifugar as células tal como descrito no passo 6.10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de células activadas por fluorescência (FACS) Buffer (1 x PBS estéril contendo 2% de FCS).
  14. Contar as células usando um hemocitômetro. Por isso, tomar duas alíquotas de suspensão de células para contagem. Adicionar 15 ul de cada suspensão de célula a um volume igual de azul de tripano (0,04%, feito por diluição de solução de azul de tripano a 0,4% em ddH2O). Carga de 15 ul de cada suspensão de célula azul / Tripano para dentro da câmara do hemocitómetro (ou seja, um na câmara de topo, uma câmara na parte inferior).
  15. Usando um microscópio, contar todas as células não-azuis emcinco grandes quadrados da grade central em cada uma das câmaras (Figura 2). Tome essa contagem e dividi-lo por 10 para obter o número de células em 10 6 / ml. No exemplo da Figura 2, a contagem de células é de 215 nos 5 quadrados; Portanto, a concentração de células é de 21,5 x 10 6 / ml. Calcular a média da concentração de células obtidos a partir das duas amostras.
  16. Semente 1 x 10 6 culas por po / mancha numa placa de 96 poços de fundo redondo para a coloração de citometria de fluxo. Certifique-se também semear células para imaculado e menos de fluorescência um controles (FMO). Ver fluxo recomendado citometria painel coloração na Tabela 2.
    NOTA: Para os passos seguintes, recomenda-se manter as células em gelo ou a 4 ° C e para proteger as células da luz com folha de fluorocromos quando estão presentes. Uma pipeta de canais múltiplos pode ser utilizado para dispensar líquidos de coloração em placas de 96 poços para acelerar o processamento. Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular quandoaspiração do sobrenadante a partir da placa centrifugada. A coloração pode também ser feito em tubos de FACS se a centrífuga não está equipada com adaptadores de placas. Todos os passos de centrifugação a partir deste ponto são realizadas em 456 xg durante 5 min a 4 ° C.
  17. Centrifugar a placa e, em seguida, lavar as células duas vezes com tampão FACS. Uma lavagem é realizado por adição de 200 uL de tampão de SCAF a cada poço, a placa de centrifugação, e em seguida, aspirar o sobrenadante.
  18. Efectuar o passo de bloqueio, adicionando 50 uL / ​​poço de tampão FACS contendo anti-ratinho de CD16 / CD32 (bloco Fc purificado) (0,5 ug). Incube as células a 4 ° C durante 15 min. Lave as células uma vez em PBS 1x, como descrito acima.
  19. Adicionam-se 100 ul de corante de viabilidade (corante de viabilidade fixável diluído 1: 1000 em 1X PBS) às células. Stain células a 4 ° C no escuro (no refrigerador) durante 30 min. Lavar as células duas vezes em tampão de SCAF, tal como descrito acima.
  20. Após uma segunda lavagem, adicionar 100 ul de anticorpos da superfície celular ou para tetrâmeros respectivos poços de acordo com tO painel de coloração descrito na Tabela 2. Stain células a 4 ° C no escuro (no refrigerador) durante 30 min. Neste momento, também adicionar anticorpos individuais para a coloração de controlos positivos e FMO.
    Observação: Em relação controlos positivos individuais, recomenda-se a utilização quer de esplenócitos que são corados com o fluorocromo várias versões do anticorpo CD4 ou esferas de compensação comerciais que são coradas com os anticorpos utilizados no painel. Antes de realizar este procedimento de coloração, todos os anticorpos FACS deve ser titulado em estudos de teste para determinar as concentrações ideais para coloração.
  21. Lavar as células duas vezes em tampão de SCAF, tal como descrito acima e, em seguida fixar as células por ressuspensão em 50 uL de paraformaldeído a 4% (da paraformaldeído 16% diluído em ddH2O) e incubando durante 10 minutos à temperatura ambiente. CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico e só deve ser tratado da coifa.
  22. Lave as células duas vezes in tampão FACS, centrifugar no meio. Ressuspender as células em tampão de SCAF. Continue a próxima etapa células ou guarde na geladeira protegido da luz por até três dias.
  23. centrifugar células, remover o sobrenadante e lavar as células duas vezes com 150 mL de tampão de lavagem 1X / permeabilização (Perm tampão / Wash), centrifugação no meio. O tampão de Perm / Wash é preparado a partir de um estoque de 10x por diluição de 1: 9 (v / v) em ddH 2 O.
  24. Após a segunda lavagem, ressuspender as células em 150 ul de tampão de Perm / Wash e incubar durante 15 min a 4 ° C no escuro.
  25. células Centrifugar novamente e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 50 ul de tampão 1x Perm / Wash contendo anti-IFN-γ e incubar durante 1 hora a 4 ° C no escuro.
  26. Lave as células duas vezes com tampão 1x Perm / Wash, centrifugação no meio. Ressuspender as células em 250 ul de tampão de SCAF e depois transferir células para tubos FACS.
  27. Avance para citometria de fluxo aquisição usando uma cytomet fluxoer que tem uma configuração de laser e filtro de conjunto apropriado para discriminar fluorocromos utilizados no painel de coloração descrito na Tabela 2 29. Colete pelo menos 200.000 eventos por amostra e 10.000 eventos para controles de compensação.
  28. Aplicar matriz de compensação e analisar dados usando o software de análise de citometria de fluxo 30.

7. Medição da carga bacteriana no baço e fígado no momento da infecção Peak

NOTA: Todos os passos são realizados dentro de um BSC, a menos que indicado de outra maneira.

  1. Inocular ratinhos ip com 2 x 10 4 CFU do agente patogénico utilizando os procedimentos descritos no Procedimento 4.
  2. No dia 3 após a infecção, preparar 1,5 ml estéreis tubos de microcentrífuga, cada um contendo 500 mL de gelo-frio estéril 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x e de 0,2 - 0,3 g de 1,5 - esferas de vidro estéreis lavado com ácido 2 mm. Pesar cada tubo.
    NOTA: Contas de vidro são lavadas com ácido por incubating em ácido acético a 10% num copo num agitador magnético durante 1 h. Estes grânulos são, então, extensivamente lavadas com ddH2O para remover o ácido, são secas ao ar, e a seguir autoclavadas antes da utilização.
  3. Euthanize ratos por exposição ao CO 2.
  4. Para dissecção dos órgãos, coloque o animal à sua volta em uma placa de dissecação e fixar os membros do mouse para a placa utilizando 25 g de agulhas. Desinfectar a pele molhando com etanol 70%.
  5. Usando estéreis tesoura de corte difíceis, fazer uma incisão mediana na pele desde a virilha até meados do peito e, em seguida, a partir de meados da virilha no sentido de cada joelho e de meados do peito em direção cada cotovelo. dissecar Blunt e refletir de volta a pele, prendendo-a aberta usando 25 g de agulhas.
  6. Desinfectar camada muscular humedecendo-a com 70% de etanol e, em seguida, utilizando uma tesoura fina estéreis fazer uma incisão na linha média na parede peritoneal. Agarre o processo xifóide com uma pinça. Em seguida, usando as mesmas tesouras finas, fazer cortes na parede peritoneal do proce xifóideSS lateralmente em cada lado, na sequência da caixa torácica, logo abaixo do diafragma para revelar o fígado.
  7. Corte um pedaço mg ~ 100 do fígado (use o mesmo lobo para todos os ratos), utilizando uma tesoura esterilizada e coloque-o em um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga pré-pesado.
  8. Use uma pinça para empurrar suavemente de lado os órgãos no lado esquerdo da cavidade peritoneal para visualizar o baço. Agarram delicadamente o baço com um par de fórceps e liberá-lo a partir da cavidade peritoneal com a retirada do tecido conjuntivo circundante.
  9. Colocar o baço no tubo pré-pesado de microcentrífuga de 1,5 ml contendo grânulos. Transporte tecidos até ao laboratório em um recipiente contendo gelo à prova de vazamentos. Re-pesar os tubos que contêm os órgãos para determinar os pesos dos tecidos em mg.
  10. Homogeneizar os tecidos por agitação dos tubos utilizando um moinho de esferas homogeneizador durante 3 minutos a uma frequência de 30 Hertz.
    NOTA: O método de moinho de esferas é o preferido para a homogeneização, uma vez que é favorável para procescante um grande número de amostras e cria menos confusão e potencial exposição ao agente patogénico. No entanto, homogeneizadores automáticas ou autoclavada 2 ml homogeneizadores de tecido manual de vidro poderiam ser utilizadas como uma alternativa.
  11. Prepara-se uma série de diluições de 10 vezes dos homogeneizados em 0,1% Triton-X-100 em PBS 1x, variando a partir de (variando de não diluído a 10 -7).
  12. Espalhe 100 uL de cada homogenato diluído numa placa de agar BHI (em duplicado) utilizando um espalhador estéril. Transferência de placas para uma incubadora a 37 ° C e incubar durante a noite.
  13. Mantenha as placas que contêm entre 30 e 300 colónias / placa, descartar o resto. Contagem das colónias em cada placa e determinar o número médio de colónias em duplicado para barrar.
  14. Calcule o UFC / mg de acordo com a seguinte equação:
    CFU / mg = CFU / ml no homogenato, multiplicado pelas ml de homogenato preparado, dividido pelo peso mg de tecido homogeneizado.
    NOTA: Por exemplo, se uma média de 30 colonies foram contadas após o plaqueamento 100 ul de 10 -2 homogenato diluído preparado a partir de um pedaço de 120 mg de fígado que foi homogeneizada em 0,5 ml, os cálculos seriam como se segue:
    (Factor de diluição) / ml = 30 colónias x 100 CFU / 0,1 ml (volume de propagação) = 30,000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30,000 CFU / ml x 0,5 ml de homogenato / 120 mg de tecido = 125 CFU / mg.

8. Efeitos de L. monocytogenes em respostas de IFN-gama por linfócitos T CD4 + e CD8 +

NOTA: Este procedimento descreve como para medir a produção de IFN-γ por esplénica CD4 + e células efectoras CD8 + colhidas na altura do pico da resposta adaptativa imune (~ 7 d pós-infecção), utilizando dois métodos: (1) o fluxo de citometria para medir IFN-gama por linfócitos T CD4 + e CD8 + através de coloração de citocinas intracelulares, e (2) ELISA para medir os níveis totais de IFN-γ produzidos por esplenócitos (inclui todas as células T). procedimentossão realizadas dentro do BSC.

  1. Infect ratos por injecção IP com 2 x 10 4 CFU do agente patogénico utilizando os procedimentos descritos no Procedimento 4.
  2. No dia 7 após a infecção, eutanásia ratos por inalação de CO2 de acordo com as diretrizes institucionais.
  3. Dissecar do baço (como descrito acima) e colocar num tubo cónico de 15 ml contendo estéril 1x PBS. Transportar os tubos para o laboratório num recipiente contendo gelo à prova de fugas.
  4. Processar os baços numa suspensão de células individuais, lisar as células vermelhas do sangue, tal como descrito na secção 6, e, em seguida, ressuspender as células em meio RPMI completo contendo 10% de FCS. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
  5. Configurar culturas para medição de respostas IFN-y. Para esta células de dispensa (4 x 10 6 em 1 ml / poço) em placas de 24 poços em conjunto com e igual número (4 x 10 6 ou 1 ml / poço) de L. monocytogenes mortas pelo calor descongeladas (preparada no Procedimento 5) . Transferência de células a um 37° C incubadora.
  6. Após 20 horas de incubação, adicionar 0,66 ul / ml de inibidor de transporte de proteínas aos poços e as incubações continuam.
  7. Quatro horas mais tarde, a placa de transferência BSC e recolher 500 uL de sobrenadante de cultura e de congelação (-80 ° C) durante a medição depois de os níveis de IFN-gama usando um estojo de ensaio de imunossorvente ligado a enzima comercial (ELISA) 31. Em seguida recolher células para um tubo estéril de 15 ml. Lave os poços com PBS 1x e piscina esta lavagem juntamente com células coletadas.
  8. Realizar a coloração da superfície celular e coloração intracelular para o IFN-γ em CD4 + e CD8 +, tal como descrito no Procedimento 6, excepto usar o painel de coloração descrito na Tabela 3. Avance para o citômetro de fluxo de aquisição (coleta de 200.000 eventos / amostra) e analisar dados de 29 usando citometria de fluxo de software de análise 30.

9. Medir mouse Sobrevivência para Endpoints depois de L. monocytogenes Infecção

NOTA: Este processo descreve o efeito de um agente de sobrevivência do ratinho para pontos finais após a infecção com o LD 50 a dose modificada do agente patogénico. Todos estes procedimentos são realizados no BSC na instalação para animais.

  1. Injectar ratinhos ip com o LD 50 a dose modificada de L. monocytogenes como descrito no Processo 4. Esta foi determinada para ser de 10 5 UFC (para o sexo masculino) ou 1,5 x 10 5 CFU (por fêmea) 31.
  2. Siga ratos duas vezes por dia para os sinais clínicos e registrar estes sinais e peso corporal dos animais em um caderno de anotações. Euthanize ratos se eles mostram uma perda de 20% no peso corporal ou dois sinais clínicos de listeriose (letargia, pele arrepiou, postura curvada, dificuldade para respirar, olhos baços ou afundados).
  3. Após 14 dias, os ratinhos sobreviventes eutanásia por meio de inalação de CO 2.
  4. Prepare gráficos de Kaplan-Meier dos dados traçando a sobrevivência por cento de cada grupo contra o tempo 32.
    NOTA: Se os ratos sucumbem a infecções (atender parâmetros descritos na Declaração de Ética), isso geralmente ocorre durante o dia 5 pós-infecção (Figura 7).

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Resultados

A Figura 3 apresenta algum fluxo típico citometria de coloração de IFN-γ em células NK e NKT esplénicas às 24 h pós-infecção com 10 5 CFU de o agente patogénico. Esta figura também ilustra a estratégia de propagação para o painel de coloração descrito na Tabela 2. A Figura 4 mostra alguns dados representativos que foram obtidos numa experiência em que ratos machos foram tratados com o antagonista de PPAR? IS001 ou veículo de c...

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Discussão

Descrevemos aqui um protocolo de como levar a cabo uma infecção experimental de base com a estirpe de L. monocytogenes EGD de 25 em camundongos C57BL / 6J machos ou fêmeas. Este protocolo foi criado com a finalidade de estudar o efeito de uma molécula pequena novela IS001 sobre a produção de IFN-γ por linfócitos inata e adaptativa in vivo 31. Ao monitorar depuração bacteriana e sobrevivência pós-infecção, percepções foram obtidas em como essas mudanças em IFN-γ comprometido a capa...

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Divulgações

Sem conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado por uma subvenção operacional do CIHR (MOP97807) ao SED.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caldo de Infusão Brain Heart, BD Modificado299070qualquer marca deve ser apropriada
AgarBD214010qualquer marca deve ser apropriada
Triton X-100Sigma-AldrichX100qualquer marca deve ser apropriada
1x PBSSigmaD8537qualquer marca deve ser apropriada
TissueLyser IIQiagen85300qualquer marca deve ser apropriada
Cloreto de amônio (NH3Cl)qualquer marca deve ser apropriada
KHCO3qualquer marca deve ser apropriada
Na2EDTAqualquer marca deve ser apropriada
RPMI 1640Gibco22400089qualquer marca deve ser apropriada
Soro Fetal BovinoGibco12483Antes de usar, inative o calor a 56 &graus; C por 30 min
L-glutaminaGibco25030qualquer marca deve ser apropriada
Aminoácidos não essenciaisGibco11140qualquer marca deve ser apropriada
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140qualquer marca deve ser apropriada
Inibidor de Transporte de Proteína GolgiStop (contendo Monensina)BD554724Use 4 μ l em cultura de células de 6 ml
16% ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Ciências15710Diluir a 4% PFA em ddH2O ou 1x PBS
10x Tampão Perm/WashBD554723Diluir 1x em ddH2O
Bloco Fc, Anti-Mouse CD16/CD32 PurificadoeBioscience14-0161Diluir 1:50
Corante de Viabilidade Fixável eFluor 506eBioscience65-0866Diluir 1:1.000 (também usamos corantes de viabilidade de sondas moleculares)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041O fabricante recomenda um determinado tamanho de teste; no entanto, isso deve ser ajustado antes do uso.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081O fabricante recomenda um determinado tamanho de teste; no entanto, este deve ser ajustado antes do uso.
PBS57/mCD1d tetrâmero-APCNIH Tetramer Core FacilityN/AObtido como presente da instalação
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961O fabricante recomenda um determinado tamanho de teste; no entanto, este deve ser titulado antes do uso.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351O fabricante recomenda um determinado tamanho de teste; no entanto, isso deve ser ajustado antes do uso.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)eBioscience25-0451O fabricante recomenda um determinado tamanho de teste; no entanto, este deve ser titulado antes do uso.
anti-Mouse IFN gama-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311O fabricante recomenda um determinado tamanho de teste; no entanto, isso deve ser ajustado antes do uso.
OneComp eBeadseBioscience01-1111Use uma gota por mancha
Kit ELISA de gama IFN de camundongoeBioscience88-7314Usado para medir o interferon gama no sobrenadante
cultura Tubos ventilados de 50 ml para culturaUsado para cultura da bactéria, qualquer marca deve ser apropriada
Tubosqualquer marca deve ser apropriada
de Petri bacterianasqualquer marca deve ser apropriada
2 ml ciroviaisqualquer marca deve ser apropriada
Espectrômetroqualquer marca deve ser apropriada
agulhasqualquer marca deve ser apropriada
C57BL/6JJackson laboratoriesEstoque#000664Pedido para chegada às 7 semanas
AlvejantePara descontaminação
70% EtanolPara descontaminação
Contas dede qualquer marca deve ser apropriada
Rotor de, baldes, tampas de balde.
Microcentrífugaqualquer marca deve ser apropriada
Glicerolqualquer marca deve ser apropriada
Pontas dequalquer marca deve ser apropriada
Pipetaqualquer marca deve ser apropriada
Instrumentosqualquer marca deve ser apropriada
70 mícrons filtrosqualquer marca deve ser apropriada
Seringaqualquer marca deve ser apropriada
Pipeta qualquermarca deve ser apropriada
Unidadesqualquer marca deve ser apropriada
Azulde Tripano Diluir 1 a 9 em ddH2O, qualquer marca deve ser apropriada
Hemocitômetroqualquer marca deve ser apropriada
de fundo redondoqualquer marca deve ser apropriada
Tubos FACsFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDQualquer citômetro de fluxo pode ser usado para aquisição que tenha uma configuração de laser apropriada e conjunto de filtros para discriminar os fluorocormes
Flowjo softwareTreestarUtilizado para análise de dados. Outros tipos de software de análise de dados também serão apropriados
Pipetador multicanal (0 - 300 µ l)EppendorfUsado para lavar células e adicionar anticorpos durante a coloração por citometria de fluxo
ÁcidoUsado para lavar contas de vidro, qualquer marca deve ser apropriada
Sistema de Preservação Bacteriana do MicrobancoDiagnóstico Pro-labUsado como uma alternativa aos estoques de glicerol para armazenamento de bactérias a longo prazo
de de microcentrífuga de 1,5 ml placas UV de engenharia de segurança vidro centrífuga estéril pipeta cirúrgicos de 3 ml de Filtração Placas acético

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