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Artigo de método

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

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DOI:

10.3791/54568

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5 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um método para medir a velocidade dos fagossomos que se movem em direção ao centro celular em células vivas infectadas com ou sem o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tipo 1, usando microscopia de fluorescência confocal de disco giratório para identificar células infectadas fluorescentes e microscopia de campo claro para detectar fagossomos.

Resumo

Os macrófagos são células fagocíticas que desempenham um papel importante na encruzilhada entre a imunidade inata e a específica. Eles podem ser infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1 e, devido à sua resistência aos seus efeitos citopáticos, podem ser considerados reservatórios virais persistentes. Além disso, os macrófagos infectados pelo HIV exibem funções defeituosas que contribuem para o desenvolvimento de doenças oportunistas.

O mecanismo exato pelo qual o HIV-1 prejudica a resposta fagocítica dos macrófagos era desconhecido. Havíamos mostrado anteriormente que a absorção de vários materiais particulados pelos macrófagos era inibida quando eles estavam infectados com o HIV-1. Essa inibição foi apenas parcial e os fagossomos se formaram dentro dos macrófagos infectados pelo HIV. Portanto, nos concentramos em analisar o destino desses fagossomos. A maturação dos fagossomos é acompanhada pela migração desses compartimentos em direção ao centro celular, onde se fundem com os lisossomos, gerando fagolisossomos, responsáveis pela degradação do material ingerido. Usamos glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados por IgG como alvo para fagocitose. Para medir a velocidade do movimento centrípeto de fagossomos em macrófagos individuais infectados pelo HIV, usamos uma combinação de microscopia confocal de campo claro e fluorescência. Estabelecemos um método para calcular a distância dos fagossomos em direção ao núcleo e, em seguida, calcular a velocidade dos fagossomos. As células infectadas pelo HIV foram identificadas graças a um vírus que expressa GFP, mas o método é aplicável a células não infectadas ou a qualquer tipo de infecção ou tratamento.

Introdução

Os macrófagos desempenham um papel importante no sistema imunológico inato e na homeostase. São fagócitos profissionais que internalizam e eliminam patógenos e detritos por um processo denominado fagocitose 1,2. O fagossomo, o compartimento fechado que se forma após o engolfamento do material particulado, sofre uma série de eventos de fusão e fissão com compartimentos endocíticos, levando a um compartimento degradativo chamado fagolisossomo. Este compartimento tem um pH ácido, devido à aquisição de v-ATPases de bombeamento de prótons, contém enzimas hidrolíticas e é enriquecido em proteínas de membrana associadas a lisossomos (LAMPs). A maturação dos fagossomos é acompanhada por sua migração nos microtúbulos 3,4 em direção ao centro da célula para atingir um local perinuclear onde os lisossomos são acumulados.

Muitos patógenos foram relatados para sequestrar a maturação do fagossomo, incluindo bactérias com estilos de vida intracelulares que modificam o ambiente vacuolar onde residem 5. O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)-1 tem como alvo os macrófagos, além das células T. Como os macrófagos são resistentes aos efeitos citopáticos do vírus, ao contrário das células T, eles podem ser considerados como um reservatório para o vírus. Além disso, macrófagos infectados com HIV-1 apresentam funções fagocíticas defeituosas e contribuem para o surgimento de doenças oportunistas. Em particular, a doença invasiva grave de Salmonella não tifoide causada por Salmonella Typhimurium ST313 tem sido prevalente nas últimas três décadas em crianças ou adultos da África Subsaariana infectados com HIV 6. Estima-se que o risco de desenvolver tuberculose seja mais de 20 vezes maior em pessoas vivendo com HIV do que entre aquelas sem infecção pelo HIV.

Por todas essas razões, é importante definir melhor os mecanismos moleculares subjacentes aos defeitos fagocíticos em macrófagos infectados pelo HIV. Mostramos que a absorção de material particulado, partículas opsonizadas, bactérias ou fungos, foi inibida em macrófagos infectados pelo HIV 7. Dado que essa inibição é parcial, começamos a analisar o destino dos fagossomos internalizados em macrófagos humanos infectados pelo HIV 8. Como a maturação do fagossomo está intimamente ligada à migração para o centro celular e à fusão com os lisossomos, um defeito na maturação fagossômica pode ser devido a modificações das modalidades de tráfego na célula infectada. O método descrito aqui usa glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados por IgG (IgG-SRBCs) como um modelo para direcionar a fagocitose mediada por receptor e, em particular, receptores para a porção Fc das imunoglobulinas (FcR). Essas partículas são mais fáceis de visualizar em campo claro (BF) do que as esferas de látex porque os SRBCs extracelulares e intracelulares mostram propriedades de refração diferentes 9. Para medir a velocidade dos fagossomos que se movem em direção ao núcleo em macrófagos infectados pelo HIV, usamos um vírus fluorescente 10 e configuramos um método de rastreamento manual simples descrito aqui. O método não requer programação avançada e simplesmente usa ImageJ. É passível de células aderentes e qualquer tipo de partícula ou patógeno que possa ser visualizado com microscopia de campo claro ou com imagens fluorescentes.

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Protocolo

O protocolo tem de ser efectuada em estrita conformidade com as legislações nacionais e internacionais e regulamentos locais. O sangue de doadores saudáveis ​​que deram o seu consentimento para doar sangue para fins de pesquisa foi obtido a partir de centros de transfusão de sangue com o qual as instituições assinaram acordo. protecções especiais devem ser tomados ao usar sangue humano. As experiências com o HIV-1 deve ser realizado em um nível de segurança biológica, ou 2 3 (BSL-3 ou 2) laboratório de acordo com a legislação local.

1. Preparação de macrófagos humanos Monócitos-derivados (hMDMs) por centrifugação em gradiente de densidade e por adesão Selecção

  1. Comece com o sangue fresco de dadores saudáveis ​​(9 mL). Dilui-se todo o volume de sangue fresco com 1x estéril salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca 2+ e Mg 2+ para se obter um volume final de 70 ml e adicionar cuidadosamente o sangue diluído em dois tubos de 50 mL cónicos (35 mL por tubo) , no topo de 15 ml de umaeutral, altamente ramificado, de elevada massa, polissacárido hidrófilo na solução já em cada tubo.
  2. Centrífuga ambos os tubos de sangue a 537 xg durante 20 min a 20 ° C sem travão. Em seguida, recolher as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) contidos no anel célula nebuloso na interface e transferi-las para um novo tubo de 50 ml contendo 15 ml de PBS 1x sem Ca 2+ e Mg 2+.
  3. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C e ressuspender o sedimento em 45 ml de PBS 1x sem Ca 2+ e Mg 2+.
  4. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS 1x sem Ca 2+ e Mg 2+, e contar as células por diluição para uma diluição final de 1/200 em azul de tripano.
  5. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C e ressuspender o sedimento em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina e 100 ug / ml Penicillin-estreptomicina a ter 7 x 10 6 PBMC por cavidade em 2 ml de meio em cada poço de uma placa de 6 bem.
  6. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 h. Após 2 h os monócitos vai aderiram ao plástico.
  7. Para permitir que os recém-isolados monócitos de se diferenciar em hMDMs, Aspirar o meio e substitui-la com 2 ml hMDM meio (RPMI 1640, 10% descomplementado Soro Fetal de Vitela (FCS), 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado com factor de estimulação do macrófago humano recombinante Colony (RHM-CSF), a uma concentração final de 10 ng / ml.
  8. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 11 dias (Figura 1).
  9. No dia 11, remover o meio e lava-se 2 vezes com 2 ml de meio por poço hMDM frio. De seguida, lavar cada poço 2 vezes com 1 ml de PBS frio 1x.
  10. Para retirar hMDMs totalmente diferenciadas, lavar cada poço 1 hora com 1 ml de PBS frio 1x com ácido ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) e incuba-se as células em 2 ml de PBS frio 1x com EDTA 2 mM por poço, durante 15-60 min a 4 ° C.
    NOTA: Os métodos alternativos para separar existem as células (por exemplo, tripsina ou atividades de tripsina-like) que possa dar bons resultados 11.
  11. Depois de descolamento (concluído com cuidado pipetando cima e para baixo no poço), recolher as células e colocá-los em um tubo de 50 ml de gelo contendo 10 ml de meio hMDM frio.
  12. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, ressuspender o sedimento em 10 ml de meio frio hMDM, e contar as células por diluição de 1/20 em azul de tripano.
  13. Semear as células a 1 x 10 6 hMDMs por 35 milímetros de vidro da classe microscopia prato inferior e incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 1 dia.

2. Produção e quantificação do VIH-1 reservas virais

NOTA: NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP (Green Fluorescent Protein) carregando um envelope R5-trópico, presente de M. Schindler 10 é utilizado para infectar macrófagos e células infectadas para ver em tempo real.

  1. Produção de reservas virais através de transfecção de células humanas embrionárias de rim 293T (2 x 10 6 em 100 milímetros prato) com 6 ug do ADN pró-viral correspondente usando um reagente de transfecção comercial.
  2. Quantificar a infecciosidade das reservas de vírus com as células indicadoras HeLa TZM-bl (possuindo o gene ß-galactosidase sob o controlo do HIV-1 LTR) utilizando diluições em série dos stocks virais, seguido de uma coloração ß-galactosidase das células e contagem células de azul 12.

3. A infecção de hMDMs com HIV-1

  1. Adicionar o vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) 0,02-0,03 em 1 ml de meio para hMDM hMDMs (células plaqueadas em 1,13). Para controlar poços adicionar apenas 1 ml de meio hMDM e incubar os pratos a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 dias (Figura 1).
  2. No dia 2 lavar as células com hMDM medio 3 vezes e adicionar 1 ml de meio hMDM fresco por prato. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6 dias (Figura 1).

4. Opsonização de ovelhas Glóbulos vermelhos

  1. Para a preparação de 7 x 10 6 por placa de SRBCs, lavar os SRBCs duas vezes em 100 ul de solução contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS 1x com centrifugação a 600 x g durante 4 min.
  2. Ressuspender as SRBCs lavadas com 500 ul de 1x PBS / BSA a 0,1% com IgG de coelho anti-SRBCs a uma concentração sub-aglutinação por 5 ul de SRBCs e incubar com rotação à temperatura ambiente durante 30 min.
    NOTA: Para determinar a concentração sub-aglutinação de anti-IgG de SRBCs, preparar diluições em série de IgG (concentração de estoque de 13,1 mg / ml) a partir de 1/50 a 1 / 25.600 em 20 ul numa placa de 96 poços. Adicionar 2 x 10 6 SRBCs em 20 ul em cada cavidade e colocar a placa de um quarto escuro durante várias horas. A concentração sub-aglutinação é adiluição do poço imediatamente antes do poço com aglutinação (IgG + SRBCs formando uma rede).
  3. Após rotação, centrifugar os SRBCs-IgG-opsonizadas a 600 xg durante 4 min e lava-se com 100 ul de 1x PBS / BSA a 0,1%, com centrifugação a 600 x g durante 4 min.
  4. Ressuspender as SRBCs-IgG-opsonizados em meio pré-aquecido Fenol RPMI sem vermelho suplementado com 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina (1 ml / prato).

5. células vivas Vídeo Microscopy fagocitose Assay

  1. Usar um sistema de imagiologia confocal, tais como um sistema de disco giratório equipado com uma câmara de aquecimento a 37 ° C com CO 2 passando através de um frasco com água para a humidificação.
  2. Ligar a câmara de aquecimento antes da experiência ter a platina do microscópio a 37 ° C antes do início do ensaio de fagocitose. Ligue o microscópio e computador e carregar o software de imagem.
  3. Otimizar as configurações de imagem, como velocidade de digitalização, Magnificatião, resolução, etc, para ter pelo menos uma célula por campo e a imagem de um quadro de cada minuto entre 60 a 120 min.
    NOTA: Aqui, a amostra é fotografada um quadro a cada minuto durante 60 min com 63x lente.
  4. Coloque o prato de imagem no palco microscópio. Ajustar o foco e o local para encontrar apenas um conjunto de macrófagos infectados pelo HIV-1 no campo. Use as configurações de excitação / emissão adequadas com base no sistema de imagem usados ​​e sonda. Incluir um canal brilhante campo (BF) para observar phagosomes (Figura 1ii). Optimizar a aparência das diferentes imagens de canal, ajustando a percentagem de tempo de exposição a luz e transmitidos.
    NOTA: Aqui, NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP estava animado usando um laser de 491 nm com 50 ms de tempo de exposição com 20% do laser (Figura 1-I).
  5. Remover o prato de imagem e adicionar 1 ml de uma suspensão SRBC a 7 x 10 6 / ml SRBCs ao prato (Figura 1).
  6. Centrifugar a 500 xg durante2 min à temperatura ambiente para sincronizar a fagocitose, registar o tempo no final desta centrifugação e devolver o prato para a fase.
  7. Optimizar a captura de foco e GFP e imagens BF em z-pilhas (em toda a espessura da célula com um passo a distância de 0,3 um - 20 geralmente planos) a cada minuto durante pelo menos 1 h. Salvar o vídeo de lapso de tempo no arquivo de formato nativo do sistema de imagem utilizado.
    NOTA: Aqui, os filmes de lapso de tempo foram salvos no formato nativo, arquivos * .stk.

6. Análise da Time-lapse Filmes

  1. Para edição de vídeo, clique no menu drop-down "Apps" e na guia "Análise multidimensional de dados" no software de edição de vídeo.
    1. Para abrir o arquivo, clique em "Selecionar Arquivo Base", em seguida, em "Selecionar Directory". No "Conjuntos de dados", selecione a aquisição de analisar (em formato .nd) e clique em "Ver". Os dados são representados numa tabela com o tempo em uma colunad Z-plano na linha.
    2. Para representar a infecção em um Z-projeção (Figura 2, painéis da esquerda), selecione 491 nm de comprimento de onda na caixa "comprimentos de onda" e clique na aba "Z projecção" com "todos os planos".
    3. Para analisar uma seqüência de tempo, selecione o comprimento de onda BF na caixa "comprimentos de onda" e escolha o plano ideal no eixo Z para distinguir SRBCs externos (Figura 2, seta vermelha), SRBCs internos (Figura 2, círculo vermelho) e o núcleo ( Figura 2, círculo azul).
    4. Para salvar as montagens de vídeo, clique em "Selecção [do X]" e depois em "Load Image (s)". Por fim, salve as imagens carregadas em formato .tif e abri-los em seguida em software ImageJ.
  2. Use o plugin "Rastreio Manual" no software ImageJ para medir a posição do núcleo e os diferentes phagosomes observadas no canal BF (Figura 3).
    1. DowNload o plug-in "Manual de Rastreamento" no site do ImageJ. No ImageJ, abra o plugin e a sequência de imagens a serem analisadas (Figura 3, passo 1 e 2).
    2. Introduzir as definições tais como "intervalo de tempo" que representa quantidade de tempo entre quadros adjacentes, eo "calibração x / y", que representa a distância per pixel (Figura 3, passo 3).
      NOTA: Aqui, guardar a sequência de imagens com um intervalo de tempo de 1 minuto entre cada armação e a calibração x / y de 0,205 uM porque o zoom 63X e uma câmara com tamanho de pixel de 6,45 x 6,45? M 2 são usados.
    3. Para iniciar o rastreamento, clique em "Adicionar faixa" (Figura 3, passo 4) e clique em um centro de SRBC no primeiro tempo quando é internalizado. O próximo quadro aparece automaticamente.
    4. Continue a clicar sobre o centro SRBC em todos os quadros de ter posições diferentes durante o tempo (Figura 3, Passo 6 na caixa vermelha).
      1. Começar a controlar o núcleo que a sua posição em todos os quadros, clicando em seu centro. Próximo acompanhar os phagosomes (clicando em seu centro), um por um na época (frame) de sua interiorização, diferente em função do SRBCs. Para maior comodidade para ver SRBC no canal BF, use a janela "Brilho e Contraste" durante o acompanhamento (Figura 3, passo 5).
    5. Entre cada rastreamento SRBC, clique em "Adicionar faixa" (Figura 3, passo 4) para ter uma nova pista. O número de rastreamento será alterado na segunda coluna, "Track n °" da tabela de resultados (Figura 3, passo 6).
    6. Salvar os dados em uma planilha para continuar para a próxima etapa da análise.
  3. Use um software de planilha para calcular a distância percorrida de phagosomes contendo SRBCs para o núcleo e a velocidade dos phagosomes durante os primeiros 5 minutos após a internalização de SRBCs (Fifigura 4).
    1. Abra a tabela de folha de cálculo e um novo arquivo de planilha. Transferir para este novo arquivo os seguintes parâmetros somente, tempo, o X e Y coordenadas do núcleo e todos os SRBCs (Figura 4A).
    2. Para calcular a distância entre o núcleo e SRBCs com apenas as suas coordenadas, considerar o núcleo e uma SRBC num plano XY de coordenadas (Figura 4B).
      NOTA: A distância entre dois pontos é o comprimento do caminho de os ligar. No plano, a distância entre o núcleo e SRBC é dada pelo teorema de Pitágoras.
      1. Se C (a distância entre o núcleo e o SRBC) indica o comprimento da hipotenusa e a e b representam os comprimentos dos outros dois lados, expressar o teorema de Pitágoras como a equação de Pitágoras:
        figure-protocol-1
        NOTA: Ao mesmo tempo, no ortonormal, a distância horizontalum é (x núcleo -x SRBC) e a distância vertical b é (Y-Y núcleo SRBC).
      2. Assim, o cálculo da distância entre o núcleo e o SRBC (Figura 4A, a caixa roxo) por:
        figure-protocol-2
        NOTA: multiplicar o valor de distância obtida (em pixels) por x / y de calibragem ter a distância em uM. Aqui, a calibração x / y é 0,205 uM.
      3. Em cada tempo, subtrair a distância entre o núcleo e o SRBC à distância inicial (Figura 4C).
      4. Traça-se a medição em função do tempo para os primeiros 5 min. Aplicar uma linha de tendência linear (Figura 5A) para a trama e determinar a inclinação da linha de tendência linear que representa a velocidade fagossoma para o núcleo durante os primeiros 5 minutos após a internalização SRBC.
      5. Agrupar os dados para calcular o erro médio e de estatísticaos valores de velocidade e traçar-los em uma forma adequada, utilizando o software apropriado (Figura 5B).

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Resultados

Fagocitose mediada por FcR-hMDMs HIV-1 infectadas e não-infectadas é descrito aqui usando SRBCs IgG-opsonizadas como alvos modelo (Figura 1). Os passos críticos deste protocolo são a preparação de hMDMs ea infecção com HIV-1. Com efeito, o rendimento e a qualidade dos macrófagos diferenciados varia entre dadores, bem como a taxa de infecção com eficiências na gama de 10-40%. Além disso, a preparação de IgG-opsonizado-SRBCs também é importante para evitar danificar os eri...

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Discussão

Esta técnica tem várias etapas críticas. Em primeiro lugar, a preparação de hMDMs e a sua infecção por HIV-1 é crítica, porque a percentagem de infecção é dependente do dador. De nota, decidimos usar macrófagos que não são polarizados in vitro antes da infecção, pois o estado de macrófagos potencialmente encontradas pelo vírus in vivo não foi bem caracterizada medida. Nós verificamos a expressão de vários marcadores de superfície, o que indica que os macrófagos são nem nem M1 M2, e verificou-se a expre...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Jamil Jubrail pela leitura do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas do CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 incluindo uma bolsa de doutorado para GLB) e Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, incluindo uma bolsa de pós-doutorado para CD) para FN. A. Dumas foi apoiado por bolsas de doutorado da Université Paris Descartes e Sidaction.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura de células tratada com TC Falcon 100 mmCorning353003Para produção viral
Placas de fundo de vidro 35 mm não revestidas 1.5MatTek corporationP35G-1.5-14-C CasoPara aquisição
Placas de cultura de tecidos Falcon 6 poçosThermo Fischer ScientificCorning. Inc. 353934Para macrófagos derivados de monócitos humanos
Placa Ficoll PLUSDominique Dutscher17-1440-03um polissacarídeo hidrofílico neutro, altamente ramificado, de alta massa, em solução para centrifugação por densidade
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermo Fischer Scientific14190-094RT
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, líquido (Alta Glicose)GIBCO, Sondas moleculares31966-021Conservado a 4 &graus; C ; para cultura de células HEK
RPMI 1640 medium GLUTAMAX  SuplementoLife technologies61870-010Conservado em 4 &graus; C; para hMDMs cultura
Fœ tal Soro de Panturrilha (FCS) EurobioCVFSVF0001conservado em -20 > C ;
Penicilina-Estreptomicina descomplementada (10.000 U/ml)Thermo Fischer Scientific15140-122Conservado a -20 ° C ; para cultura hMDMs
RPMI 1640 médio, sem vermelho de fenol (10x 500 ml)Life technologies11835-105Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso; para ensaio de fagocitose
FuGENE6 Reagente de TransfecçãoPromegaE2692Conservado em 4 ° C ; para produção viral
Glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs)EurobioDSGMTN00-0QConservado em tampão Alsever a 4 &graus; C antes do uso
Glóbulos vermelhos anti-ovelhas IgGMP Biomedicals55806Conservado em 4 ° C
Soro Bovino Albumina fração de choque térmico, pH 7, ≥ 98% SigmaA7906conservado em -20 &graus; C
Microscópio invertido DMI600Unidade
  CSU-X1M1Yokogawa
491 nm 50 mW laserCOBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS ObjectifLeicaLente objetiva ; Ampliação 100X ; Abertura numérica 1,40; Óleo de imersão
CoolSnap HQ2 (FireWire) CâmeraPhotometricsTamanho do pixel 6.45 µ m x 6.45 µ m ; Definição 1.392 x 1.040; Codificando a imagem no
software Metamorph 7.7.5Dispositivos molecularesPara o controle do microscópio
Software GraphPad PrismPara a análise estatística
de Disco Giratório Confocal Leica de 14 bits

Referências

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Reimpressões e permissões

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