Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Os macrófagos desempenham um papel importante no sistema imunológico inato e na homeostase. São fagócitos profissionais que internalizam e eliminam patógenos e detritos por um processo denominado fagocitose ^1,2. O fagossomo, o compartimento fechado que se forma após o engolfamento do material particulado, sofre uma série de eventos de fusão e fissão com compartimentos endocíticos, levando a um compartimento degradativo chamado fagolisossomo. Este compartimento tem um pH ácido, devido à aquisição de v-ATPases de bombeamento de prótons, contém enzimas hidrolíticas e é enriquecido em proteínas de membrana associadas a lisossomos (LAMPs). A maturação dos fagossomos é acompanhada por sua migração nos microtúbulos ^3,4 em direção ao centro da célula para atingir um local perinuclear onde os lisossomos são acumulados.

Muitos patógenos foram relatados para sequestrar a maturação do fagossomo, incluindo bactérias com estilos de vida intracelulares que modificam o ambiente vacuolar onde residem ⁵. O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)-1 tem como alvo os macrófagos, além das células T. Como os macrófagos são resistentes aos efeitos citopáticos do vírus, ao contrário das células T, eles podem ser considerados como um reservatório para o vírus. Além disso, macrófagos infectados com HIV-1 apresentam funções fagocíticas defeituosas e contribuem para o surgimento de doenças oportunistas. Em particular, a doença invasiva grave de Salmonella não tifoide causada por Salmonella Typhimurium ST313 tem sido prevalente nas últimas três décadas em crianças ou adultos da África Subsaariana infectados com HIV ⁶. Estima-se que o risco de desenvolver tuberculose seja mais de 20 vezes maior em pessoas vivendo com HIV do que entre aquelas sem infecção pelo HIV.

Por todas essas razões, é importante definir melhor os mecanismos moleculares subjacentes aos defeitos fagocíticos em macrófagos infectados pelo HIV. Mostramos que a absorção de material particulado, partículas opsonizadas, bactérias ou fungos, foi inibida em macrófagos infectados pelo HIV ⁷. Dado que essa inibição é parcial, começamos a analisar o destino dos fagossomos internalizados em macrófagos humanos infectados pelo HIV ⁸. Como a maturação do fagossomo está intimamente ligada à migração para o centro celular e à fusão com os lisossomos, um defeito na maturação fagossômica pode ser devido a modificações das modalidades de tráfego na célula infectada. O método descrito aqui usa glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados por IgG (IgG-SRBCs) como um modelo para direcionar a fagocitose mediada por receptor e, em particular, receptores para a porção Fc das imunoglobulinas (FcR). Essas partículas são mais fáceis de visualizar em campo claro (BF) do que as esferas de látex porque os SRBCs extracelulares e intracelulares mostram propriedades de refração diferentes ⁹. Para medir a velocidade dos fagossomos que se movem em direção ao núcleo em macrófagos infectados pelo HIV, usamos um vírus fluorescente ¹⁰ e configuramos um método de rastreamento manual simples descrito aqui. O método não requer programação avançada e simplesmente usa ImageJ. É passível de células aderentes e qualquer tipo de partícula ou patógeno que possa ser visualizado com microscopia de campo claro ou com imagens fluorescentes.

O protocolo tem de ser efectuada em estrita conformidade com as legislações nacionais e internacionais e regulamentos locais. O sangue de doadores saudáveis ​​que deram o seu consentimento para doar sangue para fins de pesquisa foi obtido a partir de centros de transfusão de sangue com o qual as instituições assinaram acordo. protecções especiais devem ser tomados ao usar sangue humano. As experiências com o HIV-1 deve ser realizado em um nível de segurança biológica, ou 2 3 (BSL-3 ou 2) laboratório de acordo com a legislação local.

1. Preparação de macrófagos humanos Monócitos-derivados (hMDMs) por centrifugação em gradiente de densidade e por adesão Selecção

1. Comece com o sangue fresco de dadores saudáveis ​​(9 mL). Dilui-se todo o volume de sangue fresco com 1x estéril salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca ²⁺ e Mg ²⁺ para se obter um volume final de 70 ml e adicionar cuidadosamente o sangue diluído em dois tubos de 50 mL cónicos (35 mL por tubo) , no topo de 15 ml de umaeutral, altamente ramificado, de elevada massa, polissacárido hidrófilo na solução já em cada tubo.
2. Centrífuga ambos os tubos de sangue a 537 xg durante 20 min a 20 ° C sem travão. Em seguida, recolher as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) contidos no anel célula nebuloso na interface e transferi-las para um novo tubo de 50 ml contendo 15 ml de PBS 1x sem Ca ²⁺ e Mg ^2+.
3. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C e ressuspender o sedimento em 45 ml de PBS 1x sem Ca ²⁺ e Mg ^2+.
4. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS 1x sem Ca ²⁺ e Mg ^2+, e contar as células por diluição para uma diluição final de 1/200 em azul de tripano.
5. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C e ressuspender o sedimento em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina e 100 ug / ml Penicillin-estreptomicina a ter 7 x 10 ⁶ PBMC por cavidade em 2 ml de meio em cada poço de uma placa de 6 bem.
6. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 2 h. Após 2 h os monócitos vai aderiram ao plástico.
7. Para permitir que os recém-isolados monócitos de se diferenciar em hMDMs, Aspirar o meio e substitui-la com 2 ml hMDM meio (RPMI 1640, 10% descomplementado Soro Fetal de Vitela (FCS), 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina) suplementado com factor de estimulação do macrófago humano recombinante Colony (RHM-CSF), a uma concentração final de 10 ng / ml.
8. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 11 dias (Figura 1).
9. No dia 11, remover o meio e lava-se 2 vezes com 2 ml de meio por poço hMDM frio. De seguida, lavar cada poço 2 vezes com 1 ml de PBS frio 1x.
10. Para retirar hMDMs totalmente diferenciadas, lavar cada poço 1 hora com 1 ml de PBS frio 1x com ácido ethylenediaminetetraacetatic 2 mM (EDTA) e incuba-se as células em 2 ml de PBS frio 1x com EDTA 2 mM por poço, durante 15-60 min a 4 ° C.
    NOTA: Os métodos alternativos para separar existem as células (por exemplo, tripsina ou atividades de tripsina-like) que possa dar bons resultados ^11.
11. Depois de descolamento (concluído com cuidado pipetando cima e para baixo no poço), recolher as células e colocá-los em um tubo de 50 ml de gelo contendo 10 ml de meio hMDM frio.
12. Centrifugar as células a 218 xg durante 5 min a 20 ° C, ressuspender o sedimento em 10 ml de meio frio hMDM, e contar as células por diluição de 1/20 em azul de tripano.
13. Semear as células a 1 x 10 ⁶ hMDMs por 35 milímetros de vidro da classe microscopia prato inferior e incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 1 dia.

2. Produção e quantificação do VIH-1 reservas virais

NOTA: NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP (Green Fluorescent Protein) carregando um envelope R5-trópico, presente de M. Schindler ¹⁰ é utilizado para infectar macrófagos e células infectadas para ver em tempo real.

1. Produção de reservas virais através de transfecção de células humanas embrionárias de rim 293T (2 x 10 ⁶ em 100 milímetros prato) com 6 ug do ADN pró-viral correspondente usando um reagente de transfecção comercial.
2. Quantificar a infecciosidade das reservas de vírus com as células indicadoras HeLa TZM-bl (possuindo o gene ß-galactosidase sob o controlo do HIV-1 LTR) utilizando diluições em série dos stocks virais, seguido de uma coloração ß-galactosidase das células e contagem células de azul ^12.

3. A infecção de hMDMs com HIV-1

1. Adicionar o vírus a uma multiplicidade de infecção (MOI) 0,02-0,03 em 1 ml de meio para hMDM hMDMs (células plaqueadas em 1,13). Para controlar poços adicionar apenas 1 ml de meio hMDM e incubar os pratos a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 2 dias (Figura 1).
2. No dia 2 lavar as células com hMDM medio 3 vezes e adicionar 1 ml de meio hMDM fresco por prato. Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 6 dias (Figura 1).

4. Opsonização de ovelhas Glóbulos vermelhos

1. Para a preparação de 7 x 10 ⁶ por placa de SRBCs, lavar os SRBCs duas vezes em 100 ul de solução contendo 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS 1x com centrifugação a 600 x g durante 4 min.
2. Ressuspender as SRBCs lavadas com 500 ul de 1x PBS / BSA a 0,1% com IgG de coelho anti-SRBCs a uma concentração sub-aglutinação por 5 ul de SRBCs e incubar com rotação à temperatura ambiente durante 30 min.
   NOTA: Para determinar a concentração sub-aglutinação de anti-IgG de SRBCs, preparar diluições em série de IgG (concentração de estoque de 13,1 mg / ml) a partir de 1/50 a 1 / 25.600 em 20 ul numa placa de 96 poços. Adicionar 2 x 10 ⁶ SRBCs em 20 ul em cada cavidade e colocar a placa de um quarto escuro durante várias horas. A concentração sub-aglutinação é adiluição do poço imediatamente antes do poço com aglutinação (IgG + SRBCs formando uma rede).
3. Após rotação, centrifugar os SRBCs-IgG-opsonizadas a 600 xg durante 4 min e lava-se com 100 ul de 1x PBS / BSA a 0,1%, com centrifugação a 600 x g durante 4 min.
4. Ressuspender as SRBCs-IgG-opsonizados em meio pré-aquecido Fenol RPMI sem vermelho suplementado com 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina (1 ml / prato).

5. células vivas Vídeo Microscopy fagocitose Assay

1. Usar um sistema de imagiologia confocal, tais como um sistema de disco giratório equipado com uma câmara de aquecimento a 37 ° C com CO ₂ passando através de um frasco com água para a humidificação.
2. Ligar a câmara de aquecimento antes da experiência ter a platina do microscópio a 37 ° C antes do início do ensaio de fagocitose. Ligue o microscópio e computador e carregar o software de imagem.
3. Otimizar as configurações de imagem, como velocidade de digitalização, Magnificatião, resolução, etc, para ter pelo menos uma célula por campo e a imagem de um quadro de cada minuto entre 60 a 120 min.
   NOTA: Aqui, a amostra é fotografada um quadro a cada minuto durante 60 min com 63x lente.
4. Coloque o prato de imagem no palco microscópio. Ajustar o foco e o local para encontrar apenas um conjunto de macrófagos infectados pelo HIV-1 no campo. Use as configurações de excitação / emissão adequadas com base no sistema de imagem usados ​​e sonda. Incluir um canal brilhante campo (BF) para observar phagosomes (Figura 1ii). Optimizar a aparência das diferentes imagens de canal, ajustando a percentagem de tempo de exposição a luz e transmitidos.
   NOTA: Aqui, NLR4.3 HIV-1 Gag-IGFP estava animado usando um laser de 491 nm com 50 ms de tempo de exposição com 20% do laser (Figura 1-I).
5. Remover o prato de imagem e adicionar 1 ml de uma suspensão SRBC a 7 x 10 ⁶ / ml SRBCs ao prato (Figura 1).
6. Centrifugar a 500 xg durante2 min à temperatura ambiente para sincronizar a fagocitose, registar o tempo no final desta centrifugação e devolver o prato para a fase.
7. Optimizar a captura de foco e GFP e imagens BF em z-pilhas (em toda a espessura da célula com um passo a distância de 0,3 um - 20 geralmente planos) a cada minuto durante pelo menos 1 h. Salvar o vídeo de lapso de tempo no arquivo de formato nativo do sistema de imagem utilizado.
   NOTA: Aqui, os filmes de lapso de tempo foram salvos no formato nativo, arquivos * .stk.

6. Análise da Time-lapse Filmes

1. Para edição de vídeo, clique no menu drop-down "Apps" e na guia "Análise multidimensional de dados" no software de edição de vídeo.
   1. Para abrir o arquivo, clique em "Selecionar Arquivo Base", em seguida, em "Selecionar Directory". No "Conjuntos de dados", selecione a aquisição de analisar (em formato .nd) e clique em "Ver". Os dados são representados numa tabela com o tempo em uma colunad Z-plano na linha.
   2. Para representar a infecção em um Z-projeção (Figura 2, painéis da esquerda), selecione 491 nm de comprimento de onda na caixa "comprimentos de onda" e clique na aba "Z projecção" com "todos os planos".
   3. Para analisar uma seqüência de tempo, selecione o comprimento de onda BF na caixa "comprimentos de onda" e escolha o plano ideal no eixo Z para distinguir SRBCs externos (Figura 2, seta vermelha), SRBCs internos (Figura 2, círculo vermelho) e o núcleo ( Figura 2, círculo azul).
   4. Para salvar as montagens de vídeo, clique em "Selecção [do X]" e depois em "Load Image (s)". Por fim, salve as imagens carregadas em formato .tif e abri-los em seguida em software ImageJ.
2. Use o plugin "Rastreio Manual" no software ImageJ para medir a posição do núcleo e os diferentes phagosomes observadas no canal BF (Figura 3).
   1. DowNload o plug-in "Manual de Rastreamento" no site do ImageJ. No ImageJ, abra o plugin e a sequência de imagens a serem analisadas (Figura 3, passo 1 e 2).
   2. Introduzir as definições tais como "intervalo de tempo" que representa quantidade de tempo entre quadros adjacentes, eo "calibração x / y", que representa a distância per pixel (Figura 3, passo 3).
      NOTA: Aqui, guardar a sequência de imagens com um intervalo de tempo de 1 minuto entre cada armação e a calibração x / y de 0,205 uM porque o zoom 63X e uma câmara com tamanho de pixel de 6,45 x 6,45? M ² são usados.
   3. Para iniciar o rastreamento, clique em "Adicionar faixa" (Figura 3, passo 4) e clique em um centro de SRBC no primeiro tempo quando é internalizado. O próximo quadro aparece automaticamente.
   4. Continue a clicar sobre o centro SRBC em todos os quadros de ter posições diferentes durante o tempo (Figura 3, Passo 6 na caixa vermelha).
      1. Começar a controlar o núcleo que a sua posição em todos os quadros, clicando em seu centro. Próximo acompanhar os phagosomes (clicando em seu centro), um por um na época (frame) de sua interiorização, diferente em função do SRBCs. Para maior comodidade para ver SRBC no canal BF, use a janela "Brilho e Contraste" durante o acompanhamento (Figura 3, passo 5).
   5. Entre cada rastreamento SRBC, clique em "Adicionar faixa" (Figura 3, passo 4) para ter uma nova pista. O número de rastreamento será alterado na segunda coluna, "Track n °" da tabela de resultados (Figura 3, passo 6).
   6. Salvar os dados em uma planilha para continuar para a próxima etapa da análise.
3. Use um software de planilha para calcular a distância percorrida de phagosomes contendo SRBCs para o núcleo e a velocidade dos phagosomes durante os primeiros 5 minutos após a internalização de SRBCs (Fifigura 4).
   1. Abra a tabela de folha de cálculo e um novo arquivo de planilha. Transferir para este novo arquivo os seguintes parâmetros somente, tempo, o X e Y coordenadas do núcleo e todos os SRBCs (Figura 4A).
   2. Para calcular a distância entre o núcleo e SRBCs com apenas as suas coordenadas, considerar o núcleo e uma SRBC num plano XY de coordenadas (Figura 4B).
      NOTA: A distância entre dois pontos é o comprimento do caminho de os ligar. No plano, a distância entre o núcleo e SRBC é dada pelo teorema de Pitágoras.
      1. Se C (a distância entre o núcleo e o SRBC) indica o comprimento da hipotenusa e a e b representam os comprimentos dos outros dois lados, expressar o teorema de Pitágoras como a equação de Pitágoras:
         
         NOTA: Ao mesmo tempo, no ortonormal, a distância horizontalum é (x _núcleo -x _SRBC) e a distância vertical b é (Y-Y _{núcleo SRBC).}
      2. Assim, o cálculo da distância entre o núcleo e o SRBC (Figura 4A, a caixa roxo) por:
         
         NOTA: multiplicar o valor de distância obtida (em pixels) por x / y de calibragem ter a distância em uM. Aqui, a calibração x / y é 0,205 uM.
      3. Em cada tempo, subtrair a distância entre o núcleo e o SRBC à distância inicial (Figura 4C).
      4. Traça-se a medição em função do tempo para os primeiros 5 min. Aplicar uma linha de tendência linear (Figura 5A) para a trama e determinar a inclinação da linha de tendência linear que representa a velocidade fagossoma para o núcleo durante os primeiros 5 minutos após a internalização SRBC.
      5. Agrupar os dados para calcular o erro médio e de estatísticaos valores de velocidade e traçar-los em uma forma adequada, utilizando o software apropriado (Figura 5B).

Fagocitose mediada por FcR-hMDMs HIV-1 infectadas e não-infectadas é descrito aqui usando SRBCs IgG-opsonizadas como alvos modelo (Figura 1). Os passos críticos deste protocolo são a preparação de hMDMs ea infecção com HIV-1. Com efeito, o rendimento e a qualidade dos macrófagos diferenciados varia entre dadores, bem como a taxa de infecção com eficiências na gama de 10-40%. Além disso, a preparação de IgG-opsonizado-SRBCs também é importante para evitar danificar os eritrócitos, porque isto poderia induzir o seu reconhecimento e absorção como detritos em vez de por fagocitose mediada por FcR. opsonização óptima irá garantir fagocitose eficiente.

fagossoma no movimento vivo macrófagos infectados pelo VIH é analisado em tempo real com o canal de BF em um microscópio confocal de disco giratório no laboratório BSL-3. As configurações do canal BF são críticos to ver o núcleo (Figura 2, azul círculo) e para discriminar o externo (Figura 2, setas vermelhas) a partir das SRBCs internalizados (Figura 2, círculos vermelhos). A microscopia de BF é considerado como o mais simples técnica de iluminação microscopia óptica suficiente para ver os phagosomes, que são menos do que os refringentes SRBCs externas.

O primeiro passo após a aquisição de sequências de imagens é rastreamento manual sobre o software ImageJ (Figura 3). Este ponto pode ser particularmente longa e fastidiosa, uma vez que é preferível para controlar cada fagossoma, um por um para todas as sequências da imagem e considera-se que os ensaios em ter de ser repetido com pelo menos 3 doadores por condição para atingir um tamanho de amostra suficiente para evitar a análise estatística (pelo menos 30 fagossomos com 3 doadores diferentes).

O segundo passo é a análiseno software de planilha para calcular a velocidade fagossoma durante os primeiros 5 minutos após a internalização para cada SRBCs internalizados (Figura 4). Para isso, marcamos para cada fagossomo a distância percorrida durante os 5 primeiros minutos contra o tempo. Um exemplo representativo é mostrado na hMDMs não infectados em Figura 5A. Em seguida obtém-se a velocidade do fagossoma, o que é o declive da curva de regressão linear. Uma velocidade de 0,5384 pM / min foi encontrada para este fagossoma.

De nota, é possível analisar a velocidade de fagossoma durante os primeiros minutos após a internalização, tal como descrito aqui ou em Dumas et al., 8, ou mais tarde por análise da velocidade em escalas de tempo mais longos. Em nosso estudo, observou-se que a velocidade fagossoma durante os primeiros 5 minutos após a internalização em hMDMs infectados pelo HIV é menor em comparação com hMDMs não infectados (Figura 5B).

Figura 2. aquisição em tempo real durantefagocitose por controlo representativo e hMDMs infectados pelo HIV. hMDMs são preparados e infectadas, como descrito na Figura 1. As células NLR4.3 HIV-1Gag-IGFP infectadas são detectados com o laser de 491 nm. Z-pilhas de imagens confocal disco giratório são adquiridos e analisados ​​utilizando tanto o software de aquisição de microscópio e ImageJ (painéis da esquerda). Galerias de imagens BF representam um (painéis superiores correspondentes a Filme 1) não infectados e um NLR4.3 HIV-1Gag-IGFP infectadas (painéis inferiores correspondentes a Movie 2) celular durante uma aquisição de 45 min (46 imagens com o tempo indicado como hh :milímetros). A membrana celular (linha pontilhada preto), o núcleo (círculo azul), os SRBCs externos (alguns deles indicados com setas vermelhas) e os SRBCs internos (alguns deles indicados com círculos vermelhos) são detectáveis ​​em imagens BF. Bar = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. passos de instrução para análise de imagem com o plugin O Tracking Manual on ImageJ. Depois de abrir o plug-in "Manual de Monitoramento" (1) e carregar o lapso de tempo vídeo no canal BF (2), digite os parâmetros de aquisição (3). Clique em "Adicionar faixa" (4) e iniciar a medição do tracking, clicando em um fagossoma (5) para obter uma nova janela com posições X e Y do fagossoma escolhido (6, caixa vermelha). Para seguir o fagossomo na sequência de tempo por conveniência, variar o brilho e contraste (5 '). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Passos de instruções para análise da velocidade de migração fagossomo em software de planilha de dados. (A) Montar a posição X e Y do núcleo e cada fagossomo (caixa vermelha) em uma tabela de planilha. Em uma outra coluna (caixa roxa), calcular a distância entre o fagossoma e o núcleo com o teorema de Pitágoras, onde c representa a distância entre o núcleo e o SRBC e a e b os comprimentos dos outros dois lados de um triângulo rectângulo ( B). (C) Finalmente, calcular a distância percorrida pelos phagosomes em cada tempo (caixa verde) subtraindo a distância entre o SRBC eo núcleo em um determinado momento da distância inicial no tempo 0. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

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Figura 5. A quantificação da velocidade de migração fagossoma no controle e hMDMs infectados pelo HIV. (A) para cada SRBC e apenas após a internalização SRBC, a distância percorrida para o núcleo é medida e representada graficamente contra o tempo. Sua velocidade durante a primeira 5 min é calculado por meio de regressão linear em software de planilha. A experiência representativa é mostrado (o SRBC interna da Figura 3-4). (B) Todas as velocidades durante os primeiros 5 min são medidos para 66 phagosomes em não infectados (5 doadores) e 60 phagosomes em células infectadas pelo HIV (4 doadores). Os dados representam a média ± SEM (teste t de Student não pareado com correção de Welch; **, P <0,01). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 2: movimento fagossomo em um macrófago representante infectado pelo HIV. (Clique direito a download). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag IGFP) infectados macrófagos foram identificados após iluminação com laser 491. O movimento de glóbulos vermelhos opsonizados foi detectada no canal de BF durante 45min da fagocitose com uma imagem por minuto (46 imagens com o tempo indicado como hh: mm). Barra = 10 uM.

Os autores não têm nada a divulgar.