Determinação do Potencial Zeta de nanopartículas de translocação através de velocidades por meio de um Tunable Nanopore: Utilizando partículas modificadas-ADN como um Exemplo

Resumo

Aqui usamos um nanoporo sintonizável poliuretano integrados em uma técnica de detecção de impulsos resistiva para caracterizar nanopartículas química da superfície por meio da medição das velocidades das partículas de translocação, que pode ser usado para determinar o potencial Zeta de nanopartículas individuais.

Resumo

tecnologias Nanopore, conhecidos coletivamente como resistivas sensores de pulso (RPS), estão sendo usados ​​para detectar, quantificar e caracterizar proteínas, moléculas e nanopartículas. detecção de impulsos resistiva ajustável (TRPS) é uma adaptação relativamente recente de RPS que incorpora uma poro sintonizável que pode ser alterada em tempo real. Aqui, nós utilizamos TRPS para monitorar os tempos de translocação de nanopartículas de ADN-modificado, enquanto atravessam a membrana de poro sintonizável como uma função da concentração de DNA e da estrutura (ou seja, de cadeia simples ao ADN de cadeia dupla).

TRPS baseia-se em dois eléctrodos de Ag / AgCl, separados por uma membrana de poros elastomérico que estabelece uma corrente iónica estável sobre um campo eléctrico aplicado. Ao contrário de várias tecnologias de caracterização de partículas ópticos à base, TRPS pode caracterizar partículas individuais entre uma amostra da população, permitindo amostras multimodais a ser analisado com facilidade. Aqui, demonstramos medidas de potencial zetavia velocidades de partículas de translocação de padrões conhecidos e aplicá-las a experimentar momentos de translocação de analitos, resultando assim na medição do potencial zeta dos analitos.

Bem como a aquisição de valores de potencial zeta médios, as amostras são todos medidos usando uma perspectiva de partícula-a-partícula exibindo mais informações sobre uma dada amostra através de distribuições população de amostra, por exemplo. De tal, este método demonstra potencial dentro de aplicações de detecção para ambos os campos médicos e ambientais.

Introdução

nanopartículas funcionalizadas estão se tornando cada vez mais popular como biossensores em ambos os campos médicos e ambientais. A capacidade de alterar a química de superfície de uma nanopartícula, com o DNA, por exemplo, está a revelar útil para sistemas de distribuição de drogas-alvo ^1, o controlo interações DNA-proteína ^2-4. Uma propriedade cada vez mais comum de nanopartículas sendo utilizado em bioensaios e na entrega de agentes terapêuticos é superparamagnetismo ^5. partículas superparamagnéticas (SPPS) são extremamente úteis na identificação e remoção de analitos específicos a partir de misturas complexas e podem fazê-lo com o simples uso de um único íman. Uma vez removido, as partículas ligadas a analitos podem ser caracterizados e analisados ​​apto para o efeito.

Os métodos anteriores utilizados para a detecção e caracterização de nanopartículas incluem técnicas ópticas, tais como dispersão de luz dinâmica (DLS), também conhecido como espectroscopia de correlação de fotões. Embora um oitécnica de transferência de GH, DLS está limitado a ser uma técnica de base média e ao analisar amostras multimodais, sem a adição de software especializado, as partículas maiores irão produzir um sinal muito mais dominante, deixando algumas das partículas menores completamente despercebido ^6,7. Partícula-a-partícula técnicas de caracterização são, portanto, muito mais favorável para analisar sistemas de nanopartículas funcionalizadas de nanopartículas e.

tecnologias baseadas RPS se baseiam em torno da aplicação de um campo eléctrico a uma amostra e de controlo do mecanismo de transporte das partículas através de um nanoporo sintético ou biológico. Uma técnica relativamente recente detecção de nanopartículas e caracterização com base em RPS é resistiva ajustável sensor de pulso (TRPS) ^8-16. TRPS é um sistema de dois eléctrodos separados por uma membrana de poros elastomérico, sintonizável. Um método de poro sintonizável permite a analitos de uma gama de ¹⁷ forma e tamanho para ser medido através do seu transmecanismos de portas através do poro. Poros sintonizáveis foram anteriormente utilizados para a detecção de partículas pequenas (70-95 nm de diâmetro) produzir resultados comparáveis a outras técnicas, tais como a espectroscopia electrónica de transmissão (MET) ^10. Quando um campo eléctrico é aplicado, uma corrente iónica é observada e medida que as partículas / moléculas de passar através do poro, eles bloqueiam temporariamente os poros, causando uma redução da corrente que pode ser definido como um "evento de bloqueio '. Cada evento de bloqueio é representativa de uma única partícula, para que cada partícula dentro de uma amostra pode ser caracterizado com base na magnitude individualmente bloqueio, Δ E largura a meia-máxima, FWHM, bem como outras propriedades de bloqueio. Analisando as partículas individuais que passam através de um nanoporo é vantajosa para amostras multimodais como TRPS pode com sucesso e eficazmente distinguir uma gama de tamanhos de partículas amonGST de uma única amostra. Sensor de pulso resistiva ajustável completa tamanho ^10, Potencial Zeta ^12,18 e concentração ¹⁵ medições simultaneamente em uma única corrida e, portanto, ainda pode diferenciar amostras de semelhante, se não o mesmo tamanho de sua carga de superfície ^19; uma vantagem sobre as técnicas de dimensionamento alternativos.

O potencial zeta é definido como o potencial electrostático no plano de corte ^20, e é calculada a partir de velocidades das partículas, enquanto atravessam um poro ^19. as medições do potencial zeta das partículas individuais, assim, dá conhecimento sobre os mecanismos de translocação e o comportamento dos sistemas de nanopartículas em solução, a informação valiosa para futuro ensaio de modelos de partículas para uma gama de aplicações. análise de partículas-a-partícula de tal natureza também permite a propagação e distribuição de valores de potencial zeta entre uma amostra da população a ser explorado, permitindo a mais informaçãocinética de reacção de N (de cadeia simples ao ADN de cadeia dupla, por exemplo) e estabilidades das partículas na solução a ser atingido.

Aqui, descrevemos uma técnica que detecta e caracteriza ambas as superfícies SPP não modificados e modificados-DNA. O protocolo aqui descrito é aplicável a uma variedade de nanopartículas inorgânicas e biológicos, mas que demonstram o procedimento usando superfícies modificadas-ADN devido à sua ampla gama de aplicações. A técnica permite que o utilizador para distinguir entre alvos de ADN de cadeia simples e de cadeia dupla numa superfície de nanopartículas, baseado em velocidades das partículas de translocação através de um sistema de poros e, consequentemente, os seus potenciais zeta.

Protocolo

1. Fazer a salina de tampão fosfato com Tween-20 (PBST) Tampão

1. Dissolve-se um comprimido PBS (tampão de fosfato 0,01 M, 0,0027 M cloreto de potássio, 0,137 M de cloreto de sódio, pH 7,4) em 200 ml de água desionizada (18,2 mohms cm).
2. Adiciona-se 100 ul (0,05 (v / v)%) de Tween-20 à solução 200 ml de tampão, como um tensioactivo.

2. Preparar o grupo carboxilo de poliestireno partículas Standards

1. Agitar as partículas de calibragem para 30 seg antes de sonicação durante 2 minutos a 80 watts para criar monodispersity das partículas.
2. Dilui-se a partículas de calibração 1 em 100 a uma concentração de 1x10 ¹⁰ partículas / ml em tampão PBST e vortex durante 30 seg.

3. preparação de partículas revestidas com estreptavidina

1. Agitar as partículas durante 30 segundos antes de sonicação durante 2 minutos a 80 watts a assegurar monodispersity.
2. Diluir as partículas revestidas com estreptavidina 1 em 100 em tampão PBST para achieve a consequente concentração de 1x10 ⁹ partículas / ml e vortex por 30 segundos.
   Nota: Um volume de amostra típico é de 200 uL. Por exemplo, se as concentrações de ADN a investigar cinco preparar 1 ml de partículas revestidas com estreptavidina diluídas.

4. Preparação de oligonucleótidos

1. Reconstituir oligonucleótidos com água desionizada para uma concentração resultante de 100 uM.

5. A adição de sonda de ADN de captura (CP) com as partículas revestidas com estreptavidina

1. Antes de ligação ao ADN, de vórtice as partículas revestidas com estreptavidina (200 ul de volume da amostra) durante 30 seg, seguido de 2 minutos de sonicação a 80 watts.
2. Com base na capacidade de ligação fornecidas pelo fornecedor (4352 pmol / mg), adicionar a concentração apropriada do DNA para as partículas resultantes para as concentrações de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140, e 210 nM de ADN.
3. Vortex as amostras para 10 segundos e coloque em uma roda giratória à temperatura ambientedurante 30 min para permitir o ADN se liguem às superfícies das partículas através de uma interacção estreptavidina-biotina.
4. Uma vez que o ADN de captura foi adicionado e incubou-se com as partículas revestidas com estreptavidina, remover o excesso de DNA na solução através de separação magnética, colocando as amostras sobre uma cremalheira magnética durante 30 min.
5. Remover o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o conjunto recém-formado de partículas mais próximas do ímã, e substituir com o mesmo volume de novos tampão PBST.

6. hibridação DNA complementar às CP-partículas

1. Adicionar a quantidade necessária de ADN alvo (em excesso a 500 nm) para assegurar o máximo de ligação foi alcançada alvo possível.
2. Agitar as amostras para 10 seg e o lugar numa roda rotativa à temperatura ambiente durante 30 min.
3. Uma vez que a hibridização estar completa, remover o excesso de ADN alvo através de separação magnética, colocando as amostras sobre uma cremalheira magnética durante 30 min.
4. Remover o sobrenadante, Tomando cuidado para não perturbar o conjunto recém-formado de partículas mais próximas do ímã, e substituir com o mesmo volume de novos tampão PBST.
5. Repita os passos 6.1 a 6.4 para amostras em duplicado e colocar essas amostras numa roda rotativa à temperatura ambiente durante 16 horas para investigar vezes de hibridação de ADN.

Setup 7. TRPS

1. Ligue o instrumento em um sistema de computador com software no lugar.
2. Calibrar o trecho inicial usando uma pinça.
   1. Medir a distância entre o exterior das duas maxilas paralelas.
   2. Entrada para o software digitando o estiramento no campo 'stretch' no separador 'Definições Instrumento "e clicando em" Calibrar trecho "sob a aba.
3. Lateralmente encaixar uma membrana nanopore de poliuretano de dimensionamento adequado para a análise sobre as mandíbulas com o número nanopore ID voltada para cima. Em seguida, esticar as mandíbulas para o estiramento necessário para análise, usando ocomando de ajuste de estiramento no lado do instrumento. Esticar as mandíbulas entre 43 e 48 mm.
   Nota: O valor exato do trecho é determinado ao lado de tensão aplicada de modo que os bloqueios de partículas de calibração são pelo menos 0,3 nA em tamanho. O trecho já está inserido no software na etapa 7.2 e irá ajustar automaticamente à medida que as mandíbulas são esticados.
4. Coloque 80 mL de tampão PBST na célula de fluido inferior, abaixo da nanopore, assegurando que não existem bolhas de presentes que podem afetar a medição. Se houver bolhas de visto, remover e substituir o tampão.
5. Clique na célula de fluido superior no lugar e colocar 40 ul de tampão para ele, novamente assegurando que não existem bolhas existentes. Se as bolhas estiverem presentes na célula de fluido superior, removê-los através da substituição do líquido.
6. Quando uma corrente de linha de base reprodutível foi alcançado a partir substituindo a célula superior fluido com tampão, adicionar 40 ul da amostra de fluido para a célula superior e medida clicando »rart 'no' guia de Aquisição de Dados "na tela do software.
   Nota: A aquisição de dados é concluída com uma frequência de 50 kHz, com limite de uma magnitude bloqueio inferior de 0,05 nA, embora esta possa ser alterada utilizando o software através da aba 'Data Analyse' (em "Configurações de análise" e "resistiva Bloqueios ') .
7. Coloque uma gaiola de Faraday sobre a parte superior do sistema de células de fluido para reduzir o ruído de fundo eléctrico sobre as medições.
8. Usar um módulo de pressão variável (VPM) para aplicar uma pressão de vácuo ou com as amostras.
   1. Para aplicar uma pressão externa conectar o bico para a célula de fluido superior, em seguida, girar o braço de pressão e clique no lugar (dependendo se uma pressão positiva (PRE) ou um vácuo (VAC) serão aplicadas).
   2. Aplique pressão em um 'cm' ou escala de 'mm' utilizando o botão de nível de pressão situado no topo da VPM. Pressione o botão para baixo para aplicar pressão sobre a escala 'cm' e puxe-o para cima to aplicar pressão sobre a escala de "mm".

8. As amostras preparando para Análise TRPS

1. amostras vortex durante 30 seg e sonicado durante 2 minutos a 80 watts antes da análise TRPS.

9. A calibragem do Nanopore para Análise Zeta

1. Depois de colocar 40 partículas de calibração ul (1x10 ¹⁰ partículas / ml) para dentro da célula de fluido superior, completar uma medição TRPS (configuração como no ponto 7) a 3 tensões aplicadas. Alterar a tensão clicando no '+' e '-' botões na escala de tensão na guia "Configurações Instrument" no software.
2. Verifique se as 3 tensões retornar correntes de cerca de 140, 110 de fundo, e 80 nA. Certifique-se de que, na média tensão das partículas de calibração produzir uma média magnitude bloqueio de pelo menos 0,3 nA.
3. Aplicar uma pressão de modo que a largura total média metade do valor máximo (FWHM) durações das partículas de calibração são pelo menos0,15 mseg. Fazer isso manualmente usando o braço de pressão ligado ao módulo de pressão variável. Select pressão (PRE) ou a vácuo (VAC), rodando o braço até que ele se encaixe na posição desejada e aplicar em conformidade seguinte configurar instruções no passo 7.8.2. Uma vez que estas condições foram alcançados, iniciar a execução clicando em 'start' no software no separador "Aquisição de Dados".
4. Concluir a execução pressionando 'stop' no separador "Aquisição de Dados" quando pelo menos 500 partículas foram medidos (ver "contagem de partículas" na parte inferior da tela do software durante a medição) ea corrida excedeu 30 segundos (ver " Run Time ', também em direção à parte inferior da tela).
5. Calibrar o sistema através do preenchimento de uma corrida de calibração conforme descrito cada vez que um novo nanopore é introduzido ou para cada novo dia de análise ao concluir a etapa 9,1-9,4.

10. Execução de uma Amostra

1. Executar os exemplos ao mais alto ousegunda tensão mais elevada, como as amostras de calibração no sentido de assegurar um semelhante (± 10 nA), se não for o mesmo, a corrente de linha de base.
   1. Uma vez que a corrente de linha de base apropriada é alcançada, substituir o electrólito na célula superior fluido com 40 ul de amostra. Quando uma amostra é introduzida, bloqueios será visto no traçado de sinal. Comece a amostra executar clicando em "Iniciar" no separador "Aquisição de Dados" e gravar um mínimo de 500 partículas (confira 'contagem de partículas' situado sob o sinal de rastreamento) e garantir o tempo de execução é um mínimo de 30 segundos (ver 'Run Time 'também situado abaixo do sinal de rastreamento).
   2. Para completar a medição, clique em 'stop' no 'guia de Aquisição de Dados "e salve o arquivo de dados.
2. Para salvar o arquivo, a entrada de informações de arquivos no seguinte formato; 'Investigação' é a pasta do arquivo será salvo em "Nanopore ID" é o número de série do poro sendo usado, 'Part #' ié o tipo de poros (ou seja, NP150 / NP200), "ID Amostra" é o nome da amostra, 'calibração ou amostras' detalhes se é uma medida de calibração ou amostra, «diluição» é utilizado se a amostra foi diluída ( digite 100 se a amostra foi diluída 100 vezes), "pressão" é a pressão aplicada à amostra (em cm - ver secção 7.8), 'Electrólito ID "é o nome do tampão da amostra é composta em, e' Notes "são quaisquer notas pessoais sobre a amostra ou correr.
3. Entre cada amostra de execução, o sistema de lavagem através da colocação de 40 ul de tampão PBST para dentro da célula de fluido superior várias vezes e aplicando diversas pressões (normalmente a -10, -5 cm (vácuo), e 5 e 10 cm (pressão positiva)) até sem mais eventos de bloqueio estão presentes, assegurando que não existem partículas residuais remanescentes no sistema e, portanto, nenhuma contaminação cruzada entre as amostras. amostras em triplicado com esta etapa de lavagem concluída entre cada amostra repeat executar, bem assiml como entre diferentes amostras.

Resultados

Figura 1. Representação esquemática dos processos de purificação magnética e uma medição de TRPS. A) Exemplo de purificação magnética da amostra de partida com uma amostra contendo excesso, o ADN sonda de captura não ligado. B) PG exemplo de medição i) partículas que passa através do nanoporos e ii) evento bloqueio produzido a partir de partículas oclusão temporária iões...

Discussão

O cálculo do potencial zeta usado um método baseado calibração relacionados ao trabalho por Arjmandi et al. ^21. A duração da translocação de partículas, enquanto atravessam um nanoporo é medida como uma função da tensão aplicada, utilizando um campo médio de partícula e velocidades eléctricos sobre a totalidade de uma poro cónica regular. A mobilidade electroforética é o derivado de 1 / T (em que T é a duração do bloqueio) em relação à tensão, multiplicado pelo quadrado do comprimento da zona de dete...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 comprimido dissolvido em 200  ml de água deionizada para fazer solução tampão.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0,05% (v/v) em tampão PBS como surfactante
Nanopartículas de poliestireno carboxila	Bangs Laboratories, US	CPC200	Diâmetro nominal de 220  nm, concentração bruta de 1 x 1012 partículas/ml, carga superficial específica de 86 µ eq/g (equivalente a uma densidade de carga superficial de 3,2 x 1019 C/nm2.
Nanopartículas revestidas com estreptavidina	Ademtech, França	3121	O lote tinha capacidade de ligação de 4.352 pmol/mg (capacidade teórica de ligação ao DNA de 188 nM) a uma concentração bruta de 1,1 x 1011 partículas/ml.
Oligonucleotídeos biotinilados	Sigma Aldrich, Reino Unido	VC00001	Especificações do fornecedor: Purificação reversa da fase 1 (escala de 0,05); Modificação da biotina na extremidade 3'; Pós liofilizados reconstituídos a 100  µ M usando água deionizada e diluída conforme necessário. Sequências: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]
3'Olignonucleotídeos padrão	Sigma Aldrich, Reino Unido	VC00001	Especificações do fornecedor: Purificação reversa da fase 1 (escala 0,05); Pós liofilizados reconstituídos a 100 µ M usando água deionizada e diluída conforme necessário. Sequências de alvos de DNA: Totalmente complementares - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Encadernação intermediária - 5'GTAGTGAGGT3', Encadernação final - 5'GTTTAACCAT3', Saliência parcialmente complementar - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Pressão inerente ao sistema de 47  Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Cada 'cm' de pressão equivale a aproximadamente 100 Pa.
Membranas de nanoporos de poliuretano	Izon Science, NZ	NP150	Faixa de tamanho do analito 60-480 nm, diâmetro do poro calculado em 799 nm a um trecho de 45 mm.
Magrack 6	GE Healthcare, Reino Unido	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, Reino Unido	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Alemanha	0003365000
Roda Rotativa	Labnet International, EUA	H5500-230 V