Determinação do Potencial Zeta de nanopartículas de translocação através de velocidades por meio de um Tunable Nanopore: Utilizando partículas modificadas-ADN como um Exemplo

Resumo

Aqui usamos um nanoporo sintonizável poliuretano integrados em uma técnica de detecção de impulsos resistiva para caracterizar nanopartículas química da superfície por meio da medição das velocidades das partículas de translocação, que pode ser usado para determinar o potencial Zeta de nanopartículas individuais.

Resumo

tecnologias Nanopore, conhecidos coletivamente como resistivas sensores de pulso (RPS), estão sendo usados ​​para detectar, quantificar e caracterizar proteínas, moléculas e nanopartículas. detecção de impulsos resistiva ajustável (TRPS) é uma adaptação relativamente recente de RPS que incorpora uma poro sintonizável que pode ser alterada em tempo real. Aqui, nós utilizamos TRPS para monitorar os tempos de translocação de nanopartículas de ADN-modificado, enquanto atravessam a membrana de poro sintonizável como uma função da concentração de DNA e da estrutura (ou seja, de cadeia simples ao ADN de cadeia dupla).

TRPS baseia-se em dois eléctrodos de Ag / AgCl, separados por uma membrana de poros elastomérico que estabelece uma corrente iónica estável sobre um campo eléctrico aplicado. Ao contrário de várias tecnologias de caracterização de partículas ópticos à base, TRPS pode caracterizar partículas individuais entre uma amostra da população, permitindo amostras multimodais a ser analisado com facilidade. Aqui, demonstramos medidas de potencial zetavia velocidades de partículas de translocação de padrões conhecidos e aplicá-las a experimentar momentos de translocação de analitos, resultando assim na medição do potencial zeta dos analitos.

Bem como a aquisição de valores de potencial zeta médios, as amostras são todos medidos usando uma perspectiva de partícula-a-partícula exibindo mais informações sobre uma dada amostra através de distribuições população de amostra, por exemplo. De tal, este método demonstra potencial dentro de aplicações de detecção para ambos os campos médicos e ambientais.

Introdução

nanopartículas funcionalizadas estão se tornando cada vez mais popular como biossensores em ambos os campos médicos e ambientais. A capacidade de alterar a química de superfície de uma nanopartícula, com o DNA, por exemplo, está a revelar útil para sistemas de distribuição de drogas-alvo ^1, o controlo interações DNA-proteína ^2-4. Uma propriedade cada vez mais comum de nanopartículas sendo utilizado em bioensaios e na entrega de agentes terapêuticos é superparamagnetismo ^5. partículas superparamagnéticas (SPPS) são extremamente úteis na identificação e remoção de analitos específicos a partir de misturas complexas e podem fazê-lo com o....

Protocolo

1. Fazer a salina de tampão fosfato com Tween-20 (PBST) Tampão

1. Dissolve-se um comprimido PBS (tampão de fosfato 0,01 M, 0,0027 M cloreto de potássio, 0,137 M de cloreto de sódio, pH 7,4) em 200 ml de água desionizada (18,2 mohms cm).
2. Adiciona-se 100 ul (0,05 (v / v)%) de Tween-20 à solução 200 ml de tampão, como um tensioactivo.

2. Preparar o grupo carboxilo de poliestireno partículas Standards

1. Agitar as partículas de calibragem para 30 seg antes de sonicação durante 2 minutos a 80 watts para criar monodispersity das partículas.
2. Dilui-se a partículas de calibração 1 em 100 a uma concentração....

Resultados

Figura 1. Representação esquemática dos processos de purificação magnética e uma medição de TRPS. A) Exemplo de purificação magnética da amostra de partida com uma amostra contendo excesso, o ADN sonda de captura não ligado. B) PG exemplo de medição i) partículas que passa através do nanoporos e ii) evento bloqueio produzido a partir de partículas oclusão temporária .......

Discussão

O cálculo do potencial zeta usado um método baseado calibração relacionados ao trabalho por Arjmandi et al. ^21. A duração da translocação de partículas, enquanto atravessam um nanoporo é medida como uma função da tensão aplicada, utilizando um campo médio de partícula e velocidades eléctricos sobre a totalidade de uma poro cónica regular. A mobilidade electroforética é o derivado de 1 / T (em que T é a duração do bloqueio) em relação à tensão, multiplicado pelo quadrado do comprimento da zona d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 comprimido dissolvido em 200  ml de água deionizada para fazer solução tampão.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0,05% (v/v) em tampão PBS como surfactante
Nanopartículas de poliestireno carboxila	Bangs Laboratories, US	CPC200	Diâmetro nominal de 220  nm, concentração bruta de 1 x 1012 partículas/ml, carga superficial específica de 86 µ eq/g (equivalente a uma densidade de carga superficial de 3,2 x 1019 C/nm2.
Nanopartículas revestidas com estreptavidina	Ademtech, França	3121	O lote tinha capacidade de ligação de 4.352 pmol/mg (capacidade teórica de ligação ao DNA de 188 nM) a uma concentração bruta de 1,1 x 1011 partículas/ml.
Oligonucleotídeos biotinilados	Sigma Aldrich, Reino Unido	VC00001	Especificações do fornecedor: Purificação reversa da fase 1 (escala de 0,05); Modificação da biotina na extremidade 3'; Pós liofilizados reconstituídos a 100  µ M usando água deionizada e diluída conforme necessário. Sequências: CP 5'ATGGTTAAACCTCACTAC GCGTGGC[Btn]
3'Olignonucleotídeos padrão	Sigma Aldrich, Reino Unido	VC00001	Especificações do fornecedor: Purificação reversa da fase 1 (escala 0,05); Pós liofilizados reconstituídos a 100 µ M usando água deionizada e diluída conforme necessário. Sequências de alvos de DNA: Totalmente complementares - 5'GCCACGCGTAGTGA GGTTTAACCAT3', Encadernação intermediária - 5'GTAGTGAGGT3', Encadernação final - 5'GTTTAACCAT3', Saliência parcialmente complementar - 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Pressão inerente ao sistema de 47  Pa
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Cada 'cm' de pressão equivale a aproximadamente 100 Pa.
Membranas de nanoporos de poliuretano	Izon Science, NZ	NP150	Faixa de tamanho do analito 60-480 nm, diâmetro do poro calculado em 799 nm a um trecho de 45 mm.
Magrack 6	GE Healthcare, Reino Unido	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, Reino Unido	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Alemanha	0003365000
Roda Rotativa	Labnet International, EUA	H5500-230 V