Medição de In Vitro Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

Resumo

Este relatório descreve um ensaio in vitro para medir a atividade de integração associada ao complexo de pré-integração (PIC) do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) nos extratos citoplasmáticos de células agudamente infectadas. A integração do DNA do HIV-1 associado a PIC no DNA alvo heterólogo é quantificada usando uma estratégia de reação em cadeia da polimerase em tempo real aninhada.

Resumo

proteínas de HIV-1 envelope envolver receptores cognatos na superfície da célula-alvo, o que leva a fusão da membrana da célula virai seguida pela libertação do núcleo da cápside virai (CA) para o citoplasma. Subsequentemente, a transcriptase reversa virai (RT), como parte de um complexo homónimo nucleoproteína denominado o complexo Transcrição Reversa (RTC), converte o genoma de ARN viral de cadeia simples em uma cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Isto leva a biogénese de outro complexo de nucleoproteínas, denominado o complexo de pré-integração (PIC), composto do vDNA e proteínas de vírus associados e factores do hospedeiro. A integrase viral associada-PIC (EM) orquestra a integração do vDNA no ADN cromossómico do hospedeiro em um processo de duas etapas espacialmente e temporalmente regulado. Em primeiro lugar, o nos processos de extremidades 3 'do vDNA no citoplasma e, em segundo lugar, após o PIC trafica para o núcleo, que medeia a integração do vDNA processado no ADN cromossómico. Os PICs isoladoa partir de células-alvo infectados de forma aguda com HIV-1 são funcionais in vitro, uma vez que são competentes para integrar o vDNA associado num ADN alvo heterólogo adicionado exogenamente. Tal-PIC com base em ensaios in vitro de integração têm contribuído significativamente para delinear os detalhes mecanicistas de integração retroviral e descobrindo em inibidores. Neste relatório, nós elaboramos sobre um ensaio PIC HIV-1 actualizado que emprega uma estratégia baseada aninhada em tempo real Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR) para medir a atividade de integração in vitro de PICs nativas isoladas.

Introdução

Replicação de HIV-1 na célula alvo envolve vários passos, agrupadas em duas fases: eventos precoces e tardias. Os eventos iniciais começam quando o HIV-1 liga-se a sequência do receptor de superfície da célula alvo CD4 e um dos dois co-receptores (CCR5 ou CXCR4) ^1. Por conseguinte, o fusível membranas de células com vírus, e a cápside virai (CA) do núcleo é libertado para o citoplasma ^2. O núcleo CA contenha o ARN virai genómico de cadeia simples (ssRNA) e várias proteínas, tanto virais e celulares na origem. As proteínas virais associadas-CA incluem Transcriptase Reversa (RT) e da integrase (IN), duas enzimas que medeiam passos críticos durante eventos precoces da replicação viral. A RT e IN função no contexto de complexos nucleoproteicos, nomeadamente a transcrição reversa Complexo (RTC) e o complexo de pré-integração (PIC), respectivamente ^{3, 4, 5 , 6. As extremidades do genoma viral ssRNA terminal do porto de repetição (R) elementos adjacentes às sequências U5 única (na extremidade 5 ') e U3 (na extremidade 3'). O RTC converte o genoma viral num ssRNA (DS) de cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Este processo de transcrição reversa também resulta na duplicação das sequências U5 e U3, gerando, assim, repetições terminais longas (LTR) em ambas as extremidades do vDNA 7, 8. Subsequentemente, o EM-associado PIC catalisa duas reacções bioquímicas sequenciais que permitem a integração do vDNA no cromossoma do hospedeiro 9, 10, 11. Em primeiro lugar, no citoplasma, EM multímeros envolver ambas as LTRs 12 e clivar um dinucleótido de cada uma das extremidades 3 '-terminal. Este processamento de extremidade 3 'gera um grupo hidroxilo em cada extremidade 3' (CA _OH) do vDNA.Em seguida, o PIC trafica para o núcleo, em que utiliza o vDNA CA _OH como um nucleófilo para cortar ambas as cadeias do ADN cromossómico de forma escalonada. Simultaneamente, EM coordenadamente emendas de ambas as extremidades do vDNA para as ligações fosfodiéster que resultam em cadeias opostas do ADN cromossómico. Após este passo de transferência de cadeia, a maquinaria da célula hospedeira remove os dois nucleótidos desemparelhados nas extremidades 5 'do vDNA e repara as consequentes lacunas de cadeia simples na junção do local de integração. Os eventos iniciais, assim, culminar com a criação de uma cópia de DNA integrado (provírus) do HIV-1 genoma. O provírus proporciona um ambiente apropriado para a expressão do gene virai eficiente, o que inicia os eventos posteriores, incluindo a expressão das proteínas codificadas por vírus; montagem do vírus imaturo; e brotação, release, e maturação em viriões infecciosos 13.}

Purificada IN retroviral recombinante é competente pararealizar, in vitro, ambas as atividades de processamento e transferência de cadeia 3'-end em exogenamente fornecido DNA substrato LTR-like. Os estudos bioquímicos usando tais IN recombinante purificada revelaram aspectos críticos da integração vDNA ^{14, 15, 16, 17.} No entanto, ao contrário da infecção natural, esta reacção bioquímica in vitro não suporta integração combinada de ambas as extremidades do ADN substrato para a DNA-alvo. Em contraste, os PICs retrovirais isolados a partir de células infectadas de forma aguda concertadamente integrar ambas as extremidades do vDNA endógena no ADN alvo heterólogo. Isto levou à adopção generalizada e refinamentos subsequentes de ensaios in vitro Integração (IVI) I n usando PICs nativas isoladas.

No primeiro ensaio relatado retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas com um recombinante de murinoVírus da Leucemia (MLV) que alberga o gene de E. coli supF na sua LTR serviu como fonte de actividade em, e o ADN de um fago lambda mutante defeituoso no crescimento lítico foi fornecido exogenamente como o ADN alvo. A integração bem sucedida do ADN recombinante MLV copiar para o ADN de fago e a expressão consequente supF levou a restauração da capacidade de formação de placas de fagos recombinantes. No entanto, esta estratégia experimental é a integração trabalhoso e medidas de forma indireta. Para lidar com estas advertências, um ensaio de marcação terminal indirecta à base de Southern blot, que quantifica a actividade associada IVI-PIC como uma medida da vDNA endógena exógeno integrado no bacteriófago linearizado phiX174 ADN, foi desenvolvido ^{6, 7, 18.} Embora este método proporciona uma medida directa de eventos de integração, quantidades relativamente elevadas de preparação PIC são necessários, o que continua a ser um desafio técnicoesforço. Para contornar isso, aninhados ensaios baseados em PCR que exigem apenas quantidades modestas de PICs foram desenvolvidos ^{4, 5, 19.}

Neste relatório, nós descrevemos uma versão atualizada de um nested PCR baseado no método in vitro concebido para recapitular a atividade de integração do HIV-1 PIC-mediada que ocorrem durante a infecção natural. Este método utiliza os extractos citoplasmáticos de células alvo de HIV-1-infectadas como uma fonte de actividade PIC endógena, que é medido com um tempo real Polimerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Os procedimentos para isolar PICs e medir suas atividades de integração são adaptados, com modificações, a partir de protocolos publicados pelo laboratório Engelman ^20. Neste método, a actividade de integração associada-PIC é iniciado, fornecendo um ADN alvo exógeno linear ^21, e os produtos de DNA resultantesesta reacção integração são purificados e utilizados como material de partida para a quantificação baseado no PCR subsequente. Na primeira ronda de PCR convencional, as junções de ADN viral-alvo são amplificados utilizando iniciadores apropriados. Na segunda rodada qPCR, primers específicos de LTR são usadas para enriquecer especificamente a população vDNA do primeiro turno produtos de PCR. Por favor, consulte a seção de protocolo para uma descrição detalhada deste método.

Estudos in vitro com PICs retrovirais têm conduzido a avanços significativos na compreensão do mecanismo de integração de ADN retroviral e no desenvolvimento de inibidores de NOS. Com base na recente foco maior sobre mapeamento de HIV-1 sites de integração, determinar o papel dos fatores virais e do hospedeiro na HIV-1 integração e desenvolvimento de novas drogas antivirais para o combate à resistência aos medicamentos, prevemos um aumento do interesse e uso generalizado de ensaios IVI , como o descrito no presente relatório. Este, por sua vez, levará afuturos aperfeiçoamentos no método, diversificando assim o alcance de suas aplicações.

Protocolo

Produção 1. Vírus

NOTA: Para gerar títulos elevados de VIH-1 infeccioso, transfectar a linha celular de rim embrionário humano (HEK) 293T com um clone molecular infeccioso do HIV-1 usando um reagente de transfecção à base de dendrímero activado. Tem sido observado que o método de transfecção com fosfato de cálcio produz resultados comparáveis.

1. Em um laboratório de Segurança Biológica Nível 2 (BSL2), semente de 3 x 10 ⁶ 293T células por placa de 10 cm em 8 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), penicilina e estreptomicina. Cultura das células numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO ₂ O / N.
2. No dia seguinte, as células para transfecção em cada placa de 10 cm, dilui-se 8 ug de DNA do plasmídeo pNL4-3 (ver Materiais Tabela) a um volume final de 300 ul de DMEM sem soro e antibióticos. Adicionar 80 ul de reagente de transfecção, misturar bem por pipetagem, e incubar à TA durante5 - 10 min para a formação do complexo de transfecção.
3. Remover o meio das placas por aspiração e adiciona 7 ml por placa de meio DMEM fresco contendo soro e antibióticos.
4. Adicionar 1 ml de DMEM contendo soro e antibióticos para o complexo de transfecção, misturar por pipetagem, e adicionar esta mistura para as células. Agite suavemente o prato para facilitar a distribuição uniforme dos complexos de transfecção.
5. Imediatamente transferir as células para o laboratório BSL3, lugar numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2, e a cultura das células durante 48 h.
6. Recolhe-se o sobrenadante da cultura de tecido contendo vírus, utilizando uma pipeta e, em seguida, transferi-lo para um tubo de centrífuga. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min para sedimentar as células e detritos, e, em seguida, filtrar o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 um tamanho de poro.
7. Para eliminar qualquer ADN plasmídico transição nesta preparação de vírus livre de células, trata-se com ADNase 1 (20 ug / ml) a 37 ° C durante 1 h.
8. Para quantificar aHIV-1 título, utilizar o enzyme-linked Immunosorbent Assay específicos de p24 (ELISA), como é um método rápido e propícios para uso rotineiro ^22.
   NOTA: Deve-se notar que o ensaio ELISA de p24 mede o título física (número de partículas de vírus). Alternativamente, a medição da actividade associada ao vírus RT (ensaio de RT exógeno) ou de infecciosidade do vírus (ensaios de infecciosidade baseados em linha de célula indicadora TZM-bl) irá fornecer leitura exclusiva de partículas de vírus infecciosas.

2. Infecção do vírus de células Sup-T1 (BSL3 Lab)

1. Num laboratório BSL2, manter as células SUP-T1 entre 1,0 x 10 ⁶ e 2,0 x 10 ⁶ células / ml em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de FBS inactivado pelo calor, penicilina e estreptomicina (razão de divisão de 1 : 2 a cada 2-3 d). Reunir as células SUP-T1 a partir dos frascos de cultura, misturar bem por pipetagem, e determinar a contagem de células viáveis ​​utilizando um hemacitómetro e a exclusão de azul de tripano rMétodo aining.
   1. Prepara-se o número necessário de partes alíquotas de 80 x 10 ⁶ células (por infecção pelo vírus) em 50 ml de tubos de centrífuga cónico.
   2. Centrifugar as células em um rotor de balde a 500 xg e 25 ° C durante 5 min. Sem remover o meio de cultura celular, transferir os tubos contendo as células peletizadas para o laboratório BSL3 para processamento adicional. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura de células a partir do tubo, sem perturbar o sedimento celular.
2. Adicionar uma quantidade apropriada de inoculo de vírus tratada com ADNase I para as células no tubo e misturar bem por pipetagem suave. Durante 80 x 10 ⁶ células, utilizar 30 ml de vírus tratada com ADNase I (50 ug de p24-vírus equivalente).
   NOTA: Isolamento de PICs funcional requer infectar as células-alvo com muito altas multiplicidades de infecção (MOI).
3. Distribua a mistura uniformemente entre duas placas de cultura de tecidos de 6 poços (ou seja, 12 alíquotas x 2,5 ml; usar 2 placas por infectaríon).
4. Para spinoculation, colocar as placas de cultura em suportes de pratos, e centrífuga utilizando um rotor basculante a 480 xg e 25 ° C durante 2 h.
5. Incubar as células a 37 spinoculated ° C e 5% de CO ₂ durante 5 h.

3. colheita e lise de células infectadas (laboratório BSL3)

1. Reunir as células correspondentes a cada infecção a partir das placas de cultura para um tubo de 50 mL cónico de centrifugação (~ 30 mL no total).
2. Colher as células por centrifugação a 300 xg e 25 ° C durante 10 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo (em alternativa, usar uma pipeta).
3. Para remover todas as partículas virais residuais, lavar cada pelete de células por adição de 2 ml de tampão de K ^{- / -} (KCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,6, 5 mM de _MgCl2) e centrifugando a amostra a 300 xg e 25 ° C durante 10 min. Em seguida, sem perturbar o sedimento, remover cuidadosamente o sobrenadante por aspiração ou usando uma pipeta.
4. REPEAt passo 3.3.
5. Cuidadosamente remover qualquer tampão residual, utilizando uma micropipeta. Ressuspender cada pelete de células em 2 ml de gelo-frio de tampão de lise ^de K ^{+ / +} (tampão de K ^- / ^- suplementado com 0,025% de digitonina, DTT 1 mM, 20 ug / ml de aprotinina), misturar o conteúdo por pipetagem suave, e transferir para um 2 mL tubo de microcentrífuga.

4. Preparação de PICs Citoplasmáticas (laboratório BSL3)

1. Balançar as amostras num agitador rotativo à temperatura ambiente durante 10 min.
2. Centrifugar as amostras, com o rotor pré-arref ecido a 4 ° C, a 1.500 xg e 4 ° C durante 4 min.
3. Sem perturbar o sedimento, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e centrifuga-se a 16.000 xg e 4 ° C durante 1 min.
4. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação fresco. Adicionar RNase A (20 mg / ml) para uma concentração final de 20 ug / mL (2 mL para 2 mL de PICs) e incuba-se o conteúdo à TA durante 30 minutos (sem balanço).
5. Adicionar sacarose (60% w / v em tampão de K ^{- / -)} para uma concentração final de 7% e misturar bem por pipetagem suave. Preparar alíquotas (por exemplo, 200? L) de PICs em tubos de microcentrífuga, de flash por congelação em azoto líquido, e colocar num congelador de -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

5. In Vitro Integração (IVI) Ensaios Usando HIV-1 PICs

1. Prepara-se o ADN alvo utilizado no ensaio IVI por amplificação de uma região de 2,0 kb do DNA de plasmídeo com phiX174 PCR utilizando iniciadores feitos por medida, phiX174-F e phiX174-R.
   1. Montar a mistura de PCR como descrito na Tabela 1. Executar PCR num termociclador utilizando as condições de ciclos térmicos recomendadas na Tabela 2. Gel-purificar o produto de PCR utilizando um kit de purificação em gel (seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante), e armazenar o ADN alvo purificado como alíquotas a -80 ° C até à sua utilização.
2. Adicionar 600 ng de ADN alvo de 200 - & #181; L alíquota de PICs, misturar bem e incubar a 37 ° C durante 45 min.
   Nota: As reacções IVI omitindo ADN alvo ou incluindo um inibidor de integrase (por exemplo, raltegravir) são recomendados reacções de controlo.
3. Parar a reacção por adição de IVI de SDS, EDTA e proteinase K para concentrações finais de 0,5%, 8 mM e 0,5 mg / mL, respectivamente. Misturar os conteúdos da reacção bem e incubar durante a noite a 56 ° C.
4. No dia seguinte, purificar o ADN total a partir da reacção IVI por extracção com fenol / clorofórmio e precipitação com etanol. Realizar todas as etapas de centrifugação a 16.000 xg e RT.
5. Adicionar um volume igual de fenol com a amostra desproteinizado, mistura-se vigorosamente por vortex e centrifugação durante 2 min. Cuidadosamente remover a fase aquosa superior e transferi-lo para um tubo fresco.
6. Repita o passo 5.5. Transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco.
7. Adicionar um volume igual de 1: 1 fenol: mistura de clorofórmio, mistura-se vigorosamente por vortex, centrifugação e foR 2 min. Transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco.
8. Adicionar um volume igual de clorofórmio, mistura-se vigorosamente em vortex, e centrifuga-se durante 2 min. Transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco.
9. Para precipitar o DNA, adicionar glicogénio a uma concentração final de 0,1 mg / mL, 3 M de acetato de sódio a uma concentração final de 0,3 M e 2,5 volumes de etanol a 100% (arrefecido com gelo). Vortex para misturar, brevemente centrífuga para recolher o conteúdo, e colocar o tubo à temperatura de -80 ° CO / N.
10. No dia seguinte, centrifugar a amostra durante 30 min a 16000 xg e 4 ° C durante 30 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
11. Adicionar 500 ul de etanol a 80% (arrefecido com gelo) ao sedimento e centrifuga-se a 16.000 xg e 4 ° C durante 10 min. Secar o sedimento de DNA à TA e ressuspender completamente em 50 ul de água isenta de nuclease. Armazenar as amostras de ADN a -20 ° C.

6. Os ensaios de PCR para quantificar PIC Atividade

NOTA: O número de cópias de ADN de HIV-1 integrado no ADN alvo é quantificada por uma estratégia de PCR aninhada que emprega 2 conjuntos de iniciadores e 2 rondas sequenciais de PCR.

1. Realizar a primeira ronda de PCR convencional utilizando iniciadores de segmentação da LTR viral e o ADN phiX174 (iniciadores LTR e phiX174, respectivamente) para amplificar as junções do ADN integrado de HIV-1.
   1. Monte da mistura de PCR da primeira rodada tal como descrito na Tabela 3. Montar uma mistura principal de todos os componentes, excluindo o ADN molde, dispensar-se alíquotas de 45 uL para dentro de tubos de PCR separadas, e adicionam-se 5 ul de DNA molde ou água livre de nuclease (controlo).
   2. Executar PCR num termociclador utilizando as condições de ciclos térmicos recomendadas na Tabela 4.
2. Realizar a segunda rodada qPCR utilizando iniciadores que ladeiam uma pequena região do LTR viral (LTR-R e primers LTR-U) para amplificar seletivamente as sequências vDNA integrados do primeiro-round produtos de PCR. Para determinar os números de cópias integradas vDNA, gerar uma curva padrão, utilizando 10x diluições em série de números de cópias conhecidos (por exemplo, 10 ⁰ - 10 ⁸⁾ do clone molecular de VIH-1.
   1. Montar a mistura qPCR segunda rodada, conforme descrito na Tabela 5. Montar uma mistura principal de todos os componentes, excluindo o ADN molde, cuidadosamente dispensar 25 mL alíquotas para um número adequado de poços em um de 96 poços de PCR placa de reacção, e, em seguida, adicionam-se 5 mL da primeira ronda não purificada produtos de PCR ou água livre de nuclease (ao controle). Executar todas as reações de qPCR em triplicado.
   2. Carregar a placa de PCR para o equipamento de PCR em tempo real e efectuar qPCR utilizando as condições de ciclização recomendadas na Tabela 6.
   3. Analisar os dados utilizando um software adequado.

Resultados

O isolamento do VIH-1 PICs

Um esquema do protocolo usado para o isolamento de PICs do VIH-1 a partir de células SUP-T1 infectados de forma aguda é representada na Figura 1. Este protocolo é derivado a partir dos métodos descritos por Engelman et ai. ^{19, 20.} PICs do VIH-1 são complexos nucleoproteicos que são montados em célula...

Discussão

análises bioquímicas de PICs retrovirais têm proporcionado uma visão crítica sobre o mecanismo de integração do DNA retroviral. Medição da actividade de integração de PICs retrovirais pode ser conseguida por ensaio de placas de formação, a análise de mancha de Southern, e nested qPCR. A estratégia experimental do ensaio de placa é trabalhoso e utiliza um método indirecto para medir a integração ^{6, 7, 18.} Integração ensaios medi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soro Fetal Bovino (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Soro Fetal Bovino Inativado por Calor (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 meio	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Tripsina-EDTA (0,25%)	GIBCO/Invitrogen <	p>25200-056
Penicilina-Estreptomicina solução (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T células (293T)	Coleção Americana de Cultura de Tipo (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 clone molecular proviral pNL4-3	NIH Programa de Pesquisa e Reagente de Referência em AIDS	114
Reagente de transfecção PolyFect	Qiagen	301107
DNase 1	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Células Sup-T1	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-1942
HEPES pH 7,2 - 7,5 < p>(solução pronta para uso)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Solução de cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich<	p>60142
>2<>	Sigma-Aldrich	M1028
Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinina	Sigma-Ald	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 DNA da Forma Replicativa 1	Promega	D1531
< >< u> PhiX174-F primer: < / u>< / p> 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'	Invitrogen e/ou IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polimerase	Promega	M3005
Qiaquick kit de extração de gel	Qiagen	28706
Água destilada ultrapura	Invitrogen	10977-015
tampão Tris-EDTA (TE) (100x)	Sigma-Aldrich	T9285
Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Solução de ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico (EDTA), 0,5 M, pH 8,0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (20 mg/mL de solução pronta para uso)	Qiagen	19131
Fenol (equilibrado com 10  mM Tris HCl, pH  8.0 e 1  mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	288306
Glicogênio (solução de 5 mg/mL)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Acetato de sódio (3 M, pH 5,2)	Sigma-Aldrich	S7899
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Primeira rodada LTR primer: 5'-GTGCGCGCTTCTCAGCAAGCAAG-3' Primeira rodada phiX174 primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'	Invitrogen e/ou IDT-DNA	---
Segunda rodada LTR-R primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Segunda rodada LTR-U primer: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Segunda rodada de investigação Taqman:   5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3'	Invitrogen e/ou IDT-DNA	---
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862