Artigo de método

A esporulação eficiente dos Saccharomyces cerevisiae Num Multiwell Format 96

DOI:

10.3791/54584

⸱

17 de setembro de 2016

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

Neste artigo

Resumo

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Aqui, a esporulação de Saccharomyces cerevisiae é realizada em um formato de 96 multipoços.

Resumo

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Durante períodos de estresse nutricional, Saccharomyces cerevisiae sofre gametogênese, conhecida como esporulação. Células de levedura diplóides que estão famintas por nitrogênio e carbono iniciarão o processo de esporulação. O processo de esporulação inclui meiose seguida de formação de esporos, onde os núcleos haplóides são empacotados em esporos resistentes ao meio ambiente. Desenvolvemos métodos para a esporulação eficiente de leveduras em 96 placas multipoços, para aumentar o rendimento da triagem de células de levedura para fenótipos de esporulação. Esses métodos são compatíveis com a triagem com leveduras contendo plasmídeos que requerem seleção nutricional, quando o meio mínimo apropriado é usado, ou com a triagem de leveduras com alterações genômicas, quando um regime de pré-esporulação rico é usado. Descobrimos que, para este método, a aeração durante a esporulação é crítica para a formação de esporos e desenvolvemos técnicas para garantir aeração suficiente que são compatíveis com o formato de placa multipoços 96. Embora esses métodos não atinjam o nível típico de ~ 80% de esporulação que pode ser alcançado em experimentos baseados em frascos de grande volume, esses métodos atingirão de forma confiável cerca de 50-60% de nível de esporulação em placas multipoços de pequeno volume.

Introdução

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Esporulação na levedura de brotamento foi estudado para fornecer insights sobre muitos aspectos da biologia, incluindo o controle da segregação cromossômica durante a meiose 1, os mecanismos de recombinação genética 2, o controle do desenvolvimento de sinalização celular 3, controle nutricional do desenvolvimento 4, a transcrição regulação do desenvolvimento 5, eo exame de formação de esporos 6. A formação de esporos inclui um evento de divisão celular romance que envolve a formação de novos compartimentos membranares dentro da célula mãe, seguido pela deposição de uma parede de esporos 6 protectora. Estes estudos que examinam as células esporuladas muitas vezes tirar proveito da estirpe de levedura rapidamente esporulantes SK1, que pode sofrer o processo de esporulação em cerca de 24 horas de um modo relativamente eficiente 7,8. Embora a optimização das condições de esporulação de brotamento de levedura foram descritas 9-13, estes experimentos examinados esporulação em meios sólidos ou em culturas líquidas de maior escala, onde a esporulação é efectuada utilizando tubos de cultura ou frascos.

Descrevemos aqui um método para a esporulação de levedura num formato de placa de poços múltiplos 96. Nós achamos que para este método, aeração é crítica para a esporulação síncrona e eficiente, e desenvolveram técnicas para garantir a esporulação suficiente um formato com vários poços de pequeno volume. Esporulantes num formato de 96 placa de poços múltiplos permite a células a ser rastreada utilizando técnicas de alto rendimento e reagentes optimizados para um formato de placa de poços múltiplos, tais rastreio de supressores elevado de cópias usando uma biblioteca de azulejos 14-16.

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Protocolo

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1. Preparação para a esporulação

Nota:. Os meios de comunicação descritos neste protocolo são feitas usando receitas e métodos padrão 13,17 Tabela 1 dá a formulação para 1 L de vários meios de comunicação utilizados neste protocolo.

Bacto Peptona Extracto de levedura Bacto Agar Dextrose acetato de potássio glicerina ddH2O
placas YPG 20 g 10 g 20 g - - 30 ml 970 ml
placas de YPD 20 g 10 g 20 g 20 g - - 1.000 ml
líquido YPD 20 g 10 g - 20 g - - 1.000 ml
líquido YPA 20 g 10 g - - 20 g - 1.000 ml
meios de esporulação - - - - 10 g - 1.000 ml

Tabela 1:. Formulações de mídia Valores são dadas por 1 L de mídia. Detalhes sobre a mídiaingredientes pode ser encontrada na Tabela Materiais.

  1. Se todas as células esporulação será o mesmo genótipo, siga este procedimento:
    1. Thaw cepa de levedura para ser usado em um (YPGlycerol) placa YPG. Cresça levedura durante 12-16 h a 30 ° C. Importante, as células SK1 também estão prestes a esporular, de modo estirpes SK1 não deve ser deixado muito tempo em placas de YPG, ou eles podem esporular na placa.
      Nota: Uma estirpe recentemente descongelado cultivadas em YPG é preferido, como a utilização de glicerol como fonte de carbono requer a fosforilação oxidativa, e assim selecciona para células que têm o DNA mitocondrial funcional. células SK1 têm uma tendência a perder DNA mitocondrial funcional e tornar-se petites. DNA mitocondrial funcional é necessário para a esporulação.
    2. levedura Streak da placa YPG para um (YPDextrose) placa YPD para as colónias individuais. Cresça levedura na placa de YPD 24-28 h a 30 ° C.
    3. Após cerca de 36-48 horas de crescimento em YPD meios sólidos, começar uma cultura de 25 ml YPD usando uma única colôniaa partir da placa de YPD. Crescer esta cultura até que as células são cerca de OD 600 = 4,0 a 7,0. Executar este passo, a 30 ° C durante a noite num incubador com agitação, agitação a 220 rpm.
    4. A partir da cultura de YPD, usar uma quantidade apropriada de células para iniciar a 1.000 ml de cultura YPA (YPAcetate) que é OD 600 = 0,1 para cada necessidade placa de 96 poços na Secção 2. levedura crescer num incubador com agitação a 30 ° C (agitação a 220 rpm) até a cultura DO600 é entre 1,3 a 1,5.
      Nota: inocular 100 mL de cultura YPA para cada placa de poços múltiplos 96 a ser blindado, no capítulo 2. Por exemplo, se quatro rastreio de 96 placas com múltiplas cavidades, serão necessários 400 ml de cultura YPA. Começando com 10% de volume adicional na cultura YPA é necessário para proteger contra a perda de volume por evaporação. Normalmente, vai demorar entre 12-16 horas para as células a alcançar o OD apropriado 600; a quantidade de tempo pode variar dependendo do genótipo da estirpe de levedura. YPA é a mídia presporulation. Pregrowthem acetato ajuda a induzir a expressão de genes (tais como IME1) necessário para a esporulação eficiente e síncrona 6.
    5. Centrifugação a 1800 x g numa centrífuga de topo de mesa durante 5 min para sedimentar as células cultivadas em YPA. Lavar as células 1x com 0,5 volumes de água desionizada autoclavada estéril. Girar novamente, e descartar lavar. Ressuspender as células em meios volume de esporulação 1x. Continue a Seção 2.
  2. Se usando células para a esporulação que são de diferentes genótipos, (isto é, transformadas com diferentes plasmídeos contendo mutações ou diferentes, tipicamente obtidas e armazenadas como reservas congeladas), as células da matriz dos diferentes genótipos em um formato de poços múltiplos 96. Então, siga este procedimento:
    1. Use um estéril frogger 96 pinos para transferir células de stocks congelados descongelados em 96 placa com múltiplas cavidades (s) em YPG meios sólidos. Levedura crescer durante a noite a 30 ° C.
    2. Usando um estéril frogger 96 pinos, transferir células de YPG meios sólidos em YPD meios sólidos ou seletivameios sólidos (isto é, meio mínimo sintético sem aminoácidos, se as células contêm plasmídeos que requeiram seleção). Cresça levedura a 30 ° C até as colónias são formados para cada estirpe, tipicamente de 1 dia e 2 dias de YPD se meio selectivo é necessário.
    3. Aliquota de 1,2 ml de YPD meios líquidos ou meios líquidos selectivos em cada poço de uma placa com múltiplas cavidades profundas 96 2 ml. Transferência de células a partir de suportes sólidos em meios líquidos, usando um frogger, cobrir com uma tampa de plástico mantidas no lugar pela fita, e crescer durante a noite em 30 ° C agitador, agitação a 220 rpm.
      Nota: Para minimizar a contaminação, placas de cobertura usando as tampas de plástico a partir de uma placa de petri rectangular. Segurar tampas no local usando um pedaço de fita adesiva, de modo a que a circulação de ar é minimamente restrito.
    4. placas Centrifugar a 1.800 xg durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga basculante com adaptadores para acomodar placas de 96 poços. Deitar fora media de células; Adicionar 500 ul a cada poço YPA e ressuspender as células sedimentadas no YPA. Cobrircom tampa de plástico mantido no lugar por fita.
    5. Crescer as células durante 15 h a 30 ° C num incubador com agitação, agitação a 220 rpm. Continue a Seção 2.

2. Células esporulantes num formato de 96 Multiwell

  1. Adicionar tanto ona 3 mm de contas de vidro sólido estéril ou uma estéreis 5 mm x 2 mm de barra de agitação magnética a cada poço de uma placa de 96 poços com 1,3 ml de poços. (Veja resultados representativos abaixo para uma discussão sobre a possibilidade de usar um cordão ou uma barra de agitação.)
  2. Se todas as células a serem rastreados estão do mesmo genótipo, ir a 2.2.1. Se as células a serem selecionados são de diferentes genótipos, vá para o 2.2.2.
    1. Aqui as células a partir do passo 1.1.5 e alíquota de 500 ul de células mais meios de comunicação em cada poço da placa de poços múltiplos 96. Cubra com tampa de plástico mantido no lugar por fita. Avance para o 2.3.
    2. células de rotação que são em YPA de 1.2.4 a 1.800 xg durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga basculante com adaptadores para acomodar placas de 96 poços. Derrame demeios a partir de células f. Adicionar 500 ul de meio de esporulação a cada poço e ressuspender as células sedimentadas no meios de esporulação. Cubra com tampa de plástico mantido no lugar por fita. Avance para o 2.3.
  3. Se estiver usando uma conta de vidro, amostras de lugar em uma incubadora com agitação a 30 ° C e agitar a 220 rpm para a esporulação. Se estiver usando uma barra de agitação magnética, amostras lugar numa placa de agitação dentro de um C incubadora de 30 ° para a esporulação.
    Nota: A velocidade de agitação exata para as barras de agitação magnéticas não é muito importante, desde que todos os bares estão se movendo energicamente ea cultura é arejada.
  4. Para monitorar a progressão através de esporulação, retirar-se amostras da cultura esporulados para visualização, Adicionar 6 ul de células a partir das culturas esporuladas a 24 uL de meio de esporulação em uma placa de 96 poços lamela (diluição 1: 5). Deixar as células de se contentar com 5 min antes de examinar as células utilizando um microscópio invertido.
    Nota: Em células SK1 tipo selvagem, esporos maduros compactos formará por 36 horas após a transferência para a mídia esporulação. Progressão através da esporulação pode ser monitorizada por microscopia utilizando marcadores fluorescentes, tais como um marcador nuclear (isto é, HTB2-mCherry 18) para examinar a divisão meiótica ou um marcador de membrana prospore (ou seja, G-20 19) para examinar esporos morfogénese. Em alternativa, a formação de esporos refractários podem ser vistos usando microscopia de Nomarski DIC começando cerca de 12 horas após a transferência para meios de esporulação.

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Resultados

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Para avaliar este protocolo, as eficiências de esporulação obtidos a partir de células esporuladas em placas com múltiplas cavidades (como descrito acima) foram comparados às células esporulados usando maiores volumes em frascos (Tabela 2). O uso de placas de múltiplos poços não atingiu a alta eficiência visto quando esporulação em frascos, onde a eficiência ~ 80% podem ser rotineiramente visto. Esporulantes em placas com múltiplas cavidades com arejamento adequado (forn...

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Discussão

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Aqui apresentamos um protocolo para esporulação levedura SK1 em um formato com vários poços 96. O arejamento é a chave para a esporulação eficiente, que requer a utilização de qualquer uma barra de agitação ou um cordão de vidro em cada poço. Quando as células são esporulados em uma placa com múltiplas cavidades 96 numa incubadora com agitação sem qualquer uma pérola ou uma vareta de agitação, as células não esporular eficientemente. Apenas um pequeno aumento na eficiência de esporulação é visto quando as células são es...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Joseph P. Healey, da Universidade de Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 do NIH (LSH). SMP é suportado em parte por uma Sanofi-Genzyme Fellowship da Universidade de Massachusetts Boston.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas DeepWell Nunc 1.3 mlThermoScientific260251Usadas para esporulação
Placas DeepWell Nunc 2.0 mlThermoScientific278743Usadas para crescimento de presporulação, passo 1.2.3
Contas de vidro de 3 mmFisher11-312AUsadas para esporulação
Barra de agitação de 5 mm x 2 mm, pacote de 12Fisher14-511-82Usado para esporulação
96 bem froggerV & P ScientificVP407necessário para a etapa 1.2
copiadorade biblioteca V & P ScientificVP381necessário para a etapa 1.2; para ser usado com a
placa de Petri retangularThermoScientific264728necessário para a etapa 1.2
Bacto PeptonaBD211677necessário para o meio
Extrato de leveduraBD212750necessário para o meio
Bacto AgarBD212750necessário para o meio
DextroseFisherD16-3necessário para meios
Acetato de potássioFisherP171-500necessário para meios
GlicerolFisherG33-500necessário para meios
Placa inferior de vidro preta de 96 poçosMatTekPBK96G-1.5.5-Fnecessária para a etapa 2.4
frogger

Referências

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