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DOI:

10.3791/54592

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8 de dezembro de 2016

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1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um modelo murino in vitro da barreira hematoencefálica que faz uso de espectroscopia de impedância celular, com foco nas consequências na integridade e permeabilidade das células endoteliais após a interação com células T ativadas.

Resumo

A quebra da barreira hematoencefálica (BHE) é uma etapa crítica no desenvolvimento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla (EM) e seu modelo animal de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Esse processo é caracterizado pela transmigração de células T ativadas através das células endoteliais cerebrais (CEs), os principais constituintes da BHE. No entanto, as consequências na função do EC cerebral após a interação com essas células T são amplamente desconhecidas. Aqui descrevemos um ensaio que permite a avaliação da função microvascular microvascular do cérebro primário do camundongo (MBMEC) e da integridade da barreira durante a interação com as células T ao longo do tempo. O ensaio faz uso de espectroscopia de células de impedância, uma ferramenta poderosa para estudar a integridade e permeabilidade da monocamada de EC, medindo mudanças na resistência elétrica transendotelial (TEER) e capacitância da camada celular (Ccl). Em contato direto com CEs, células T estimuladas, mas não ingênuas, são capazes de induzir disfunção de monocamada de CE, conforme visualizado por uma diminuição no TEER e um aumento no Ccl. O ensaio registra mudanças na integridade da monocamada EC de forma contínua e automatizada. É sensível o suficiente para distinguir entre diferentes intensidades de estímulos e níveis de ativação de células T e permite a investigação das consequências de uma modulação direcionada da interação célula T-EC usando uma ampla gama de substâncias, como anticorpos, reagentes farmacológicos e citocinas. A técnica também pode ser usada como controle de qualidade para integridade de CE em ensaios de transmigração de células T in vitro. Essas aplicações o tornam uma ferramenta versátil para estudar as propriedades do BBB em condições fisiológicas e fisiopatológicas.

Introdução

A barreira sangue-cérebro separa a circulação sistémica a partir do sistema nervoso central (SNC) 1-3. Ele fornece uma barreira física que inibe a livre circulação das células e à difusão de moléculas solúveis em água e protege o cérebro de agentes patogênicos e substâncias potencialmente nocivas. Para além da sua função de barreira, o BBB permite o fornecimento de oxigénio e nutrientes para o parênquima cerebral, o que assegura o bom funcionamento do tecido neuronal. As propriedades funcionais da certificação são altamente regulados pelos seus componentes celulares e acelulares, com ECs altamente especializada sendo o seu principal elemento estrutural. CEs da certificação são caracterizados pela presença de junção estanque (TJ) complexos, falta de fenestrações, extremamente baixa actividade pinocytic, e mecanismos de transporte permanentemente activas. Outros componentes da certificação da membrana basal CE, pericitos incorporação do endotélio, pés terminais astrocíticos e = par associadomembrana basal enchymal também contribuir para o desenvolvimento, manutenção e função da BHE 2,4 - 6 e, em conjunto com os neurónios e microglia, formam a unidade neurovascular (NVU), que permite o bom funcionamento do SNC 7-9.

Numa variedade de doenças neurológicas, tais como neurodegenerativas, doenças inflamatórias ou infecciosas, a função da BHE está comprometida 2,5,10. A desregulação de TJ e complexos mecanismos de transporte moleculares leva ao aumento da permeabilidade a certificação, o extravasamento de leucócitos, a inflamação e dano neuronal. A fim de estudar as propriedades de BBB sob tais condições fisiopatológicas, vários modelos in vitro da BBB foram estabelecidas 9,11,12. Juntos, eles têm fornecido informações valiosas sobre as mudanças da integridade da barreira, a permeabilidade, bem como mecanismos de transporte. Estes modelos utilizam células endoteliais de origem humana, de ratinho, rato, porcino ou bovina 13-18; células endoteliais primárias ou linhas celulares são cultivadas quer como uma monocultura ou em conjunto com os pericitos e / ou astrócitos para imitar mais de perto a certificação in vivo 19-25. Nos últimos anos, a medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) tornou-se uma ferramenta amplamente aceito para avaliar as propriedades de barreira endotelial 26,27.

TEER reflecte a impedância ao fluxo de iões através da monocamada de células e a sua redução proporciona uma medida sensível da integridade da barreira endotelial comprometida e, por conseguinte, aumento da permeabilidade. Vários sistemas de medição TEER têm sido desenvolvidos, incluindo epitelial Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato Eléctrica Impedância de detecção (ECIS), e análise de células em tempo real 15,28 - 30. TEER reflecte a resistência ao fluxo de iões entre CEs adjacentes (via paracelular) e é directamente proporcional àa integridade da barreira. Em espectroscopia de impedância 27,31, impedância total complexo de (Z) é medida, que fornece informações adicionais sobre a integridade da barreira medindo Ccl. Ccl relaciona-se com a corrente capacitiva através da membrana celular (via transcelular): a camada de células actua como um condensador no circuito eléctrico equivalente, que separa as cargas em ambos os lados da membrana e é inversamente proporcional à integridade da barreira. Quando cultivadas em inserções permeáveis, ECs aderir, proliferar e espalhar sobre a membrana microporosa. Isto resiste a corrente capacitiva fundo da inserção (que por sua vez actua como um condensador) e leva a uma diminuição na capacitância até que atinge o seu nível mínimo. Isso é seguido pelo estabelecimento de TJ complexos que vedar o espaço entre as células endoteliais adjacentes. Isso restringe o fluxo de iões através da via paracelular, e TEER aumenta até atingir o planalto. Sob condições inflamatórias, no entanto, o endotheliai barreira está comprometida: TEER diminui à medida que TJ complexos são interrompidos e Ccl aumenta à medida que o componente capacitivo da inserção sobe novamente.

Nossa medição TEER usa o sistema automatizado de monitorização das células 32: segue-se o princípio da espectroscopia de impedância e estende suas aplicações anteriores. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro a certificação que permite o estudo das propriedades de barreira, incluindo a interacção de endotélio cerebral com células do sistema imune; em particular células T activadas. Tais condições fisiopatológicas são observadas em doenças auto-imunes do sistema nervoso central, tais como a esclerose múltipla e o seu modelo animal experimental de encefalomielite auto-imune 33-37. Aqui, um passo crucial é a transmigração de células T encefalitogénicas, específicos de mielina em todo o BBB. Isto é seguido pela sua reactivação no espaço perivascular e entrada dentro do parênquima do cérebro, onde se recrutar outras células do sistema imunológico e meinflamação diate e subsequente desmielinização 1,35,38. No entanto, os mecanismos moleculares da interacção entre estas células T e as células endoteliais, os principais constituintes da BBB, não são bem compreendidos. Nosso protocolo visa preencher esta lacuna e dar novos insights sobre as consequências sobre as células endoteliais (ou seja, a integridade da barreira e permeabilidade) mediante o seu contacto directo e complexa interação com as células T ativadas.

O protocolo aqui descrito faz uso de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato primária, cultivadas como uma monocamada em inserções permeáveis ​​com membranas microporosas. As células endoteliais são co-cultivadas com células T CD4 +, que podem ser pré-activados quer policlonal ou de um modo específico do antigénio. Co-cultura de células T com MBMECs pré-activado, mas não ingénuos induz uma diminuição da TEER e um aumento em CCL, a qual fornece uma medida quantitativa da disfunção e barreira perturbação MBMEC. a técnicaé não-invasivo: ele usa built-in em vez de eletrodos pauzinho, que impedem a grande perturbação da monocamada CE; ele pode ser utilizado para monitorizar a função de barreira, sem a utilização de marcadores de células. Faz medições contínuas em uma forma automatizada e permite uma avaliação independente dos dois parâmetros de barreira (TEER e CCL), simultaneamente, ao longo do tempo. O método também é suficientemente sensível para distinguir entre diferentes níveis de activação de células T e os efeitos de tais células T na ECS.

Ele pode ser usado numa grande variedade de ensaios funcionais diferentes: as citocinas e / ou quimiocinas implicados em processos inflamatórios podem ser adicionadas à co-cultura de células T e MBMECs; anticorpos bloqueadores contra moléculas de adesão celular em ambos o lado CE ou de células T pode ser utilizado; e inibidores de marcadores de activação das células T ou de suas propriedades citolíticas pode ser adicionado durante a iniciação de células T ou a sua co-cultura com células endoteliais. O ensaio é também útil para a transmigração de células Tensaios, uma vez que pode servir como um controlo da integridade monocamada MBMEC antes da adição de células T qualidade. Tudo isto torna este método uma ferramenta versátil e fiável para estudar a certificação in vitro, com um foco no efeito de células T activadas na integridade monocamada CE. Isto é de particular importância para a compreensão dos mecanismos de certificação da interrupção na patogénese de doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla e o seu modelo animal de EAE, em que, as células T auto-reactivas encefalitogénicas atravessar a BHE e causar inflamação e dano neuronal.

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Protocolo

Para todas as experiências, os ratinhos foram criados e mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos em instalações para animais Central da Universidade de Munster, de acordo com as directrizes alemães para cuidados animais. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações do comitê de animais ética experimental e aprovado pelas autoridades locais de North Rhine-Westphalia, Alemanha (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC Isolamento e Cultura

NOTA: Isolar MBMECs como previamente descrito em detalhe 14 com as seguintes modificações:

  1. Sacrificar 20 adultos C57BL 6 ratos / (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória.
  2. Lavar o rato com 70% de etanol e decapitá-lo com uma tesoura; remover o couro cabeludo usando uma pinça e tesouras. Fazer incisões no lado esquerdo e direito do crânio, a partir do forame magno. Levante o crânio do seu lado caudal e takde e para fora do cérebro com uma pinça.
  3. Dentro de uma câmara de fluxo laminar, utilizar uma pinça estéril para colocar o cérebro em uma placa de Petri e remover o tronco cerebral, cerebelo e tálamo, mantendo apenas o córtex.
    NOTA: O uso de um microscópio não é necessária para qualquer um destes passos.
  4. Coloque o córtex sobre um pedaço de papel Western blot estéril e enrolá-lo suavemente com uma pinça até meninges não são mais visíveis.
  5. Após a digestão enzimática e mecânica (seguindo o protocolo 14), recolher as células endoteliais a partir do gradiente de densidade usando, uma agulha estéril de comprimento e um êmbolo 5 ml. As células endoteliais aparecer como uma camada escura acima do anel vermelho com eritrócitos. Transferência de 20-25 ml desta camada para um novo tubo de 50 ml de centrifugação; encher o tubo com DMEM.
  6. Após dois ciclos de lavagem 14, ressuspender as células em 6 ml de meio contendo puromicina MBMEC (4 ug / ml) e semear-los para seis cavidades de uma placa de 24 poços; deixá-los em um tecidoincubador de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 (referido como 'incubadora' daqui em diante) durante três dias.
    NOTA: Para mais informações sobre solução de revestimento MBMEC, consulte a Tabela de Materiais.
  7. Alterar a forma através da adição de 1 ml a cada poço de meio fresco sem MBMEC puromicina; colocar a placa de volta a 37 ° C e 5% de CO 2 durante mais dois dias.

2. A colheita MBMECs

  1. No dia cinco após isolamento MBMEC, pré-revestimento com inserções permeáveis MBMEC solução de revestimento de: adicionar 80 ul de solução por pastilha e deixá-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 h.
  2. Cuidadosamente pipeta a solução de revestimento e deixar o inserções de ar seco durante 30 minutos. Adicionar 2 ml de temperatura ambiente (TA) de PBS a cada poço da placa, utilizando MBMECs para lavar a forma; repita este passo. Adicionar 0,05% de tripsina-EDTA (300 uL por poço) e deixar a placa na incubadora durante 5-10 min.
  3. Adicionar 2 ml de meio MBMEC a cada poço para parartripsinização. Transferir as células recolhidas para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 700 xg los durante 8 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio MBMEC sem puromicina.
  4. Contar as células; misturar 10 ul de suspensão celular com 90 ul de 0,04% de Azul de Tripano (10X de diluição de células). Pipetar 10 ul desta mistura entre a cobertura de vidro e a câmara de contagem de células (hemocitômetro). Contagem de células tripano azul-livre em todos os quatro quadrantes da câmara (N) e determinar o número médio de células contadas (N ') como se segue: N' = N / 4.
  5. Calcula-se a concentração celular (em 10 6 células / ml), utilizando a seguinte fórmula: C = N 'x 10 4 x 10, em que 10 4 é dada pelas dimensões do hemocitómetro e 10 é o factor de diluição do passo 2.4.
  6. Semente de 2 x 10 4 células num volume de 260 ul por pastilha. Adicionar 810 ul de meio MBMEC para o compartimento inferior de cada poço. Coloque a placa com inserções na incubadora até que esteja pronto para prosseguir com o ponto 4.
    NOTA: Os volumes para o compartimento superior e inferior são de inserção específica e não funcionam para todos os formatos de 24 poços.

3. CD4 + T e isolamento das células Estimulação

  1. T CD4 + de isolamento de células
    1. Sacrificar um rato adulto (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória.
    2. Posicione o mouse sobre as suas costas em uma placa de dissecação limpa e lave-o com 70% de etanol; usar tesouras e pinças esterilizadas para abrir o peritônio e remover os baço e linfonodos (inguinal, axilar, braquial e cervical); Finalmente, a transferência do tecido para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 5 ml de PBS em gelo.
    3. Sob a câmara de fluxo laminar, transferir o tecido por decantação PBS com o tecido em um tubo de centrifugação de 50 ml com um filtro celular de 70 uM no topo; homogeneizaro tecido, pressionando-o com um êmbolo de 1 ml através do filtro.
    4. Adicionar 30 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de FACS. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 40 mm, adicionar mais 20 mL de tampão de FACS para o tubo.
    5. Centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS.
    6. Adicionar 20 ul de rato CD4 microesferas magnéticas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C. Adicionar 25 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Enquanto isso, coloque uma coluna de separação LS para o ímã e lave-o com 3 ml de tampão FACS. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de tampão de FACS.
    8. Adicionar células para a coluna. Lavar a coluna com 3 ml de tampão de SCAF três vezes. Remova a coluna do ímã e colocá-lo em um novo 15 ml centritubo fugation. Adicionar 5 ml de tampão de FACS, lavar as células marcadas com o êmbolo coluna e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
    9. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio de células T. Contar as células tal como descrito em 2.4 e sementes de 1 x 10 5 células em 100 ul de meio por poço.
  2. Estimulação de células CD4 + T
    1. A estimulação das células T CD4 + policlonal
      1. Pré-revestimento de uma placa de 96 poços de fundo redondo com anticorpo purificado anti-rato CD3 (clone 145-2C11) em PBS, a uma concentração final desejada. Por exemplo, para pré-revestir a placa completamente com α-CD3 a 1 ug / mL, misturar 10 mL do anticorpo (concentração estoque = 0,5 mg / ml) com 5 ml de PBS, vortex e adicionar 50 uL da mistura para cada poço com uma pipeta multicanal.
      2. Deixar a placa na incubadora durante 3 h. Depois de isolar as células T, lavar a placa pré-revestido duas vezes com PBS. Adicionar anticorpos anti-CD28 purificada (clone37,51) para as células T isoladas a uma concentração final desejado (por exemplo, a 1 ug / ml); misture bem. Semear as células T e deixá-los na incubadora por dois a três dias.
    2. Estimulação de células específicas de antigénio de células T CD4 + com células dendríticas (DC)
      NOTA: Se DCs são usadas como células apresentadoras de antigénio (APCs), seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes excepções:
      1. Antes de se homogeneizar o baço, injectá-la com 1 ml de colagenase de tipo IA em PBS a 0,5 mg / ml e transferi-lo para um tubo de centrifugação de 15 ml.
      2. Incubar em banho-maria a 37 ° C durante 15 min. Após lavagem com PBS, ressuspender o sedimento em tampão de FACS e adicionar 20 ul de rato CD11c microesferas magnéticas, em vez de microesferas de CD4.
      3. Usar uma coluna de separação de MS e os volumes apropriados: lavar a coluna com 1 ml de tampão de SCAF; Ressuspender as células em 1 ml de tampão de SCAF e lava-se a coluna com 1 ml de tampão de SCAF três vezes.
      4. de Anúnciosd antigénio de escolha para DC (por exemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) AA 35-55 a 20 ug / ml), misturar bem e semente 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células T por 96-round-bottom bem.
      5. Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de cavidades, com o fim, tal como descrito no protocolo para o isolamento de células T.
    3. A estimulação das células T CD4 + específicas para o antigénio com as células B
      NOTA: Se as células B são usados ​​como APCs, seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes exceções:
      1. Use baços de ratinhos transgénicos, cujas células B são específicas do antigénio (por exemplo, ratinhos, IgH MOG (Th), cujas células B reconhecem especificamente MOG 35-55).
      2. Utilização de células T específicas do antigénio (por exemplo, a partir de TCR MOG (2D2) ratinhos). Adicionar 20 l de rato CD19 microesferas magnéticas em vez de microesferas de CD4.
      3. Adicionar o antigénio de escolha para o cel BLS (por exemplo, MOG 35-55 em 20 ug / ml), misturar bem e semente de 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células B por 96 de fundo redondo de poços.
      4. Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de poços, como descrito no protocolo para o isolamento de células T.

4. Configuração e Execução de Medição TEER

  1. Colocar o módulo de 24 poços do instrumento TEER sob a câmara de fluxo laminar. Retire as tampas e inserções lugar com MBMECs no instrumento usando uma pinça.
  2. Pipetar 810 l de meio fresco para o compartimento inferior das cavidades do módulo: adicioná-lo cuidadosamente entre a pastilha e a parede do módulo bem.
  3. Fechar as tampas e coloque o instrumento na incubadora. Conecte o instrumento ao seu computador; ligar o controlador de instrumento e abrir o software.
  4. Selecione "nova medição" na janela pop-up. Check 'show TEER "e caixas de' show Ccl '; em seguida, pressione 'start'. Depois de completar a primeira medição, selecione 'check todos os poços' no separador 'Resultados' para ver todos os valores TEER e Ccl.
  5. Salve o arquivo: Arquivo> Salvar como> 'o nome do seu arquivo'.
    NOTA: Como TEER e Ccl são continuamente medido de forma automatizada, monitorar seus valores durante um período de três a cinco dias. Mudando a forma não é necessário, a menos que a viabilidade celular é sub-óptima, como visualizado por uma ausência de aumento na TEER.
  6. Escolha o ponto de tempo para co-cultura MBMECs com células T quando Ccl é estável e inferior a 1 uF / cm 2 e TEER atingiu o seu nível máximo.
  7. inspecione cuidadosamente valores absolutos TEER e Ccl e excluir os poços nos quais MBMECs não desenvolveram monocamadas confluentes suficientes desmarcando tais poços.
  8. Grupo do resto dos poços: clique com o botão direito sobre um bem e selecionar "adicionar bem ao novo poço média". Namenviar um e-lo na janela pop-up; fazer o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados.
  9. Verificar todos os poços médios para confirmar que todos eles têm as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Se alguns têm significativamente diferentes valores absolutos TEER ou TEER encostas, ou os erros padrão são muito grandes, refazer o agrupamento.
    NOTA: O agrupamento ideal de poços fornece uma variação mínima em valores TEER, dentro e entre os grupos experimentais.
  10. Na aba "experimento", pressione "pausa", desligue o instrumento e levá-la para fora da incubadora. Retirar as tampas sob a câmara de fluxo laminar.
  11. Prepare pré-ativado e / ou células T naive, com ou sem citocinas específicas, anticorpos ou outras substâncias, como desejado: Por exemplo: Mistura purificado rato NA / LE anticorpo anti-rato IFN-γ (XGM1.2 clone) com T preparado as células, a 20 ug / ml por poço do instrumento TEER.
    NOTA: Se as substâncias, tais como inibidor de granzima B são usados, eles são umdded à cultura de células T no início da estimulação das células T: por exemplo, granzima B Inhibitor II (Calbiochem) é misturado com as células T isoladas a uma concentração final de 10 uM em DMSO. Ver Materiais e Equipamentos para mais detalhes.
  12. Remover parte do meio da inserção (o compartimento bem superior): por exemplo, cuidadosamente pipeta 150 uL (removendo toda a forma deve ser evitado, uma vez que poderiam perturbar a monocamada MBMEC).
  13. Adicionar células T para MBMECs pipetando cuidadosamente 150 ul de meio contendo 2 x 10 5 células / inserção.
    NOTA: Quando a colheita de células T pré-ativado, contar apenas explodir, células Trypan Blue-livres.
  14. Fechar as tampas e coloque o instrumento de volta para a incubadora. Volte a ligar o instrumento e pressione 'medição currículo'. Depois de 24 horas, pressione 'stop' no separador 'experimento' e salve o arquivo (Arquivo> Salvar).

5. Data Export e Análise Estatística

  1. Exportar os resultados escolhendo Arquivo> Exportar.
  2. Na guia "Configurações" da janela pop-up, selecione ".dot" na opção "separador decimal" e "tabulator" na opção "delimitador de campo".
  3. Na aba "resultados de exportação", o nome do arquivo, verifique todos os poços a serem exportados, e marque a opção "TEER" e caixas "Ccl" na "escolha de dados" opção.
  4. Pressione "exportar dados," abrir o arquivo exportado, e copiar os dados para uma planilha.
  5. Normalizar os dados exportados (classificado por cada repetição, com valores TEER e Ccl dadas para cada execução (medição)): valores Set TEER e Ccl do último ponto de tempo antes que a co-cultura para 100% e mudar de acordo com os valores para todos os outros runs, em relação ao run '100%'.
  6. Copiar os dados normalizados para um software de escolha para gerar um gráfico, usando poços individuais e exibindo o erro padrão da média para cada grupo de tratamento.
  7. Perform dois sentidos teste estatístico ANOVA com correção de Bonferroni para comparações múltiplas, utilizando o software estatístico de escolha.

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Resultados

A Figura 1 fornece uma visão geral do modelo de certificação in vitro utilizado para estudar a interação entre células T e células endoteliais. O experimento consiste em três etapas principais. O primeiro passo é o isolamento de MBMECs primárias a partir de córtices cerebrais, e a sua cultura durante cinco dias. Quando atingem confluência na placa de cultura celular, MBMECs são tripsinizadas e re-semeadas em inserções permeáveis, os quais são, então, colocados n...

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Discussão

Vários passos do protocolo descrito são essenciais para uma experiência de sucesso. Durante o isolamento e cultura MBMEC inicial, é crucial que o trabalho é executado sob condições estéreis, tanto quanto possível, para evitar a contaminação da cultura de células com esporos de fungos ou bactérias. A fim de se obter uma cultura pura de células endoteliais, é recomendado o uso de um meio contendo puromicina para os três primeiros dias, o que permite que a sobrevivência das células endoteliais, mas não outros tipos de célu...

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Divulgações

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl e L. Klotz não têm nada a divulgar. H.-J. Galla é consultor científico da nanoAnalytics GmbH, fabricante do monitor de células automatizado.

Agradecimentos

Somos gratos a Annika Engbers e Frank Kurth pelo seu excelente apoio técnico e Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) para discussões úteis sobre medições TEER. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projeto A03 para HW e LK, CRC TR128, projeta A08; Z1 e B01 para LK e número de concessão HW, e do Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (Faculdade de Medicina de Münster) KL2 / 2015/14 para LK.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.comincluindo: Módulo de célula de 24 poços, controlador, PC com software cellZscope v2.2.2 
UltracentrífugaThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; para
citômetro de fluxoBeckman Coulterwww.beckmancoulter.compara análise de transmigração de células T
FlowJo7.6.5 softwareTree Starwww.flowjo.compara análise de transmigração de células T
Tubos de centrífuga Oak Ridge, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; para isolamento MBMEC
Inserções de membrana Transwell - tamanho do poro 0,4 µ mCorning3470para medição TEER como leitura principal
Inserções de membrana Transwell - tamanho de poro 3 µ mCorning3472para medição TEER como controle de qualidade antes do ensaio de transmigração de células T
Placa de cultura de células de 24 poçosGreiner650 180de fundo plano; para cultura MBMEC
Placa de cultura de células de 96 poçosCostar3526de fundo redondo; para cultura de células imunes
QuadroMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-090-976para isolamento de células T e células B; suporta Colunas MACS LS
OctoMACS SeparadorMiltenyi Biotec130-042-109para isolamento de células dendríticas; suporta colunas MACS MS
Câmara de contagem NeubauerMarienfeldMF-0640010para contagem de células
Filtro de células, 70 µ mCorning352350para isolamento de células imunes
Filtro de células, 40 µ mCorning352340para isolamento de células imunes
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303para isolamento de células
imunes Colunas de separação MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401para isolamento de células T e células B
Colunas de separação MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201para isolamento de células dendríticas
Mouse CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201para isolamento de células T CD4+
MicroBeads de camundongoMiltenyi Biotec130-052-201para isolamento de células B
MicroBeads de camundongo CD11cMiltenyi Biotec130-052-001para isolamento de células dendríticas
Colágeno tipo IV da placenta humanaSigmaC5533para solução de revestimento MBMEC
Fibronectina de plasma bovinoSigmaF1141-5MGpara solução de revestimento MBMEC
Colagenase 2 (CSL2)WorthingtonLS004176para isolamento MBMEC
Colagenase/Dispase (C/D)Roche 11097113001para isolamento
MBMEC DNase ISigmaDN25para isolamento MBMEC
Soro Fetal Bovino (FBS)SigmaF7524para isolamento MBMEC
Albumina de soro bovino (BSA)Amresco0332-100Gpara isolamento MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lpara isolamento MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021para isolamento MBMEC e meio de cultura MBMEC
Penicilina/estreptomicinaSigmaP4333para isolamento MBMEC e meio de cultura MBMEC
tamponado com fosfato Solução salina (PBS)SigmaD8537para MBMEC e isolamento de células imunes
HeparinaSigmaH3393para meio de cultura MBMEC
Fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (bFGF)PeproTech100-18Bpara meio de cultura MBMEC
PuromicinaSigmaP8833para meio de cultura MBMEC; apenas nos primeiros três dias
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054para colheita de MBMECs
Colagenase Tipo IASigmaC9891para isolamento de células dendríticas
Solução de azul de tripano, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061para contagem de células
EDTASigma E5134para isolamento de células imunes
IMDM + 1% L-GlutaminaGibco21980-032para meio de cultura de células T
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qproteger da luz; para meio de cultura de células B
β-mercaptoetanolGibco31350-010para meio de cultura de células B
L-Glutamina (100x Glutamax)Gibco35050-061para meio de cultura de células B
camundongo MOG35— 55 peptídeoBiotrendBP0328para ativação de células T antígeno-específicas
purificadas anti-camundongo CD3 AbBioLegend100302clone 145-2C11; para ativação de células T policlonais
purificadas NA/LE anti-camundongo CD28 AbBD Pharmingen553294clone 37.51; para ativação de células T policlonais
IFN-&gama murino recombinante;PeproTech315-05para ensaios de transmigração de células T
TNF murino recombinante-&alfa;PeproTech315-01Apara ensaios de transmigração de células T
NA/LE anti-camundongo purificado IFN-&gama; anticorpoBD Biosciences554408clone XMG1.2; concentração final recomendada: 20 µ g / ml
Granzyme B Inhibitor IICalbiochem368055concentração final recomendada: 10 µ Anticorpo
M PE anti-camundongo CD4Biolegend116005clone RM4-4; para análise da transmigração de células T
de isolamento MBMEC

Referências

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