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Artigo de método

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

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DOI:

10.3791/54596

⸱

30 de outubro de 2016

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

Neste artigo

Resumo

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Resumo

células B e T, com seus repertórios de antígeno-receptor extremamente diversos, têm a capacidade de montar respostas imunes específicas contra quase qualquer patógeno invasor1,2. Compreensivelmente, essas habilidades intrincadas são controladas por um grande número de moléculas envolvidas em vários processos celulares para garantir respostas imunes oportunas e espacialmente reguladas3. Aqui, descrevemos procedimentos experimentais que permitem o isolamento rápido de linfócitos murinos altamente purificados usando a tecnologia de classificação magnética de células. Os linfócitos purificados resultantes podem então ser submetidos a vários ensaios funcionais in vitro ou in vivo, como a determinação da capacidade de sinalização de linfócitos após estimulação por immunoblotting4 e a investigação de habilidades proliferativas por incorporação de 3H-timidina ou marcação de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)5-7. Além de comparar as capacidades funcionais de linfócitos controle e geneticamente modificados, também podemos determinar a capacidade estimulatória de células T de células apresentadoras de antígenos (APCs) in vivo, conforme mostrado em nossos resultados representativos usando células T OT-I marcadas com CFSE transplantadas.

Introdução

Os linfócitos maduros geralmente existem no estado de repouso se não houver infecção ou inflamação pré-existente no indivíduo. Portanto, é importante manter o status ingênuo dos linfócitos durante o processo de isolamento antes de realizar ensaios funcionais in vitro ou in vivo. A chave para garantir resultados consistentes e reprodutíveis é limitar qualquer manipulação desnecessária das células.

A classificação magnética de células utiliza anticorpos e microesferas para rotular as células, de modo a enriquecer a população de células de interesse. Com essa abordagem, existem duas estratégias de purificação: enriquecimento positivo e esgotamento negativo. O enriquecimento positivo enriquece a população de células de interesse usando um anticorpo que se liga às células-alvo. A depleção negativa, por outro lado, esgota as células não-alvo, deixando a população celular de interesse. Em nosso laboratório, preferimos a depleção negativa ao enriquecimento positivo porque a ligação de anticorpos às células-alvo pode alterar as características e o comportamento das células. De fato, muitos marcadores de superfície celular estabelecidos adequados para o isolamento de uma determinada população celular também são receptores funcionais.

A classificação magnética de células não apenas produz populações altamente puras de células-alvo viáveis, mas também consome menos tempo e evita o estresse celular induzido pelo fluxo de alta pressão usado na classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Ao rotular as populações de células indesejadas e esgotá-las usando uma coluna de separação magnética, somos capazes de realizar um rápido isolamento celular sem comprometer a viabilidade da população de células-alvo. Neste protocolo, demonstramos o uso de estratégias de depleção negativa para purificar células B ou células T virgens.

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Protocolo

Todos os ratos são criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos e todos os protocolos do mouse são conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso Institucional Animal.

1. Preparação de Tampões e reagentes

  1. Prepare completa do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio (10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI / mL) / estreptomicina (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoetanol ).
  2. Prepare 20x solução salina equilibrada (BSS) Stock 1 e da 2, separadamente.
    1. Prepare 20x BSS Estoque 1 (111 mM dextrose, fosfato de potássio 8,8 mM, 26,7 mM fosfato de sódio dibásico em 1 L de água esterilizada) e adicionar 40 ml de 0,5% Fenol Vermelho 20x estoque BSS 1 antes do ajuste de volume final. Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C.
    2. Prepare 20x BSS stock 2 (25,8 mM de cloreto de cálcio di-hidratado, cloreto de potássio 107 mM, ch de sódio 2,73 Mloride, 19,6 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado, sulfato de magnésio 16,6 mM em 1 L de água estéril). Filtrar em condições estéreis através de filtro de 0,2 um antes de armazenar a 4 ° C.
    3. Para preparar 1x BSS para uso experimental, diluir 50 ml BSS Estoque 1 e 50 ml da BSS 2, separadamente, em 400 ml de água estéril cada. Combinar as duas soluções diluídas, ajustar até pH 7, e adicionar 20 ml de FBS (2%). Topo até 1 L com água estéril e filtro estéril usando 0,2 m de filtro.
      NOTA: soluções de BSS devem ser preparados separadamente, pois a mistura de stocks BSS concentradas diretamente pode resultar em precipitação.
  3. Glóbulo Vermelho (RBC) Tampão de Lise
    1. Para preparar tampão de lise dos glóbulos vermelhos, mistura 9 partes de cloreto de estoque de amónio (cloreto de amónio 155 mM em água esterilizada) para uma parte da base Tris (130 mM de Tris (hidroximetil) -aminometano em água estéril, pH 7,65) antes do uso.
      NOTA: Loja soluções de estéreis de cloreto de amônio e Tris-base a 4 ° C. Prepare lise bpode ser prejudicado fresco para assegurar a lise eficiente de hemácias.

2. Geração de Linfócitos suspensão de baço ou gânglios linfáticos

NOTA: É importante para preparar todos os reagentes e equipamentos necessários para a experiência antes da eutanásia do rato e para gerar suspensões de células únicas de linfócitos tão rapidamente quanto possível para manter as viabilidades celulares elevadas.

  1. Euthanize rato experimental por deslocamento cervical ou CO 2 asfixia.
    NOTA: A partir desta etapa em diante, todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de forma asséptica.
  2. Mergulhe o rato inteiro em 70% de etanol antes de fazer qualquer incisões. Remover os gânglios linfáticos e do baço assepticamente 8, e colocá-los em separadas tubos de 15 ml contendo 5 ml de gelo-frio RPMI / FBS (meio RPMI com SFB a 2%) ou BSS / FBS (a partir do passo 1.2.3).
    NOTA: Uma vez que BSS impede eficiente lise RBC, use RPMI para a preparação da suspensão de células do baço e mudar para BSS aftelise r RBC.
  3. Para gerar uma suspensão de células isoladas a partir do baço ou nodos linfáticos, colocar o órgão (s) entre duas peças de estéril de malha 100 uM coador de células numa placa de Petri contendo 2 ml de gelo-frio RPMI / FBS ou BSS / FBS. Usando o êmbolo de uma seringa de 1 ml, triturar o órgão (s) até que tenha sido rasgada em partes muito finas.
  4. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e lava-se o filtro de células de malha com gelada RPMI / FBS ou BSS / FBS. Recolhe-se o restante suspensão de células, adicioná-lo para o mesmo tubo de 15 ml, e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
    NOTA: Re-suspender as células peletizadas sacudindo o tubo com os dedos antes de adicionar tampão de lise RBC ou médio nas etapas subsequentes.
  5. Preparar tampão de lise temperatura ambiente (RT) RBC durante a centrifugação da suspensão de células (ver passo 1.3.). Após a peletização das células e remoção do sobrenadante, re-suspender as células com 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para cada 10 8 células. incuBATE a reacção de lise à TA durante 3-4 min.
  6. Pare a lise de RBC com 14 ml de gelo-BSS frio / FBS e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C.

3. Purificação de células B e T

  1. A purificação de células B
    1. Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender até 10 8 células esplênicas em 300 ul BSS / FBS e adicionar 50 ul anti-CD43 microesferas magnéticas 9,10. Para remover as células mortas, adicionar 30 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
  2. Purificação de células T
    1. Contar as células usando um hemocitômetro. Re-suspender-se a 10 8 células em não-T cocktail de anticorpos de depleção de células (anticorpos biotinilados contra CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 e CD4 ou CD8, dependendo da população de células alvo para ser purificado), diluído 1: 200 em 200 ul BSS / FBS a 4,5. Incubar a suspensão de células numa4 ° C frigorífico durante 15 min.
    2. Após incubação, adicionam-se 10 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 165 ul de BSS / FBS a 30 com micro-esferas de estreptavidina ul e 15 ul anexina V esferas magnéticas. Incubar a suspensão de células num frigorífico a 4 ° C durante 30 min.
      NOTA: Para assegurar mesmo marcação com as microesferas magnéticas, incubar as células com microesferas durante 15 minutos, em seguida, misturar a suspensão de células suavemente batendo no tubo de 15 ml e incubar mais 15 minutos durante o passo 3.1.1. ou 3.2.2.
  3. Preparação da coluna de separação para a purificação celular
    1. Prepara-se uma coluna de separação não utilizada, durante a etiquetagem micropérola das células (passo 3.1.1. Ou 3.2.2.). Pré-aquecido BSS (sem FBS) à temperatura ambiente e utilizar 2 ml de lavar e equilibrar a coluna em condições assépticas. Após o equilíbrio com BSS, a coluna lavada não devem ser deixadas a secar fora.
      NOTA: Nós usamos os LS column em vez da coluna LD recomendada, devido à sua possibilidade de reutilização (ver passo 3.4.).
    2. Após marcação com as esferas magnéticas, adicionar 14 ml de BSS / FBS para lavar as células e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e re-suspender as células em 1-3 ml RT BSS.
    3. Anexar uma agulha estéril 21 L para a ponta da coluna de reduzir a taxa de fluxo durante o processo de purificação. Carregar a suspensão de células na coluna equilibrada e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados.
      Nota: Evite a introdução de bolhas na coluna durante o carregamento.
    4. Lava-se a coluna uma vez com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Recarregar a coluna com o fluxo através de uma vez. Recolhe-se o fluxo através após a segunda carga no mesmo tubo de 15 ml.
    5. Lavar a coluna 3 vezes com 1 ml de BSS / FBS e recolher o fluxo através contendo as células alvo purificados. Depois disso, adicionar 5 ml de BSS / FBS a the coluna e, com um êmbolo, lave as células magneticamente marcadas para fora da coluna para um novo tubo de 15 ml.
    6. Verifique a pureza das células recolhidas por citometria de fluxo utilizando anticorpos que se ligam a antigénios purificados de células T 4,5 B ou superfície.
  4. Re-usando a coluna de separação
    NOTA: A coluna LS pode ser reutilizado até 4 vezes sem afectar a eficiência da purificação.
    1. Lavar a coluna 3 vezes com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 3 vezes com 5 ml de água destilada a partir do topo usando o êmbolo.
    2. Lavar a coluna com 5 ml de etanol a 70% e seca-se a coluna extensivamente usando uma torneira de ar para evitar a formação de ferrugem na coluna.
    3. Para preparar uma coluna LS usado para uma experiência de purificação separada, lavar a coluna de baixo para cima com 5 ml de etanol a 70% utilizando o adaptador de seringa. Em seguida, lava-se a coluna a partir de baixo para cima duas vezes com 5 ml de PBS estéril, seguido de 5 ml de PBS, uma vez a partir do topo da coluna. Adicionar 2ml RT BSS para equilibrar a coluna e depois prosseguir para carregar a coluna com células marcadas.

4. CFSE Labeling e Estimulação

NOTA: Purificado células podem ser submetidas a uma variedade de ensaios in vitro e em ensaios funcionais in vivo. Aqui, utilizamos células T purificadas para determinar a capacidade de estimulação de célula T de APCs 5.

  1. solução pré-aquecido rotulagem (0,1% de FBS em PBS) a 37 ° C antes do carregamento CFSE.
    NOTA: Usando uma baixa percentagem de FBS em PBS reduz a morte celular durante CFSE carga e minimiza a perda de células durante a centrifugação. No entanto, muito FBS pode interferir com carga CFSE.
  2. Lavar as células purificadas duas vezes com solução de rotulagem, em seguida, re-suspensas a 2 x 10 7 células / ml na solução de marcação pré-aquecido em um tubo de 15 ml.
  3. Preparar solução de 10 uM CFSE (diluição 1: 500 de CFSE 5 mM de solução de reserva) em solução de etiquetagem pré-aquecido. solução CFSE deveser preparada a cada vez para alcançar rotulagem ideal.
  4. Para carregar as células com CFSE, adicionar uma suspensão de células parte para 1 parte de solução de 10 uM CFSE em um tubo de 15 ml e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ° C. Uma concentração final de 5 uM CFSE é utilizado para marcar 1 x 10 7 células / ml.
  5. Inverter o tubo a cada dois minutos para assegurar uma mistura homogénea de células durante o carregamento CFSE.
  6. Para parar a reacção, adicionar vários volumes de meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C. Após o bem sucedido CFSE carregamento, o sedimento celular aparece amarelado.
  7. Lavar as células CFSE carregado mais uma vez com meio RPMI completo gelada e girar a 453 xg durante 5 min a 4 ° C antes de utilizar para a cultura in vitro ou in vivo estimulação.

5. estimulação in vitro Em

  1. Preparar uma solução 2x estoque de estímulos (2x estímulos solução estoque) imediatamente antes da utilização de modo a que 100 ul de solução de estoque 2x estímulos pode ser adicionada a 100 ul de células até um volume final de 200 ul por poço numa placa de 96 poços.
  2. Se é necessária uma placa revestida com estímulos (IgM ou CD40 para células B ou CD3 e CD28 para as células T), dilui-se os estímulos em PBS e pré-revestimento da placa de cultura a 4 ° C durante a noite. Em alternativa, a placa de cultura podem ser revestidos a 37 ° C durante 1 hora no dia da experiência. Lave a placa revestida duas vezes com PBS (Não permita que o prato para secar a qualquer momento).
Para as células B
estímulos A concentração final
F (ab ') 2 de cabra anti-IgM de ratinho 0,6-2,4 ug / ml
Anti-ratinho CD40 mAb 0,5-2 ug / ml
recombinanterato IL-4 25 U / ml
lipopolissacarídeo 0,1-10 ug / ml
(LPS) de E. coli serotipo 055: B5
Para as células T
estímulos A concentração final
Anti-CD3 (placa revestida) 2-10 ug / ml
(50 ul / poço para o revestimento)
Anti-CD28 (placa revestida) 2 ug / mL
IL-2 recombinante 40 U / ml
PDBu (éster de forbol) 5-50 ng / ml
A23187 (ionóforo de cálcio) 250 ng / mL

Quadro 1: Concentrações de estímulos utilizados para estimular os linfócitos em cultura in vitro.

  1. Para as células B CFSE-rotulados, re-suspender a 3 X 10 6 células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 3 x 10 5 células / poço em placas de 96 poços de fundo plano, durante 72 h.
  2. No caso de células T marcadas com CFSE-, re-suspender a 0,5-3 x 10 6 células / ml em meio RPMI completo e a cultura em triplicado com 0,5-3 x 10 5 células / poço em placas de 96 poços de fundo redondo de 48 ou 72 hr .

6. Promoção Vivo Em

  1. Para a estimulação in vivo, transferência adoptiva 4 x 10 6 células T CFSE marcados por ratinho (por via intravenosa (IV) em 200 ul de PBS) em cada rato receptor semelhantes em MHC.
    NOTA: Neste protocolo, as células T CFSE rotulados podem ser adoptively transferidos usando veia da cauda ou injeção retro-orbital como essas células vão para casa para linfóides órgãos como o baço e os linfonodos.
  2. Desafiar os ratos receptores um dia mais tarde com o antigénio.
    NOTA:Neste exemplo, usamos a ovalbumina (OVA proteína, 50 ug / ratinho) como antigénio específico porque OVA-, receptor de células T (TCR), as células T foram -transgenic adoptivamente transferidos para ratinhos receptores. Prepare proteína OVA em PBS estéril e injectar 100 ul de proteína OVA / PBS ou PBS de controlo, por meio de injecção subcutânea (Si), em cada rato receptor 5.
  3. Colheita e gerar suspensões individuais de células de órgãos linfóides (nódulos linfáticos e baços de ratinhos receptores) 3 dias após a imunização com a proteína OVA ou PBS. linfonodos separar em nodos linfáticos proximais (PLN), que inclui axilar, braquial e nódulos linfáticos cervical superficial) e nódulos linfáticos distais (DLN), que inclui mesentérica, popliteal, inguinal, lombar, e nódulos linfáticos caudal. células mancha usando os anticorpos FACS apropriados para verificar se há a proliferação de células T.
    NOTA: Nesta célula experimento de rastreamento CFSE, CFSE marcado com células T de ratinhos de controlo injectados com PBS estabelecer uma linha de base para a fluorescência não-dinecer células. Divisões celulares de proliferação, as células, marcadas com CFSE-estimulado com antigénio são visualizados através da medição de fluorescência picos 12,13. Com o controlo de PBS, o número de divisões celulares de proliferação, as células T CFSE-marcados podem ser determinadas 12,13.
  4. Analisar os dados de proliferação de células marcadas com CFSE, comparando o número de divisões celulares ou picos entre amostras (Figuras 1 e 2).
    NOTA: Por exemplo, CFSE marcado, as células T específicas de OVA adoptivamente transferidos para ratinhos receptores que recebem o antigénio OVA vai sofrer proliferação activa em comparação com os ratinhos de controlo injectados com PBS 5,12. Além disso, é de salientar salientar que há muitas maneiras para analisar dados de proliferação de células CFSE, como demonstrado por Hawkins e seus colegas 14.

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Resultados

purificação magnética de células de linfócitos permite que os utilizadores para purificar uma população de células alvo num período relativamente curto de tempo. Utilizando o nosso protocolo de esgotamento, que foram capazes de aumentar a percentagem de células T CD8 (OT-I em recombinação-activação do gene-1 (RAG-1) -deficient ratinhos) a partir de 72,8% (antes da purificação) a 94,2% (após purificação; Figura 1A) 4,5. Estes linfócitos purificadas podem então ...

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Discussão

Neste protocolo, demonstramos um procedimento para a purificação de linfócitos de órgãos linfóides. purificação celular utilizando esférulas magnéticas triagem é um método rápido e simples que produz células alvo viáveis, altamente purificados.

Passos críticos dentro do Protocolo

A viabilidade celular e rendimento celular

Mantendo a viabilidade das células de linhagem hematopoiéticas in vitro é fundamental para...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O estudo é apoiado pelo Ministério da Educação, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 e Tier2-MOE2013-T2-2-038). O manuscrito foi editado por Amy Sullivan de Obrizus Communications.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
RPMI 1640 (sem L-Glutamina)Gibco31870025
SoroInativado por Calor 
L-glutaminaGibco25030024
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140114
2-mercaptoetanolGibco21985023
Microesferas magnéticas anti-CD43Miltenyi Biotec130-049-801Misturar bem o uso prévio
de estreptavidinaMiltenyi Biotec130-048-101Misturar bem o uso prévio
Contas magnéticas anti-anexina VMiltenyi Biotec130-090-201Misture bem o uso prévio
MACS LD Miltenyi Biotec130-042-901
Placa de cultura estéril de fundo em U de 96 poçosGreiner Bio-one650180
Placa de cultura estéril de fundo em F de 96 poçosGreiner Bio-one655180
100 μ malhaPara esterilizar usando radiação UV uso prévio
0,2 μ m  unidades de filtro descartáveis estéreisNalgene567-0020Pode ser substituído por qualquer dispositivo de filtro estéril
CellTrace VioletInvitrogenC34557CTV para abreviar; alternativa ao CFSE
CellTrace YellowInvitrogenC34567CTY para abreviar; alternativa ao CFSE
CellTrace Far RedInvitrogenC34564CTFR para abreviar; alternativa ao CFSE
Corante de proliferação celular eFluor 670eBioscience65-0840CPD670 para abreviar; alternativa para CFSE
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26, alternativa para CFSE
strong>NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Chemicals
DextroseSigma AldrichG7021
Fosfato de potássio monobásicoSigma AldrichP5655
Fosfato de sódio dibásicoSigma AldrichS5136
Vermelho de fenolSigma AldrichP0290
Cloreto de cálcio di-hidratadoSigma AldrichC7902
Cloreto de potássioSigma AldrichP5405
Cloreto de sódioMerck MilliporeS7653Pode ser usado de outras fontes
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigma AldrichM2393
Sulfato de magnésioSigma AldrichM2643
Cloreto de amônioSigma AldrichA9434
Tris-base
Dimetil SulfóxidoSigma Aldrich D8418
(5- (e 6-) éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)Sondas molecularesC-1157Reconstituem em DMSO
Phorbol 12,13-dibutirato (PBDU, éster de forbol)Sigma AldrichP1269
A23187 (ionóforo de cálcio)Sigma AldrichC7522
< strong > Nome < / strong > Empresa < / strong> Número de catálogoComentários
Anticorpos e proteína recombinante
CD11b biotina (clone m1/70)Biolegend101204coquetel de depleção de células T
CD11c biotina (clone N418)Biolegend117304coquetel de depleção de células T
Gr-1 (clone RB6-8C5)Biolegend108404coquetel de depleção de células T
Ter119 biotina (clone Ter119)Biolegend116204coquetel de depleção de células T
TCR-&gama; δ biotina (clone GL-3)Biolegend118103coquetel de depleção de células T
CD19 biotina (clone 6D5)Biolegend115504coquetel de depleção de células T
B220 biotina (clone RA3-6B2)Biolegend103204coquetel de depleção de células T
CD49b biotina (clone DX5)Biolegend108904coquetel de depleção de células T
CD4 biotina (clone GK1.5)Biolegend100404Coquetel de depleção de células T
CD8 Biotina (clone 53-6.7)Biolegend100704Coquetel de depleção de células T
F(ab')2 IgM anti-rato para cabras (revestidas com placa)Jackson ImmunoResearch 115-006-07550 µ l/well para revestimento (96-well)
Anti-mouse CD40 mAb (revestido com placa)Pharmingen 55372250 µ l/well para revestimento (96-well)
Recombinante IL-4ProSpec Cyt-282
LPS de E. coli Sorotipo 055:B5Sigma AldrichL-4005
Anti-CD3 (clone clone OKT3) (revestido em placa)eBioscience 16-0037-8550 µ l/poço para revestimento (96 poços)
Anti-CD28 (clone clone 37.51) (revestido com placa)eBioscience 16-0281-8550 µ l/poço para revestimento (96 poços)
Albumina recombinante IL-2ProSpecCyt-370
de clara de ovo de galinha, OvalbuminaSigma AldrichA7641
Fetal Bovino de filtro de células m <

Referências

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