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Artigo de método

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

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DOI:

10.3791/54617

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19 de dezembro de 2016

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Cardiovascular Institute, School of Medicine, Stanford University, 3VA Palo Alto Health Care System, Department of Cardiothoracic Surgery, School of Medicine, Stanford University

Neste artigo

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

Resumo

A angiogênese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de vasos existentes. O crescimento de novos vasos requer proliferação, migração e alinhamento coordenados de células endoteliais para formar estruturas tubulares, seguidos pelo recrutamento de pericitos para fornecer suporte mural e facilitar a maturação dos vasos. As abordagens atuais de cultura de células in vitro não podem reproduzir totalmente o ambiente biológico complexo onde as células endoteliais e os pericitos interagem para produzir vasos funcionais. Apresentamos uma nova aplicação do ensaio de tampão de gel de matriz in vivo para estudar as interações endotelial-pericito e a formação de vasos sanguíneos funcionais usando camundongos com mutação de imunodeficiência combinada grave (SCID). Resumidamente, o gel de matriz é misturado com uma solução contendo células endoteliais com ou sem pericitos, seguido de injeção nas costas de camundongos SCID anestesiados. Após 14 dias, os tampões de gel da matriz são removidos, fixados e seccionados para análise histológica. O comprimento, número, tamanho e extensão da cobertura de pericitos de vasos maduros (definidos pela presença de glóbulos vermelhos no lúmen) podem ser quantificados e comparados entre grupos experimentais usando plataformas estatísticas comerciais. Além de seu uso como um ensaio de angiogênese, este ensaio de tampão de gel de matriz pode ser usado para conduzir estudos genéticos e como uma plataforma para a descoberta de medicamentos. Em conclusão, este protocolo permitirá aos pesquisadores complementar os ensaios in vitro disponíveis para o estudo das interações endotelial-pericito e sua relevância para a angiogênese sistêmica ou pulmonar.

Introdução

A angiogénese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de uma rede vascular pré-existente e 1 é o foco da pesquisa em curso em muitas áreas, desde o desenvolvimento normal da doença. Este processo dinâmico envolve a proliferação e migração de células endoteliais (ECS) e recrutamento de pericitos para a construção de um tubo vascular que é dirigida para o local que necessita de oxigénio e de nutrientes de entrega 2. Para estudar este processo requer um ensaio dinâmico igualmente, o mais importante que pode recapitular a natureza tridimensional de formação de tubos. Os ensaios in vitro de matrizes 3D foram desenvolvidos para atender a essa necessidade e têm funcionado bem para permitir que pesquisadores para definir os passos discretos no espaço e no tempo em que a angiogénese ocorre 3, 4, 5, 6. No entanto, estes modelos in vitro de matrizes 3D estão limitadas a estudar navios não-perfundidos umd, por conseguinte, não têm componentes críticos pertinentes para o processo de angiogese (por exemplo, circulando o crescimento e factores inibitórios, a tensão não natural / forças através do leito vascular) e falhar para simular o ambiente complexo presente no tecido vivo. Para resolver esta limitação, vários ensaios in vivo da angiogénese têm sido desenvolvidos 7, incluindo o ensaio de tampão de gel de matriz, que será o foco do nosso relatório 8, 9.

O ensaio de matriz de tampão de gel é um ensaio in vivo de angiogénese bem estabelecido que atrai pesquisadores, pois proporciona uma plataforma robusta para testar os papéis dos diferentes células e substâncias na angiogênese. gel de matriz é uma membrana basal solução disponível comercialmente que é segregado pela linha celular de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de rato que solidifica em um material semelhante a gel a 37 ° C. A matriz de gel pode ser misturado com as células e / ou substâncias, tais como factores de crescimento, e injected subcutaneamente no mouse. O anfitrião ECs vai invadir a ficha ao longo de 14 dias, formar uma rede vascular, e tornar-se perfusão com sangue do hospedeiro. Até à data, os ensaios camada de gel de matriz têm-se centrado exclusivamente no estudo do comportamento da célula endotelial durante a angiogénese, no entanto, com o melhor de nosso conhecimento nenhum esforço foi feito ainda para determinar se este ensaio pode ser utilizado células endoteliais para co-cultura e pericitos para estudar como estes dois tipos de células interagem durante a angiogênese. Especificamente, a compreensão da relação entre ECs e pericitos é valioso para o estudo de doenças em que a perda de vasos sanguíneos é patológico, incluindo isquemia microvascular e doença vascular periférica 10, 11, 12.

Aqui, nós descrevemos um protocolo que introduz pericitos derivadas de humanos para a mistura de gel da matriz juntamente com ECs humano e factor de crescimento de fibroblastos (bFGF). Esta mistura pode então ser injectado por via subcutânea in o dorso de ratinhos SCID para permitir a formação de pericitos, revestidos, vasos híbridos totalmente funcionais. Nosso protocolo descreve como preparar tampões de gel matriz contendo ECs humanos com ou sem pericitos humanos, colocação em ratinhos SCID e como analisar os cortes histológicos para endpoints angiogênese críticos.

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Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Stanford University School of Medicine.

NOTA: Os animais estão sob anestesia com 3% de isoflurano vaporizador e fornecimento 3% de O2 gás. O uso de pomada veterinário nos olhos pode ajudar a prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia.

1. Preparação de células

  1. Crescer endoteliais e células pericyte culturas humanas em placas de 100 mm com 10 ml de a mídia apropriada. Substituir 10 ml de meio fresco a cada 2 - 3 dias até que as células atingir 80% de confluência.
    1. Cultura de células endoteliais (ECs) em meio completo de células endoteliais (ECM) suplementado com empresa fornecido 5% de soro fetal de bovino (FBS), 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento celular endotelial 10%.
    2. pericitos cultura em meios pericyte completo (PM) suplementado com empresa forneceu 2% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento pericyte 10%.
  2. Preparar misturas de células
    1. Calcula-se a quantidade necessária de células para os grupos experimentais e de controlo.
      NOTA: Cada plug no grupo experimental contém um milhão (1 x 10 6) ECs humana e duzentos mil (2 x 10 5) pericitos. Para o grupo controle, cada vela contém apenas 1,2 milhão de ECs humanos. O grupo de controlo negativo tem gel matriz única. Cada grupo deve incluir, pelo menos, quatro tomadas de corrente, o que exigiria dois ratos como tampões podem ser injectadas em cada lado de um rato parte inferior das costas. Três tampões serviria como triplicado para a experiência e o quarto pode ser utilizado no caso de uma falha. Preparar 25% de células adicionais para coincidir com o volume adicional de gel.
    2. Recolher e contar as células de placas de cultura.
      1. Para retirar as células, remova a mídia e lavar uma vez com fosfato de 1x temperatura ambiente salino (PBS). Remover PBS, adicionar 1 ml de 0,25% EDTA de tripsina / 2,21 mM, e incubar durante 1 min. Lave as células fora da placa por adição de 2ml de meio e recolher num tubo de 15 ml.
      2. A contagem de células utilizando um hemocitómetro de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Centrifuga-se o número adequado de células numa pelete a 400 xg durante 5 min. Para o grupo experimental, de centrifugação tanto ECs e pericitos para baixo junto em um pellet.

2. Preparação matriz de gel

  1. Descongelar completamente na matriz de gel a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite para se obter uma solução homogénea. Não é necessária mistura.
  2. aliquota gel de matriz em tubos de 1,5 ml e armazenar a 4 ° C.
  3. Pré-frio estéreis tubos de 1,5 ml e 28 g seringas de 1 cc de insulina, a 4 ° C. Cuidado: Mantenha gel matriz no gelo em todos os momentos.
  4. Misturar na matriz de gel frio com bFGF a uma proporção em volume de 1: 100 (concentração final de bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF solução estoque = 50 ug / ml) após reconstituição solução de gel matriz por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, incubar em gelo por 30 - 60 min bntes de mistura com as células no passo 3.1.
    NOTA: Descongelar o estoque bFGF antes da mistura. Calcular o número de fichas necessárias para a injecção. Por exemplo, cada plug requer 200 gel matriz ul. Por conseguinte, preparar 25% de gel adicional.

3. Misturar matriz de gel com células

  1. Para cada grupo, ressuspender o sedimento de células (número de células contendo o caso) com o volume calculado de gel de matriz contendo bFGF. Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e deixe no tubo de 15 ml em gelo até ratos são preparadas para injecção.

4. Rato Preparação

  1. 1 Anestesiar ratos SCID durante 5 minutos em 3% de isoflurano mais de O 2 a 3% em uma câmara de indução. Concentre-se em um grupo experimental, ratos ou 2, de cada vez.
  2. Remover o rato da câmara de indução, lugar em um lado ventral almofada de aquecimento para baixo e rapidamente anexar um bocal focinho até o rosto do rato através de um sistema não-reinalação para fornecer anestesia em todo o injeprocedimento cção. Comutar o fluxo de gás a partir da câmara de indução para o sistema de reciclagem do ar e não diminuir a pressão do gás de 1,5% de isoflurano e 1,5% de O 2.
  3. Remover pêlos de ambas as regiões traseiras laterais (cerca de 1 cm de diâmetro) com um creme da remoção da máquina de barbear ou cabelo.
  4. Limpar a área da pele com uma compressa de álcool de 70%.
  5. Devolver o mouse para a câmara de indução e repita os passos 4,2-4,4 com o segundo mouse.

5. Injecção matriz de gel

  1. Prepare um rato para injecção, anexando ao sistema não-reinalação e colocando no lado da almofada de aquecimento ventral para baixo.
  2. Carregar o gel matriz para uma pré-arrefecida de 28 g de 1 cc de insulina seringa um rato de cada vez.
    1. Carregar o volume de 500 ul de gel de matriz completa em dois tampões (200 ul por encaixe e ainda 25% adicionais) para dentro da seringa.
    2. Certifique-se para injectar o gel matriz para os ratos dentro de 3 min de carregar as células para dentro da seringa para impedir o cells se deposite no lado da seringa e para impedir a matriz de gel solidifique no interior da seringa.
  3. Levantar a pele volta para localizar espaço subcutâneo, em seguida, injectar 200 ul de gel matriz lentamente e uniformemente no espaço subcutâneo do posterior para trás da caixa torácica.
  4. Remover a agulha de injecção lentamente, tendo o cuidado de evitar a matriz de gel de vazar para fora do local de injecção. Uma colisão vai formar no local da injecção. Limpe local da injecção com uma compressa embebida em álcool.
  5. Repita os passos de injecção 5,2-5,5 no outro lado da parte traseira do rato, em seguida, deixar o mouse sobre as suas costas para 1 min para permitir a gelificação do gel matriz sobre a almofada de calor.
  6. Delinear as duas colisões usando um marcador permanente para identificar a colisão após 14 dias. Depois de algum cabelo volta a crescer, será mais fácil encontrar a colisão.

6. Matrix Gel plug Isolamento: 14 dias após a injecção

  1. Eutanásia com humanidade os ratos por exposição do animals a> 5 min de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical para assegurar a morte.
  2. Retire o bujão de gel matriz das costas do mouse.
    1. Remova cuidadosamente o cabelo de novo cultivadas em torno do local da injecção onde a ficha está localizado repetindo o passo 4.3. A linha de marcação indica o tamanho da colisão original sob a pele.
    2. Excisar o encaixe juntamente com a pele e os músculos que rodeiam as camadas unidas nos lados superior e inferior do tampão, respectivamente.
      1. Usando finas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na fronteira acentuada do tampão que é perpendicular à pele e cortar ao músculo debaixo do bujão. Em seguida, cuidadosamente cortada em torno da periferia do tampão ao longo da fronteira marcada.
      2. Retirar a ficha, mantendo-ensanduichada entre as camadas de pele e músculo. lave imediatamente em um pequeno copo com 1x PBS para lavar o excesso de sangue. A ficha está agora pronto para ser fixado (passo seguinte, 6.3).
  3. Corrigir os plug em 4% de paraformaldeído.
    1. Colocar todo o tampão, incluindo as camadas da pele e músculo, em um tubo de 50 ml com 25 ml de 4% de paraformaldeído durante 24 horas à temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, transferir o plugue em 25 ml de etanol a 70% durante mais 24 horas antes da inclusão em parafina.
      NOTA: Punho paraformaldeído com cautela. Use luvas.

7. Parafina Processo Matrix Gel plug

  1. Prepare o plug para inclusão em parafina.
    1. Orientar a ficha, como mostrado na Figura 1A; colocar a ficha numa cassete de tecido de modo que o lado da ficha é virada para cima e as duas camadas da pele e músculo são visíveis através da superfície do bloco de tecido que vai ser cortado em primeiro lugar durante o corte.
  2. Parafina incorporar a ficha de acordo com Parafina protocolos padrão 13.
  3. Corte 8 - 10 mm de espessura fora do bloco de tecido e montar em lâminas de microscópio According a parafina seccionamento protocolos padrão 13.
  4. Armazenar as lâminas em local seco e fresco à temperatura ambiente até que esteja pronto para a coloração.

8. Secções mancha com hematoxilina e eosina (H & E) 13

  1. De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte.
  2. solução de pipeta 100 mL H & E para a seção e incubar por 1-5 min, ou até que haja um claro contraste entre núcleos azuis e citoplasma rosa em uma célula como visto sob um microscópio de luz na posição vertical no aumento de 10x. Tenha cuidado para não deixar que qualquer solução H & E tocar o objectivo.
  3. solução de lavagem H & E fora do slide, molhando o slide em um grande copo de água da torneira, em seguida, coloque o slide em um rack no copo e lave com água corrente durante 2 min.
  4. Move para o passo 9.8 para montar os slides.

9. Stain outros slides para Capilares Humanos e pericitos

  1. De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte.
  2. Ferva as seções de solução de recuperação antigênica.
    1. Em um copo de 2 L, preparar a solução de recuperação de antigénio de ebulição usando 1x tampão de citrato (pH 7,0) a 95 ° C num bloco de aquecimento.
    2. Depois de ferver, coloque as lâminas em um rack de metal e mergulhe na solução de recuperação antigênica em ebulição durante 20 min.
    3. Cuidadosamente remover o copo do bloco de aquecimento com as lâminas submersas e ainda permitir que a solução voltar lentamente à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
    4. Colocar as lâminas em 1x PBS até o próximo passo.
  3. Bloquear as seções em tampão de bloqueio (1x PBS, 5% de soro de cabra, 00,3% de Triton X-100).
    1. Desenhar um círculo hidrófobo em torno das bordas de cada secção com uma caneta PAP.
    2. Colocar as lâminas em uma bandeja de humidade com água destilada na parte inferior do tabuleiro.
    3. Pipetar 100 ul de tampão de bloqueio para as secções assegurando-se todo o tecido é coberta por fluido (pode necessitar de mais de 100 uL).
    4. Incubar secções com tampão de bloqueio durante 1 h.
  4. Incubar seções com anticorpo primário.
    1. Preparar uma solução com dois anticorpos primários para sondar cada secção para CD31 (ECS) e actina do músculo liso (pericitos) diluída em tampão de diluição (PBS 1x, 1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
      NOTA: Aqui, a concentração de anti-CD31 é de 1:50 e concentração actina anti-músculo liso é de 1: 300.
    2. Incubam-se as secções durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários em uma bandeja de humidade contendo água destilada.
  5. Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST (PBS 1x + 0,1% TweEN20) durante 5 min cada lavagem.
  6. Incubar seções com anticorpo secundário.
    1. Prepara-se uma solução com um anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugada com fluoróforo para reconhecer o anticorpo de coelho anti-CD31 diluído no tampão de diluição.
      1. NOTA: O anticorpo primário actina de músculo liso já é conjugado com um fluoróforo CY3, assim, não coloração do anticorpo secundário é necessária. coelho concentração de anticorpo secundário de cabra anti-é de 1: 250.
    2. Incubar as secções durante 1 hora com anticorpo secundário ul 100 na bandeja de umidade contendo água destilada.
  7. Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST, durante 5 min cada lavagem.
  8. Montar os slides.
    1. Pipetar 2 - 3 gotas (~ 40 - 60 L) de solução antifade montagem com coloração nuclear DAPI em cada secção.
    2. Delicadamente, coloque um não. 1,5 tampa de deslizamento sobre as seções e solução de montagem, permitindo que o fluido para se espalhar sobre as seções e as bordasa lamela. Suavemente utilizar um dedo para pressionar para fora as bolhas de ar que podem ser localizados ao longo do percurso.
    3. Deixe que as lâminas secar por pelo menos 1 hora antes de utilizar.

10. Quantificar Capilar Densidade e Estrutura 14

  1. Contar o número de capilares em H & E secções coradas, expressa como # / mm 2.
    1. Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de luz na posição vertical sob 40X.
      NOTA: Os capilares são identificados como tubos cheios com células vermelhas do sangue.
    2. Alternativamente, em vez de capilares contando manualmente, use imagem software de análise (por exemplo, Wimasis Análise de Imagem) para quantificar vários parâmetros de angiogênese, como o número de navio, comprimento médio navio e diâmetro, e pontos de ramificação.
  2. Analisar a estrutura capilar em seções de imunofluorescência corados.
    1. Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de fluorescência invertidacom cubo de filtro FITC e TxRed.
      1. Use um cubo FITC para a imagem ECs por excitação a 488 nm de comprimento de onda e usar um cubo TxRed de pericitos de imagem por excitação a 594 nm de comprimento de onda.

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Resultados

Representante H & E e imunofluorescência coloração das seções camada de gel de matriz são mostrados na Figura 2. Os pontos de CE apenas fichas de exibir alguns vasos que na maioria não são perfundidos com sangue (Figura 2 parte superior esquerda, setas pretas), enquanto fichas contendo tanto ECs e pericitos mostrar vários perfundido vasos com diâmetros maiores e cobertura pericyte completa, como evidenciado por coloração SMA positivo imediatamente ad...

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Discussão

O ensaio de tampão de gel de matriz tem provado ser um método conveniente e poderoso para avaliar a regulação do gene na angiogénese, os compostos angiogénicos e anti-angiogénicos in vivo, e para complementar os testes in vitro. Aqui, descrevemos em detalhe um ensaio tampão de gel matriz novela de angiogênese humana que investiga a interação entre as células endoteliais e pericitos durante a formação de vasos.

Existem alguns passos novos e críticos neste protocolo....

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Divulgações

Nenhum interesse financeiro conflitante está incluído.

Agradecimentos

Dr. K. Yuan foi apoiado por um Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (15SDG25710448) e pelo Prêmio de Prova de Conceito da Associação de Hipertensão Pulmonar (SPO121940). O Dr. V. de Jesus Perez foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento de carreira da Fundação Robert Wood Johnson, um prêmio NIH K08 HL105884-01, um Prêmio da Associação de Hipertensão Pulmonar, um Prêmio de Pesquisa Biomédica da American Lung Association e um Prêmio de Pesquisa Translacional e Medicina Aplicada prêmio da Universidade de Stanford.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBS (Solução salina tamponada com fosfato)Corning21-031-CV
0,25% Tripsina/0,53 mM EDTACorning25-053-CI
Kit de mídia de células endoteliais (ECM)Sciencell1001inclui mídia, suplemento de crescimento EC e penicilina/estreptomicina, cada um fornecido no volume apropriado para fácil mistura
Kit de mídia pericitária (PM)Sciencell1201inclui meios, suplemento de crescimento de pericitos e penicilina/estreptomicina, cada um fornecido no volume apropriado para facilitar a mistura
de células endoteliais microvasculares pulmonares humanas primáriasIniciativa de Avanço da Hipertensão Pulmonareste tipo de célula também está disponível comercialmente. Células usadas na passagem 1-4
pericitos pulmonares humanos primáriosIniciativa de Avanço da Hipertensão Pulmonareste tipo de célula não está disponível comercialmente, mas os paricitos cerebrais estão.  Células usadas na passagem 1-4
bFGF (Fator de Crescimento de Fibroblastos básico)Peprotech100-18Bsolução estoque é 50 μ g/ml em 0,1% BSA em PBS, alíquotas a 50 μ l e armazenado a -20 graus
Matriz de Membrana Basal MatrigelBD356237
28 G 1 cc Seringa InsluinBD329410
SCID (Deficiência Imunológica Combinada Grave) camundongosThe Jackson Laboratory5557NOD. A cepa SCID IL2R gamma knockout é a melhor cepa; 4-6 semanas de idade
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, estéreisThermo Fisher Scientific05-408-129
Tubos com tampa de rosca de 15 ml, estérilBD Biosciences352096
caneta PAP HemocitômetroLife Technologies8899
ThermoFisher Scientific02-671-6
Creme de depilação NairWalmart
anticorpo primário CD31 anti-humanoLifeSpan BiosciencesLS-B4737solução de trabalho é 1:50
anti-humano Smooth Muscle actina CY3 anticorpo fluorescente primárioSigmaC6198solução de trabalho é 1:300
anticorpo secundário anti-coelho de cabra; 488 / verdeThermoFisher ScientificA-11008solução de trabalho é 1:250
Prolongar a solução DAPI de ouroCélula Lâminas de microscópio de sinalização8961S
VWR48300-047
nº 1.5 lamínulasThermo Fisher Scientific12-544-D
10xMillipore21545
Fine Science Tools14084-08
Formalina (paraformaldeído)Thermo Fisher Scientific245-685
de tecidoSimportM492-12
soro de cabraDakoX0907
Tampão de citrato Tesoura cirúrgica extra fina

Referências

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
  4. Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
  5. Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
  6. Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
  7. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
  8. Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
  9. Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
  10. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
  11. Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
  12. Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
  13. Buchwalow, I. B., Bocker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
  14. Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Angiogênese In VivoCélulas Endoteliais HumanasCultura de Células de ParasitasModelo de Camundongos SCIDAnálise HistológicaCobertura de PericitosMaturação VascularFormação de Vasos Sanguíneos
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