Artigo de método

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

DOI:

10.3791/54617

⸱

19 de dezembro de 2016

 ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Cardiovascular Institute, School of Medicine, Stanford University, 3VA Palo Alto Health Care System, Department of Cardiothoracic Surgery, School of Medicine, Stanford University

Neste artigo

Resumo

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Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

Resumo

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A angiogênese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de vasos existentes. O crescimento de novos vasos requer proliferação, migração e alinhamento coordenados de células endoteliais para formar estruturas tubulares, seguidos pelo recrutamento de pericitos para fornecer suporte mural e facilitar a maturação dos vasos. As abordagens atuais de cultura de células in vitro não podem reproduzir totalmente o ambiente biológico complexo onde as células endoteliais e os pericitos interagem para produzir vasos funcionais. Apresentamos uma nova aplicação do ensaio de tampão de gel de matriz in vivo para estudar as interações endotelial-pericito e a formação de vasos sanguíneos funcionais usando camundongos com mutação de imunodeficiência combinada grave (SCID). Resumidamente, o gel de matriz é misturado com uma solução contendo células endoteliais com ou sem pericitos, seguido de injeção nas costas de camundongos SCID anestesiados. Após 14 dias, os tampões de gel da matriz são removidos, fixados e seccionados para análise histológica. O comprimento, número, tamanho e extensão da cobertura de pericitos de vasos maduros (definidos pela presença de glóbulos vermelhos no lúmen) podem ser quantificados e comparados entre grupos experimentais usando plataformas estatísticas comerciais. Além de seu uso como um ensaio de angiogênese, este ensaio de tampão de gel de matriz pode ser usado para conduzir estudos genéticos e como uma plataforma para a descoberta de medicamentos. Em conclusão, este protocolo permitirá aos pesquisadores complementar os ensaios in vitro disponíveis para o estudo das interações endotelial-pericito e sua relevância para a angiogênese sistêmica ou pulmonar.

Introdução

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A angiogénese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de uma rede vascular pré-existente e 1 é o foco da pesquisa em curso em muitas áreas, desde o desenvolvimento normal da doença. Este processo dinâmico envolve a proliferação e migração de células endoteliais (ECS) e recrutamento de pericitos para a construção de um tubo vascular que é dirigida para o local que necessita de oxigénio e de nutrientes de entrega 2. Para estudar este processo requer um ensaio dinâmico igualmente, o mais importante que pode recapitular a natureza tridimensional de formação de tubos. Os ensaios in vitro de matrizes 3D fo....

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Protocolo

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Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Stanford University School of Medicine.

NOTA: Os animais estão sob anestesia com 3% de isoflurano vaporizador e fornecimento 3% de O2 gás. O uso de pomada veterinário nos olhos pode ajudar a prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia.

1. Preparação de células

  1. Crescer endoteliais e células pericyte culturas humanas em placas de 100 mm com 10 ml de a mídia apropriada. Substituir 10 ml de meio fresco a cada 2 - 3 dias até que as células atingir 80% de confluência.
    1. Cultura de células endoteli....

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Resultados

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Representante H & E e imunofluorescência coloração das seções camada de gel de matriz são mostrados na Figura 2. Os pontos de CE apenas fichas de exibir alguns vasos que na maioria não são perfundidos com sangue (Figura 2 parte superior esquerda, setas pretas), enquanto fichas contendo tanto ECs e pericitos mostrar vários perfundido vasos com diâmetros maiores e cobertura pericyte completa, como evidenciado por coloração SMA positivo imediatamente ad.......

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Discussão

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O ensaio de tampão de gel de matriz tem provado ser um método conveniente e poderoso para avaliar a regulação do gene na angiogénese, os compostos angiogénicos e anti-angiogénicos in vivo, e para complementar os testes in vitro. Aqui, descrevemos em detalhe um ensaio tampão de gel matriz novela de angiogênese humana que investiga a interação entre as células endoteliais e pericitos durante a formação de vasos.

Existem alguns passos novos e críticos neste protocolo........

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Divulgações

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Nenhum interesse financeiro conflitante está incluído.

Agradecimentos

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Dr. K. Yuan foi apoiado por um Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (15SDG25710448) e pelo Prêmio de Prova de Conceito da Associação de Hipertensão Pulmonar (SPO121940). O Dr. V. de Jesus Perez foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento de carreira da Fundação Robert Wood Johnson, um prêmio NIH K08 HL105884-01, um Prêmio da Associação de Hipertensão Pulmonar, um Prêmio de Pesquisa Biomédica da American Lung Association e um Prêmio de Pesquisa Translacional e Medicina Aplicada prêmio da Universidade de Stanford.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBS (Solução salina tamponada com fosfato)Corning21-031-CV
0,25% Tripsina/0,53 mM EDTACorning25-053-CI
Kit de mídia de células endoteliais (ECM)Sciencell1001inclui mídia, suplemento de crescimento EC e penicilina/estreptomicina, cada um fornecido no volume apropriado para fácil mistura
Kit de mídia pericitária (PM)Sciencell1201inclui meios, suplemento de crescimento de pericitos e penicilina/estreptomicina, cada um fornecido no volume apropriado para facilitar a mistura
de células endoteliais microvasculares pulmonares humanas primáriasIniciativa de Avanço da Hipertensão Pulmonareste tipo de célula também está disponível comercialmente. Células usadas na passagem 1-4
pericitos pulmonares humanos primáriosIniciativa de Avanço da Hipertensão Pulmonareste tipo de célula não está disponível comercialmente, mas os paricitos cerebrais estão.  Células usadas na passagem 1-4
bFGF (Fator de Crescimento de Fibroblastos básico)Peprotech100-18Bsolução estoque é 50 μ g/ml em 0,1% BSA em PBS, alíquotas a 50 μ l e armazenado a -20 graus
Matriz de Membrana Basal MatrigelBD356237
28 G 1 cc Seringa InsluinBD329410
SCID (Deficiência Imunológica Combinada Grave) camundongosThe Jackson Laboratory5557NOD. A cepa SCID IL2R gamma knockout é a melhor cepa; 4-6 semanas de idade
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, estéreisThermo Fisher Scientific05-408-129
Tubos com tampa de rosca de 15 ml, estérilBD Biosciences352096
caneta PAP HemocitômetroLife Technologies8899
ThermoFisher Scientific02-671-6
Creme de depilação NairWalmart
anticorpo primário CD31 anti-humanoLifeSpan BiosciencesLS-B4737solução de trabalho é 1:50
anti-humano Smooth Muscle actina CY3 anticorpo fluorescente primárioSigmaC6198solução de trabalho é 1:300
anticorpo secundário anti-coelho de cabra; 488 / verdeThermoFisher ScientificA-11008solução de trabalho é 1:250
Prolongar a solução DAPI de ouroCélula Lâminas de microscópio de sinalização8961S
VWR48300-047
nº 1.5 lamínulasThermo Fisher Scientific12-544-D
10xMillipore21545
Fine Science Tools14084-08
Formalina (paraformaldeído)Thermo Fisher Scientific245-685
de tecidoSimportM492-12
soro de cabraDakoX0907
Tampão de citrato Tesoura cirúrgica extra fina

Referências

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  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E.

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