Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Resumo

Protocolos que usam barreiras impermeáveis para bloquear eventos de indução entre os tecidos do eixo e flanco do corpo principal no embrião de galinha necessários para a formação do membro são descritos. Grânulos embebidos em sinais indutivos candidatos são usados para superar o efeito da colocação da barreira e a análise da expressão gênica confirma isso.

Resumo

O embrião de galinha fornece um modelo vertebrado excelente que pode ser usado para dissecar questões de desenvolvimento de uma forma direta. Sua acessibilidade e robustez após intervenção cirúrgica são os pontos fortes experimentais chave. Placas de mica foram as primeiras barreiras usadas para evitar membro pintainho bud iniciação ^1. Protocolos que utilizam uma folha de alumínio como uma barreira impermeável à bud asa ou indução perna botão e ou iniciação são descritos. Combinamos esta técnica com laterais colocação talão para a barreira para exogenamente fatores endógenos candidatos de abastecimento que foram bloqueados pela barreira. Os resultados são analisados utilizando a hibridação in situ da expressão do gene subsequente. Nosso foco principal é sobre o papel da sinalização do ácido retinóico na indução e iniciação depois de o primeiro plano embrião de galinha e dos membros posteriores. Usamos BMS 493 (um agonista inverso de receptores do ácido retinóico (RAR)) grânulos embebidos implantados na mesoderme lateral (LPM) para imitar o efeito de uma barrarier colocado entre os sómitos (uma fonte de ácido retinóico (RA) e o LPM) a partir da qual crescem brotos dos membros. versões modificadas destes protocolos também poderia ser usado para abordar outras questões sobre a origem eo calendário das pistas indutivos. Desde que a região do embrião de galinha é acessível no estágio de desenvolvimento relevante, uma barreira pode ser colocado entre os dois tecidos e consequentes alterações no desenvolvimento estudados. Exemplos podem ser encontrados no cérebro, a extensão do eixo em desenvolvimento e no desenvolvimento de órgãos, tais como a indução de fígado ou rim.

Introdução

embriologistas clássicos tradicionalmente empregadas técnicas físicas para interrogar os mecanismos que controlam o desenvolvimento embrionário. Nos anos 1960 e 1970, os investigadores desenvolveram técnicas que usaram barreiras impermeáveis ​​inseridos entre tecidos do embrião em desenvolvimento para demonstrar a importância de sinais indutores durante a embriogênese. Nosso interesse é o desenvolvimento dos membros de vertebrados e, em particular, os eventos que precedem membro bud crescimento. Por exemplo, a inserção de uma barreira pode impedir brotos de membros crescimento ocorra de um lado do embrião de galinha, enquanto que lhe permita continuar normalmente sobre o lado contralateral não operado. Os materiais utilizados para fazer essas barreiras variada; por exemplo, placas de mica ¹ e tântalo folha ^2. Estas barreiras eficazmente separar a mesoderme lateral (LPM), a partir do qual as formas de brotos de membros, dos somitos formada a partir da mesoderme paraxial. técnicas de enxerto cirúrgico demonstram que perto sagacidade associaçãoh somitos é essencial para a iniciação brotos de membros é que ocorra no LPM ^{3 4.} Nos anos 80 e 90 biólogos do desenvolvimento descobriu difusível moléculas que são essenciais no controle de processos de desenvolvimento sinalização. Grânulos embebido com essas moléculas de sinalização pode ser implantado em regiões específicas do embrião e produzem alterações de desenvolvimento embrionário. Por exemplo, o ácido retinóico (RA) ocupada por grânulos de troca iônica é liberado ao longo de um período de 24 horas, quando implantada em um embrião de galinha e pode produzir a duplicação espelho-imagem dos dígitos ^5. Heparina contas de acrílico contendo proteína FGF pode iniciar membro bud conseqüência da LPM interlimb ^6.

Mais recentemente rato e peixe genética tomaram o estudo da iniciação vertebrados membro em uma nova era (revisto em ^7). Há boas evidências de que a AR presente em somitos antes do início do membro bud é o sinal difusível essencial pretendida pelo LPM para iniciar membro brotação. Nós quisemos explorar a acessibilidade e robustez experimental do embrião de galinha para dissecar os efeitos do implante de barreira na expressão do gene na LPM em torno do momento do início do membro bud. Uma nova adaptação do nosso método é combinar uma barreira que bloqueia os sinais provenientes de tecidos axiais com talões de lateral para a barreira a factores endógenos candidatos fornecimento exogenamente que foram bloqueados pela barreira. Os seguintes protocolos são aqueles desenvolvidos para destrinchar os mecanismos de indução botão do membro e iniciação.

Estudar iniciação membro bud significa o uso de embriões em fase inicial. Muitos ovos janela pesquisadores de frango por primeiro remover alguns dos albumina através do saco de ar com uma agulha hipodérmica. O embrião, que se encontra em cima da gema, então encontram-se menor no ovo. Esta é uma vantagem para algumas técnicas, tais como electroporação, mas pode ser uma desvantagem se a manipulação cirúrgica do embrião é desejada.Encontramos tendo o embrião o mais próximo possível da abertura na ovo quanto possível, é uma vantagem.

Questões permanecem sobre os sinais que controlam a indução botão do membro dos vertebrados e iniciação e os seguintes protocolos são adequados para resolvê-los. Somos o primeiro a desenvolver um protocolo para a inserção de barreiras para impedir que membros do pintainho bud crescimento numa fase mais cedo do estágio 12 ^8. versões modificadas destes protocolos também poderia ser usado para abordar outras questões sobre a origem eo calendário das pistas indutivos, onde um tecido indutor acessíveis, adjacente ao primórdio sendo induzido. Desde que a região do embrião é acessível na fase de desenvolvimento correspondente, em seguida, uma barreira pode ser colocado entre os dois tecidos e consequentes alterações no desenvolvimento estudados. Exemplos podem ser encontrados no desenvolvimento do cérebro, a extensão do eixo e possivelmente desenvolvimento de órgãos, tais como a indução de fígado ou rim.

Protocolo

O protocolo seguinte utiliza embriões de galinha em menos de dez dias de incubação. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Faculdade Londres do rei, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office.

1. Preparação necessária antes em Chick Embryo Operação

1. Reúna os seguintes instrumentos cirúrgicos necessários para as operações, para a colheita e para a fixação dos embriões de galinha: Dois pares de No. 5 relojoeiros fórceps, um par de fórceps fortes, por exemplo, do tipo AA, tesouras curvas com lâminas de 2,5 cm de comprimento, sem corte terminou curvado pinças com extremidades aproximadamente 0,5 cm de comprimento, e também dois pares de No. 4 relojoeiros pinça para usar ao fazer barreiras folha (1.6.3).
2. Faça um micro faca de um pino de aço (0,3 mm de diâmetro) afiada usando o óleo em uma pedra de amolar. Utilizando um microscópio binocular, afiar a ponta do pino de uma lâmina plana. Coloque o pino em um suporte de agulha e proteger a sua ponta afiada de ser batido e dented.
   NOTA: Os invólucros a faca com uma ponta de 1.000 mL pipeta é uma opção simples para isso.
3. Preparar etanol a 70% em um frasco de lavagem de plástico. Use um esguicho de presente em um lenço de papel para limpar os instrumentos cirúrgicos e do micro faca antes e após o uso para esterilizar e limpá-los.
4. Compre 5 cm de largura fita adesiva clara e um distribuidor adequado. Localizar ou fabricar um descanso adequado para manter um ovo de galinha constante em seu lado.
5. Fazer e soluções de loja para contas de imersão.
   1. Prepara-se uma solução de 0,35 mg / ml de proteína (FGF4) Crescimento de Fibroblastos Factor de 4 a partir de 1 mg de estoque congelada / ml diluindo-a com água e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 30 ul.
   2. Preparar as soluções (ou 0,05 ou 0,1 mg / ml) de todo-trans-retinóico (RA) diluiu-se com sulfóxido de dimetilo (DMSO) em tubos de microcentrífuga escuras de um estoque a 5 mg / ml. Armazenar o estoque e 100 mL alíquotas a -20 ° C.
   3. Preparar as soluções (ou 2,5 ou 5 mg / ml) de BMS 493 (um AG inversaonist dos RAR) diluída com DMSO em tubos de microcentrífuga escuras a partir de um 10 mg estoque / ml. Armazenar o estoque e 100 mL alíquotas a -20 ° C.
6. Faça barreiras de folha de alumínio.
   NOTA: A folha usado para fazer as barreiras é a folha de restauração padrão (medida pelo micrómetro de 0,013 mm de espessura). Qualquer folha de alumínio doméstica provavelmente seria adequado.
   1. Cortar um pedaço quadrado de 1 cm de folha de alumínio e esterilizá-lo, limpando-o com 70% de etanol em um tecido. Coloque-o em um 6 centímetros de plástico estéril placa de Petri. Descartar a tampa e fazer uma tampa para o prato de folha.
      NOTA: Isto irá prevenir as barreiras de corte da tarde degola para a tampa de plástico do prato devido à estática.
   2. Colocar a placa de Petri por cima de uma retícula fase (1 cm de comprimento dividido em secções 100) sob um microscópio binocular com ampliação definida como 1,6X. Usando uma pequena lâmina de bisturi No.15, cortar tiras da folha a uma largura exata, por exemplo, 0,7 mm ou 1,3 mm.
   3. Separe a folhatiras usando dois pares de No. 4 relojoeiros fórceps. Em seguida, fazer uma curva em ângulo recto no centro da folha de barreira de tal modo que se assemelha a uma dobradiça da largura específica.
      NOTA: Esta forma de barreira é feita a partir de ^{9, 10.} Uma barreira articulada permanece no lugar melhor do que uma barreira em linha reta, plana. No. 4 pinças são relativamente brusco e são usados ​​porque eles são menos propensos a fazer mossas ou pontuações nas barreiras de alumínio.
   4. Line up as barreiras no centro da placa de Petri com um lado plano contra o prato eo outro apontando para cima para fora do prato, movendo a folha sem cortes restantes para um lado. Prepare 20 ou mais barreiras antes do dia de operação. Coloque a tampa da folha sobre o prato e armazenar os obstáculos em um lugar onde não será perturbado.
      NOTA: Mesmo uma leve batida pode derrubar as barreiras mais ou significa que eles ficar com estática para os lados do prato.
7. Incubar ovos de galinha fertilizados em seus lados em bandejas de ovos de papelão em 38 °C durante o período de tempo apropriado antes do dia da operação de tal modo que os embriões será desejado na fase ^8.

2. Preparação de pintainho de embriões e grânulos em Operação Dia

1. 'Janela' incubados ovos de galinha.
   NOTA: O método a seguir para a abertura de ovos foi transmitida por Dennis Summerbell (não publicado).
   1. Com o ovo deitado de lado, perfurar o fim brusco (ar final sac) do ovo com tipo AA forceps fortes certificando-se que a membrana interna da casca foi quebrado. Para fazer isso aperto da pinça com firmeza e use um movimento esfaqueamento controlada, mantendo o ovo com a mão livre.
   2. Leve o ovo, ainda deitado de lado, com ambas as mãos (um de cada lado) transformá-lo em 180 ° no eixo horizontal e substituí-lo na bandeja do ovo de tal forma que o lado que era mais elevada está agora ao lado da bandeja.
      NOTA: Este solta o embrião das membranas da casca e significará que o embrião é leSS susceptível de ser cortada quando o reservatório acima do embrião é removido.
   3. Pegue um pedaço de fita adesiva transparente aproximadamente 5 cm quadrado e cole isto de perto sobre a superfície superior do ovo para parar a casca de ovo de ruir sobre o embrião quando o ovo é aberto.
   4. Use as tesouras curvadas para quebrar suavemente através do invólucro e as suas membranas no centro da parte superior do ovo, fazer um pequeno orifício com uma lâmina da tesoura de modo que o ar possa entrar no ovo sobre o embrião (que se encontra apenas sob a parte superior do escudo).
      Nota: por apenas quebrar as membranas da casca e não quebrar qualquer das membranas que cobrem o embrião, o ar de entrar no ovo vai separar o embrião a partir da casca e o embrião virá a restante no topo da gema de cerca de 0,5-1 cm do escudo .
   5. Use a tesoura curva para aumentar o buraco na casca de um círculo com um diâmetro de aproximadamente 1 cm. Remover a peça de concha excisada e cobrir o buraco no ovo com umpedaço de fita adesiva transparente aproximadamente 5 cm quadrado. Para remover facilmente esta fita, pressione a fita para colocá-lo apenas na borda do buraco, deixando o restante da fita livre. A fita livre pode então ser apreendido, para abrir o ovo.
2. embriões em estágio
   1. Após incubação a 38 ° C (ver passo 1.7) e de janelas (passo 2.1), utilizar um microscópio binocular para encenar os embriões de pinto de acordo com a ^8. Faça isso logo antes que os ovos são selados na sequência de janelas. Faça o estágio de cada embrião na casca de ovo. Devolver os ovos para a incubadora.
      NOTA: Os embriões em estágios entre 8 e 15 são adequados para barreira e talão experimentos. Os embriões são mais propensos a sobreviver se eles não foram deixados de fora da incubadora por muito tempo antes da operação.
3. grânulos de imersão antes da operação.
   1. FGF4
      1. Aqui o número de contas de gel de cromatografia de afinidade (150-300 pM) que ficar com a extremidade de uma ponta de pipeta de 1000 mL e estavah-los em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) num tubo de microcentrífuga para remover a azida eles são armazenados em. Centrifugar durante 5 seg, descartar o PBS e repetir o processo duas vezes.
      2. Embeber os grânulos de gel numa queda de 30 uL de 0,35 mg / ml de proteína FGF4 numa placa de Petri estéril em gelo durante 30 min. Escolha os grânulos de aproximadamente 150 um de diâmetro com No. 5 micropinças para inserção no embrião.
         NOTA: Manipular esferas de resina de troca iônica usado nas etapas a seguir com o n.º 5 micropinças e pega-los com muito cuidado, porque as contas são frágeis e podem quebrar se apertou com muita força. Este aviso aplica-se a 2.3.2-2.3.3 e todas as operações de resina talão.
   2. RA
      1. Descongelar uma alíquota de 0,05 ou 0,1 mg / ml de all-trans-RA diluída com DMSO e colocar uma gota 100 ul numa placa de Petri estéril (9 cm de diâmetro), que foi previamente coberto de folha para proteger a RA da luz. Tome uma ponta de pipeta 10 ul e pegar alguma troca forma de ião cloretopérolas de resina na sua extremidade e mergulhar estes no gota RA protegida da luz à temperatura ambiente durante 20 min.
      2. Lavar as pérolas em três gotas sucessivas de 100 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) colocados na mesma placa de Petri, pelo menos, 1 cm de distância.
         NOTA: Os grânulos de absorver o corante vermelho de fenol a partir do meio DMEM. Este método baseia-se em ^5.
      3. Escolha os grânulos de aproximadamente 100 um de diâmetro (grânulos variam em tamanho de 75-180 uM quando molhado) para inserção dentro do embrião, usando uma retícula corrediça platina do microscópio sob a placa de Petri e No.5 micropinças para manter os grânulos. Ao escolher-se o cordão a partir da queda de 100 ul de DMEM, em primeiro lugar o talão para baixo para a placa de Petri e remover qualquer DMEM remanescente a partir dele, quer pressionando o rebordo para fora da gota ou colocando a pinça fechada ao lado do cordão (capilar acção chama o líquido para fora do grânulo).
   3. BMS 493
      1. Quanto ao RA (2.3.2), mergulhe permuta de iõespérolas de resina em um ange gota 100 ul de 2,5 ou 5,0 mg / ml de BMS 493 em DMSO a temperatura ambiente durante 20 min e depois enxaguar em 100 ul de DMEM gotas. Escolha os grânulos de aproximadamente 100 um de diâmetro para inserção no embrião.
   4. controle de DMSO
      1. Como para a RA (2.3.2), embeber os grânulos de resina de permuta iónica numa gota de 100 ul de DMSO à temperatura ambiente durante 20 min e depois enxaguar em 100 ul de DMEM gotas. Escolha os grânulos de aproximadamente 100 um de diâmetro para inserção no embrião.

3. As operações de barreira e Bead

Figura 1. Esquema de Chick embriões de várias fases mostrando onde Barreiras e ou grânulos deve ser colocado. (A) Stage 13 embrião de galinha posição exibição esquemática de barreira (linha verde) entre somites e LPM na presunçãonível da asa tiva (somitos 15-20). (B) O mesmo esquema como em (A), indicando onde RA talão (círculo vermelho) deve ser colocada antes da inserção barreira. (C) posição esquemático mostrando barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo (somites 26-32) em um estágio de 15 embriões. (D) O mesmo esquema como em (C), que indica quando um talão RA (círculo vermelho) deve ser colocado. (E) esquemático indicando onde BMS 493 esferas (círculos roxos) deve ser colocado na LPM de uma fase 15 de embrião. (F) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 9 que indica a posição de barreira (linha verde) entre a mesoderme presomitic e LPM ao nível da asa presuntivo. (G) Diagrama esquemático de um embrião em fase 9, que mostra as posições de uma barreira (linha verde) e talão RA (círculo vermelho). (H) Diagrama esquemático de um embrião de galinha fase 10 que mostra a posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo. (I 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Barreira inserido na fase de 13 para evitar asa de iniciação bud.
   1. Tomar um embrião em fase 13 da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido. Remover a camada superior da fita adesiva transparente.
      1. Utilizando um aço micro faca, fazer uma incisão através da membrana vitelina e lateral placa mesoderme (LPM) adjacente à somitos de 15 a 20 (Figura 1A) no lado direito do embrião (somitos não têm todos formados nesta fase). Corte ao lado dos últimos quatro somites formados e continuar o corte dois comprimentos somite caudal.
      2. Pegar a barreira (0,7-1 mm de largura) com No. 5 microforceps no final saliente da placa de Petri e torcer a mão para inserir a extremidade livre da barreira dentro da incisão. A barreira em forma de dobradiça fica plana sobre a membrana vitelina acima da LPM com metade dela salientes para baixo através do distal incisão para somitos. O mais rapidamente possível selar o ovo com fita adesiva transparente e devolvê-lo para a incubadora.
         NOTA: O micro faca e pinças se tornar pegajosa em contato com a membrana vitelina. É importante limpe-os com etanol 70% antes de tentar uma operação subsequente. Isso se aplica a todas as descrições de operação subsequentes e a talão implantes.
      3. Se um grânulo é para ser inserido, em conjunto com uma barreira; em primeiro lugar, tomar o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no rosto cortado da LPM no lado distal da incisão e, em seguida, insira a barreira para o proximal incisão ao cordão (Figura 1B). Selar o ovo e devolvê-lo imediatamente para a incubadora.
2. Barreira inserido na fase 15 para prevenir a iniciação broto perna.
   NOTA: Um exemplo do resultado desta operação na expressão do factor de transcrição Tbox 4 (Tbx4) é mostrado na Figura 2D e 2E.
   1. Aqui uma fase 15 de embrião da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido. Remover a camada superior da fita adesiva transparente.
      1. Utilizando um aço micro faca fazer uma incisão através da membrana vitelina e LPM adjacente ao somitos 26 a 32 (Figura 1C) no lado direito do embrião (somitos não têm todos formados nesta fase). Corte ao lado das duas últimas somites formados e continuar o corte cinco comprimentos somite caudal.
      2. Pegar a barreira (1.2-1.3 mm de largura) com No. 5 micropinças em uma extremidade e torcer a barreira para inserir a extremidade livre na incisão. O mais rapidamente possível selar o ovo com clara fita de umND retorná-lo para a incubadora.
         NOTA: A dobradiça de barreira em forma fica plana sobre a membrana vitelina acima da LPM com metade dela salientes para baixo através do distal incisão para somitos.
      3. Se um grânulo é para ser inserido, em conjunto com uma barreira, em primeiro lugar, tomar o grânulo em No. 5 microfórceps e inseri-la na face cortada da LPM no lado distal da incisão e em seguida inserir a barreira para a incisão para proximal o rebordo (Figura 1D). Selar o ovo e devolvê-lo imediatamente para a incubadora.
      4. Se uma conta ou contas são para ser inserido sem uma barreira, por exemplo, BMS 493 grânulos para a região da perna na fase 15, não fazem a incisão longa (3.2.2.1). Fazer uma pequena incisão através da membrana vitelina e para o LPM na posição do cordão está a ser colocado. Leve o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no orifício na LPM. Empurre-o um pouco mais com as extremidades fechadas dos fórceps (Figura 1E).
3. Barreira inserido no estágio 9 para evitar a indução de gemas laterais e iniciação.
   1. Aqui uma fase 8 ou 9 embrião da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido.
      1. Utilizando um aço micro faca fazer uma incisão através da membrana vitelina e LPM lateral e rostral à linha primitiva, na extremidade caudal do embrião em linha com os sómitos (Figura 1F) cerca de 5 comprimentos de somito longo.
      2. Escolher-se a barreira (0,7-1 mm de largura) com microfórceps No. 5 no final saliente da placa de Petri e torcer a mão para inserir a extremidade livre da barreira dentro da incisão. O mais rapidamente possível selar o ovo com fita adesiva transparente e devolvê-lo para a incubadora.
         NOTA: A charneira em forma de barreira encontra-se horizontalmente sobre a membrana vitelina acima do LPM com metade saliente para baixo através da incisão.
      3. Se uma pérola está a ser inserted em conjunto com uma barreira; em primeiro lugar, tomar o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no rosto cortado da LPM no lado distal da incisão e, em seguida, insira a barreira para o proximal incisão ao cordão (Figura 1G). Selar o ovo e devolvê-lo imediatamente para a incubadora.
4. Barreira inserido na fase de 10 para evitar a indução de gemas perna e iniciação.
   NOTA: Um exemplo do resultado desta operação na expressão Tbx4 é mostrada na Figura 2G.
   1. Tomar um embrião em fase 10 da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido.
      1. Utilizando um aço micro faca fazer uma incisão através da membrana vitelina e LPM lateral à linha primitiva, na extremidade caudal do embrião em linha com os sómitos (Figura 1H), aproximadamente, 6 somito comprimentos longos.
      2. Pegar a barreira (1.2mm de largura) com microfórceps No. 5 no final saliente da placa de Petri e torcer a mão para inserir a extremidade livre da barreira dentro da incisão. O mais rapidamente possível selar o ovo com fita adesiva transparente e devolvê-lo para a incubadora.
         NOTA: A charneira em forma de barreira encontra-se horizontalmente sobre a membrana vitelina acima do LPM com metade saliente para baixo através da incisão.
      3. Se um grânulo é para ser inserido sem uma barreira, por exemplo, BMS 493 cordão para a região de perna na fase 10, fazer uma pequena incisão através da membrana vitelina e para o LPM na posição do cordão está a ser colocado. Leve o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no orifício na LPM. Empurre-o um pouco mais com as extremidades fechadas dos fórceps (Figura 1-I).
5. 24 horas ou mais depois de operar verificar a posição da barreira em comparação com o botão do membro contralateral emergente. Descartar qualquer embriões em que a barreira não é claramente opposite botão do membro esquerdo. Neste caso, a barreira foi posicionada erradamente.

4. colheita de embriões, Fixação e Preparação para Wholemount Hibridização In Situ (desejo)

1. embriões de colheita postar operação.
   1. embriões colheita na fase 19-23 de tal forma que a morfologia do membro bud é claramente visível em ambos os lados de controle operado eo contralateral.
      1. Usando tesoura curva cortar um buraco maior na casca de ovo. Corte em torno do embrião, mantendo o grande vaso sanguíneo para a esquerda do embrião com microfórceps. Use este aperto do recipiente para remover o embrião e colocá-la numa placa de Petri de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,3.
      2. Sob um microscópio binocular, dissecar distância vasos e membranas embrionárias adicionais usando uma combinação de tesoura curva e não. 5 micropinças. Retire a cabeça usando a tesoura.
2. Fixação de embriões pós-colheita.
   1. Usando blun curvadat fórceps, levantar o embrião e colocá-la em 5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS à temperatura ambiente durante duas horas e, em seguida, balançando a 4 ° C durante a noite num frasco de vidro de 20 ml com uma tampa de rosca.
      Cuidado: PFA é um perigo grave para a saúde. É um prejudiciais irritante, corrosivo e o pó deve ser impedido de entrar em contacto com a pele, os olhos e os pulmões. Use roupas de proteção pessoal e um exaustor durante a preparação da solução. Uma vez que é uma solução de 4%, luvas, óculos de proteção e um jaleco deve ser usado.
      NOTA: É importante para obter os embriões para correção rapidamente para melhor preservar a integridade do mRNA.
3. Remoção de barreiras antes de Wholemount hibridização in situ.
   NOTA: As barreiras são removidos porque eles são afiados e podem danificar embriões como eles vão através do no protocolo de hibridização in situ, especialmente se vários embriões estão manchadas de uma só vez.
   1. Após a fixação, coloque o embrião em um prato de PBS sob a mi binocularcroscope.
   2. O uso de dois pares de No. 5 micropinças, colocar o par de perto à esquerda de cada lado da barreira do lado operado do embrião. Agarrar a barreira com o par direito e puxe a barreira a partir do embrião utilizando o par de esquerda para manter o embrião para baixo e para evitar qualquer tecido de aderir à barreira, uma vez que é removida.
4. Realizar DESEJO essencialmente como descrito no ^11.

Resultados

O protocolo detalhado acima descreve os métodos utilizados nos Nishimoto et al. De 2015. O artigo estuda a indução botão do membro e iniciação, tanto na frente e dos membros posteriores do embrião de galinha. Resultados após a inserção de barreiras impermeáveis para evitar o crescimento do broto do membro anterior foram publicados anteriormente ^{1, 2, 9,} mas houve apenas barreiras que descrevem um estudo que impedem perna bud iniciação ^1. Dados de membro posterior Nishimoto et al. De 2015 são aqui apresentados como resultados representativos do estudo da expressão de mRNA após a inserção de barreira.

Tbx4 ​​Expressão na LPM não é suficiente para iniciar membros posteriores Conseqüência:
Figuras 2B e C (Tabela 2) mostra que a inserção de barreira na fase 15 (Figura 2A) (ver protocolo 3.2) leva a ambos FGF10e expressão Fgf8 estando ausente na região da perna broto (denotado por faixa) sobre o lado direito operado. Compare com o lado não operado esquerda. No entanto, a expressão Tbx4 é observado em ambas as fases 19 e 23 de fase no lado operado (Figura 2D e E). Concluímos que a expressão Tbx4 por si só não é suficiente para iniciar a excrescência dos membros posteriores do LPM. Outros estudos em o pintainho têm sugerido que a expressão do gene Tbx é suficiente para iniciar a formação do membro anterior botão ^{12, 13.}

Figura 2C 'é incluído para ilustrar como uma barreira parece embutida na região da perna do embrião de pós fixação. Na maioria dos casos as barreiras foram removidas antes da hibridação in situ (protocolo 4.3).

RA dos Somitos é essencial na LPM antes FGF10 Induz Limb Bud Outgrowth:
A Figura 3A é uma vista esquemática que representa a adição de um grânulo distai RA embebido com uma barreira inserido na fase 15 (protocolo 3.2.1.3). Subsequentemente a esta operação excrescência brotos de membros (indicado por um asterisco) é observado no lado direito operado e Tbx4, FGF10 e Fgf8 são expressos pela raiz como são no lado do controlo para a esquerda (Figura 3B, C e D, Tabela 2) . Assim, além de RA para o LPM supera o efeito da barreira e do membro de iniciação broto rendimentos. Conclui-se que, em RA desenvolvimento normal do somitos é essencial para o LPM antes excrescência brotos de membros pode ser iniciado. Os brotos dos membros posteriores resultantes são geralmente menores do que aqueles no lado de controlo. Isto pode ser devido à dose de RA no LPM não sendo equivalente à situação de tipo selvagem. Se a dose RA é muito alto o apical ectodérmica de Ridge (AER) pode ser encurtado e botões menores resultaria^{14, 15.}

Para confirmar que a AR (a partir de somitos) na LPM é necessário para o normal iniciação brotos de membros de um agonista inverso de RAR, BMS 493, foi usado. Grânulos são implantados no LPM região perna na fase 15 (ver protocolo 3.2.1.4) (Figura 3E). FGF10 expressão é regulada negativamente após a aplicação de BMS 493 pérolas na LPM, resultando em brotos dos membros posteriores menores em comparação com o lado de controlo (Figura 3F; Tabela 3). Grânulos de controlo de DMSO não causam esses defeitos (Figuras 3G e 3H; Tabela 3). Os defeitos observados após a aplicação BMS 493 são mais leves do que os induzidos por uma operação de barreira; ou seja, FGF10 ainda está expressa e brotos dos membros são formados. É provável que isto seja porque os efeitos de BMS 493 estão restritos localmente em torno dos grânulos e podem não ser capazes de antagonizar o RA todo produzido por axitecidos al.

No início Sinais axial Especifique as células LPM que decidam expressar Tbx4:
Testamos quando o LPM adquire a sua capacidade de expressar Tbx4 na região potencial de formação de perna. A etapa mais próxima em que uma barreira pode ser inserido, que em seguida bloquear perna bud conseqüência, é palco 10. Somos o primeiro a desenvolver um protocolo para inserir barreiras em estágios mais cedo do estágio 12. Barreiras inseridos entre a mesoderme paraxial ea perna presuntivo LPM na fase 10 (ver protocolo 3.4) a formação dos botões perna bloco e a expressão de Tbx4 na LPM formador de perna (Figuras 2F e 2G, Tabela 2), sugerindo que é necessário um sinal a partir de tecidos axial na etapa 10 para a expressão posterior Tbx4 na LPM hindlimb. Compare este resultado com figuras 2D e E, onde a inserção barreira mais tarde permite a expressão Tbx4para ser estabelecida. Além disso, testou-se este sinal pode ser axial RA observando se o agonista inverso de RAR reduz a expressão Tbx4. A BMS 493 talão colocado na LPM hindlimb na fase 10 (ver protocolo 3.4.1.3) regula negativamente a expressão Tbx4 (Figuras 2 horas e 2?), Enquanto esferas de controlo embebidos em DMSO não afetam expressão Tbx4 (Figuras 2J e 2K). Em conjunto, estes resultados apoiam um modelo de que um sinal de AR a partir de tecidos axiais regula indução membro regulando positivamente Tbx4 no membro posterior ⁷ LPM.

Morte pós-operatória:
As Tabelas 1, 2 e 3 dão detalhes de resultados experimentais, incluindo o número de embriões de galinha que morreu pós-operação e antes da colheita. Algumas mortes são esperadas após microcirurgia desta natureza. O números de morte pode ser mantido a um mínimo, certificando-se que os instrumentos são limpos, o buraco no ovo é a de tamanho mínimo exigido, que os embriões são deixados sem a protecção da fita adesiva pegajosa durante um tempo mínimo e, em conjunto com este último ponto que a operação é levada a cabo tão rapidamente quanto possível. Nenhuma dessas operações são muito demorado, mas as operações envolvendo contas e barreiras demorar um pouco mais tempo. Apesar destas medidas, as operações realizadas nos estágios iniciais e os da região de asa são mais propensos a resultar em morte. Existem grandes vasos sanguíneos em torno das regiões de formação dos membros e ruptura acidental destes navios podem levar à morte devido à perda de sangue. Nós achamos que os ovos abriu na fase 8 ou 9, cujos embriões não foram operados, muitas vezes vai morrer no dia seguinte. Portanto, a única solução para estes problemas é o de realizar um elevado número de experiências.

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Figura 2. marcador Alterações Gene Expression seguintes barreira ou Bead Inserção na presuntivo Leg Nível. (A) posição de exibição esquemática de barreira (linha verde) no nível de perna presuntivo (somites 26-32) em um estágio de 15 embriões. (B - E e G) análise DESEJO em embriões operados. A região de perna é descrito (entre parênteses). (B) a expressão FGF10 está ausente na LPM operado, mas a expressão robusta é detectado pela raiz esquerda. (C) Fgf8 expressão está ausente no lado operado, o que sugere que não há AER. (C) O mesmo embrião antes da barreira foi removido. (D) Tbx4 é expresso na LPM ao mesmo nível rostro-caudal, como o botão de controlo. (E) Expressão Tbx4 é mantida na região da perna direita apesar da ausência de crescimento do membro. (F) Diagrama esquemático de uma fase 10 embrião de galinha mostrando a posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo. (G) expressão Tbx4 está ausente na operado direito LPM (suporte). (H) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 10 mostrando BMS 493 posição de talão (círculo roxo) no nível de perna presuntivo. (I) a expressão Tbx4 é regulada negativamente no lado direito operado após o tratamento com BMS 493. (J) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 10 mostrando o controle de posição DMSO talão (círculo cinza). (K) Tbx4 é expressa no lado direito operado a um nível semelhante ao do controle do lado esquerdo após o tratamento com DMSO por si só. Este valor foi modificado a partir de ^7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Ausência Figura 3. RA salvamentos Membro da Bud Causada por Barreira de Inserção e é essencial na LPM Antes de Perna Bud Conseqüência. (A) Diagrama esquemático indicando posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo (somites 26-32) e um talão de RA-embebido (círculo vermelho). (B - D) RA resgates perna bud crescimento (indicado por um asterisco). (B) a expressão Tbx4 está presente na gema perna resgatado semelhante para o lado un-operado. (C) FGF10 é expresso na perna resgatado bud semelhante ao do lado operado-un. (D) Fgf8 se expressa na AER do broto perna direita resgatados. (E) esquemático indicando onde BMS 493 pérolas (círculos roxos) foram colocados na LPM perna presuntivo de estágio 15 embriões. (F) a expressão FGF10 é regulada negativamente no lado direito operado e o broto perna é pequeno BMS 49 seguinte3 tratamento. Os grânulos são asterisco. (L) esquemática semelhante à da (E), que indica a posição de controlo grânulos DMSO (círculos a cinzento). (H) esferas de DMSO (mostrados por asteriscos) não afetou a expressão FGF10 ou tamanho da perna bud. Este valor foi modificado a partir de ^7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fase barreira colocado (+ grânulo) *	número operado	Asa faltando **	Asa presente **	mortos número
Stage 12-14	40	24	1	15
Stage 8/9	65	23	0	42
Fase 12-13 (FGF4 grânulo)	41	7 (falta talão)	17	17
Fase 12-13 (RA grânulo)	75	9 (falta talão)	32	34
Stage 13 (talão de controle)	5	3	0	2
* Barreiras folha de 0,7-1 mm colocados entre somites 15-20 e a mesoderme lateral. 0,35 mg / ml talão FGF4. 0,05-0,1 mg / ml do grânulo RA.
esfera de controlo DMSO.
** estágios embriões de galinha fixos 21-23

Tabela 1. Ala Nível Barreira e Bead Experiment Outcomes.

Fase barreira colocado (+ grânulo) *	número operado	Leg faltando **	Leg presentes **	mortos número
Stage 12-15	43	39	0	4
Stage 10/11	23	16	0	7
Stage 15 (talão FGF4)	8	0	5	3
Stage 15 (talão RA)	18	0	18	0
* Barreiras folha de 0,7-1,3 mm colocados entre somites 26-32 e a mesoderme lateral. 0,35 mg / ml talão FGF4. 0,05-0,1 mg / ml do grânulo RA.
** estágios embriões de galinha fixos 18-24

Tabela 2. Perna Nível Barreira e Bead Experiment Outcomes.

número operado	Leg bud pequena	Leg brotar um pouco pequeno	Leg tamanho normal de bud	mortos número
BMS 493 esferas *
15	12	3	0	0
grânulos DMSO **
12	0	3	9	0
* 2-3 grânulos embebidos em 5 mg / ml BMS 493 colocado na direita do palco 14-15 LPM a nível perna.
** 2-3 grânulos embebidos em DMSO sozinho colocado na direita do palco 15 LPM a nível perna.
embriões de galinha fixado em estágios 17-19.

Tabela 3. Perna Nível BMS 493 Bead Experiment Outcomes.

Discussão

Nós descrevemos o uso de barreiras impermeáveis ​​para evitar a formação de gemas membros no embrião de galinha. Esta técnica tem uma série de passos críticos. Na sequência de experimentos preliminares, descobrimos que as barreiras em forma de articulação utilizados em ^{9, 10} permanecem no local no embrião muito melhor do que as barreiras retas. O lado distal plana da barreira adere à membrana vitelina e mantém a barreira no lugar (Figura 2C). A preparação cuidadosa da charneira em forma de barreiras de folha de alumínio, tal como descrito na etapa 1.6 protocolo é essencial para o sucesso da operação. Um segundo passo importante é garantir que os ovos não são deixados de fora da incubadora por muito tempo seguinte janelas e estadiamento antes de operar sobre o embrião. Na nossa experiência, os embriões sobreviver a uma operação de melhor se eles estão em ou perto da temperatura de incubação quando a operação é realizada. Operações devem ser realizadas o mais rapidamente possível e os ovos resealed prontaly para garantir boas taxas de sobrevivência. Muitos investigadores adicionar uma gota de antibióticos para o embrião seguinte microcirurgia antes de devolver os ovos à incubadora. A presença do líquido impedido as barreiras de furar também em posição. A adição de antibióticos também pode desalojar grânulos após a colocação. Portanto, não utilizando antibióticos, operações rápidas e boa limpeza com instrumentos é recomendado para evitar a infecção. Limpando instrumentos com 70% de etanol seguindo todas as fases de uma operação é essencial para evitar que instrumentos se torne pegajoso do contato com a membrana vitelina que pode causar ambas as barreiras ou contas de aderir a uma pinça (veja o passo protocolo 3.1.2.2). Ambas as variedades de contas utilizadas poderia cair fora do lugar após a operação. Quando a posição de barreira foi verificada no dia seguinte, não foi possível ver através da barreira de verificar se o talão permaneceu no local ou não. Nos casos em que o talão tinha caído para fora da asa bud crescimento não foi resgatado ( Tabela 1). Evitando a transferência de líquido com o talão quando implantá-las significa que as contas ficar mais facilmente à superfície do corte da LPM (ver protocolo 2.3.2.3). Por último, assegurando que os embriões são corrigidos imediatamente após a colheita é fundamental para uma boa análise de expressão gênica subsequente (veja o passo protocolo 4.2).

Este protocolo modifica experiências publicadas anteriormente que usaram barreiras para impedir que membros de iniciação broto, define as larguras ideais específicas para barreiras e introduz combinando barreira e talões seguido por análise de expressão gênica. Encontrámos utilizando folha de alumínio convencional, que é barato e facilmente disponível em todos os laboratórios, produz resultados iguais aos que anteriormente utilizado folha de tântalo. A folha pode ser deixado no embrião aquando da realização de hibridização in situ (Figura 2C '), mas que normalmente se removê-lo mais do que um embrião está a ser processado para evitar que as arestas da folha de danificar embriões. PIlot estudos demonstraram que a largura de perna barreiras região é particularmente importante. Inicialmente, as barreiras testadas eram muito curtos e crescimento perna bud não foi evitado. 1,2-1,3 mm é a largura ideal para uma barreira para bloquear conseqüência bud perna completamente. As barreiras asa mais estreitos que se pode colocar com precisão para evitar a conseqüência bud dar as melhores taxas de sobrevivência. Isto pode ser tão estreito quanto 0,5-0,7 mm. No entanto, as barreiras que são um pouco mais amplo são mais propensos a resultar em bloqueio completo da asa bud crescimento porque permitem um pouco de imprecisão de colocação (que usamos 0,7-1 mm). Prevenção de vasos sanguíneos ao fazer a incisão é fundamental para níveis de barreira à asa bud. barreiras semipermeáveis ​​têm sido utilizados anteriormente para bissetriz do broto de membro do pintinho. MacCabe e Parker, 1976 e Summerbell, 1979 filtros utilizados tanto de 0,45 um e 0,8 um de tamanho de poro, respectivamente ^{16, 17.} Eles relataram que os sinais difusíveis pode passar através dos poros dos filtros e queresultados obtidos com barreiras semi-permeável foram a meio caminho entre um broto de membro com nenhuma barreira de presente e um com uma barreira de folha de tântalo impermeável. Este protocolo poderia ser adaptado para utilizar as barreiras semi-permeáveis ​​de diferentes graus de tamanho de poro para diferenciar sinais de candidatos com base no tamanho ou para modificar a dinâmica de difusão de sinal.

Este protocolo tem várias limitações, principalmente associados ao modelo próprio organismo. Tais técnicas podem ser usadas para sondar mais perguntas em desenvolvimento dos membros e também outras questões de embriogênese dos vertebrados. A condição é que o órgão / área em questão deve desenvolver quando o embrião de galinha é acessível a intervenção. A presença de grandes vasos sanguíneos na área onde uma barreira necessita de ser colocado torna a colocação de barreira mais tarde do que a fase 13 ou 14 de um desafio técnico. Se grandes vasos sanguíneos são cortadas durante a colocação do obstáculo que isto poderá causar mortalidade embrionária. A nossa investigação de quando os factores de transcrição TBX5 e Tbx4 são primeiro induzida no LPM foi limitada pela fase mais próxima em que se pode colocar uma barreira que, mais tarde, acabam oposto, quer a asa ou broto perna, respectivamente. Pode ser esclarecedor para tentar bloquear a indução do gene Tbx em fases anteriores, mais perto de gastrulação. O mais antigo de uma barreira pode ser colocada na região da asa presuntivo foi com sucesso fase 8 e na fase região perna 10. Este protocolo não é provavelmente adequado para o estudo da expressão do gene para além fases brotos de membros, porque o crescimento rápido subsequente deslocaria a barreira e resultados incidiria apenas para a posição inicial da barreira.

Tendo relatado as limitações do embrião de pinto, neste contexto, as suas vantagens sobre outros organismos modelo de vertebrados são muitas. O embrião de galinha é um modelo animal bastante adequado para este tipo de intervenção física num embrião de vertebrado. Os embriões são relativamente grandes e são facilmente acessíveis atragh casca do ovo. Pode-se voltar para o embrião para experimentação adicional (por exemplo, a retirada de um talão ¹⁸ ou mesmo uma barreira) ou para verificar o progresso simplesmente removendo a fita janela. Não é possível escopo para incluir imagens ao vivo ou imagem lapso de tempo. Nós descrevemos um método de janelamento ovos de galinha que é particularmente adequado para operar em embriões em estágio inicial. No caso de estudos de membros é muito importante e útil que não é um membro contralateral de controlo para cada experimento que serve como um controlo interno ideal para cada réplica biológica.

A combinação do uso de barreiras impermeáveis ​​para impedir a excrescência do membro e grânulos embebidos em moléculas de sinalização não foi relatada antes. A nossa análise da expressão de mRNA na sequência de tais intervenções também é romance. Estas técnicas nos permitiu dissecar o difícil problema de quando membros de transcrição específico fatores Tbx5 e Tbx4 são induzidas na LPM e tambémpara mostrar que, mais tarde, antes da iniciação limb bud, a presença desses genes TBX no LPM não é suficiente para a activação de FGF10 de transcrição e o início do crescimento de brotos de membros. Figuras 2G, 2D e 2E ilustram estas conclusões bem. A ausência de expressão Tbx4 após a inserção de uma barreira na fase 10 na figura 2G está em contraste com a sua presença em 2D e 2E após a inserção de barreira na fase 15, após a indução da Tbx4. A implantação de contas RA embebido facilitou o resgate do membro de iniciação bud após a inserção de barreira e então aponta para RA de somitos sendo essencial na LPM antes de brotos de membros conseqüência pode começar. Tais técnicas podem ser usadas para resolver outras questões no desenvolvimento dos membros, mas também outras questões de embriogênese dos vertebrados. Áreas do cérebro, olho e do tronco são susceptíveis de ser adequado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça de relojoeiro Dumont No. 5, x2	Ferramentas de Belas Ciências  www.finescience.de	11251-20
Pinça de relojoeiro Dumont No. 4, x2	Ferramentas de Belas Ciências  www.finescience.de	11241-30
Pinça forte Dumont, tipo AA	Ferramentas de Belas Ciências  www.finescience.de	11210-10
Tesouras curvas com lâminas de 2,5 cm de comprimento	Ferramentas de Belas Ciências  www.finescience.de	14061-11
Pinça curva com ponta romba, termina aprox 0.5  cm de comprimento	Ferramentas de Belas Ciências www.finescience.de	11065-07
Pino de aço, 0,2 mm de largura	Ferramentas de Belas Ciências  www.finescience.de	26002-20
Pedra de afiar, quadrada	Ferramentas de Belas Ciências  www.finescience.de	29008-01
Óleo
Porta-agulhas	Ferramentas de Ciência Fina  www.finescience.de	26016-12
Fita transparente, 50 mm x 66  m	www.5staroffice.com	295985
proteína			Um presente de Cliff Tabin.
ácido trans-retinóico Sigma	www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Lembre-se de proteger da luz.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Lâmina de bisturi nº 15	www.swann-morton.com	cat nº 0105
Affi-Gel Blue, gel de cromatografia de afinidade	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Grânulos para fornecer proteína.
AG1-X2 Resina de troca iônica	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Grânulos para entrega de RA ou BMS 493.
Incubadora para ovos	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldeído (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Nocivo, irritante, corrosivo.  Manuseie o pó na hotte com vestuário de proteção completo.
Etanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, alta glicose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	de 500 ml
	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	substituído por M60
ovos de galinha	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Ovos marrons