Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Resumo

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

Resumo

interacções proteína-proteína desempenham um papel fundamental na função de um organismo vivo. Uma vez que uma interacção tem sido identificadas e validadas, é necessário caracterizar-la ao nível estrutural e mecânica. Existem vários métodos bioquímicas e biofísicas para tal finalidade. Entre eles, Anisotropia de fluorescência é uma técnica poderosa particularmente utilizado quando a intensidade de fluorescência de uma proteína marcada com fluoróforo permanece constante após a interacção proteína-proteína. Nesta técnica, uma proteína marcado com fluoróforo é animado com luz polarizada verticalmente de um comprimento de onda apropriado que excita selectivamente um subconjunto dos fluoróforos de acordo com a sua orientação em relação com o feixe de entrada. A emissão resultante também tem uma direcionalidade cujo relacionamento nos planos vertical e horizontal define anisotropia (r) como segue: r = (I _VV -I _VH) / (I _VV + 2I _VH), onde eu _VV e eu

Introdução

As células contêm um grande número de biomacromoléculas constantemente que interagem uns com os outros. Esta associação dá origem a complexos que participam nas vias celulares responsáveis ​​para o seu funcionamento na transdução de sinal, a regulação da expressão do gene e a migração de células, entre outros. Todas as interacções proteína-proteína que ocorrem numa célula compreendem uma rede conhecida como a interactoma. Em Saccharomyces cerevisiae foram mostrados mais do que 70% das suas proteínas de ter parceiros interactuantes ^1. Compreender o interactome de uma célula e suas funções fornecem informações relevantes sobre a complexidade e diver....

Protocolo

1. SBDS-flash Expressão Tag e purificação de proteínas

NOTA: Para as experiências de anisotropia, uma FLASH-tag que corresponde à sequência Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys foram adicionados ao C-terminal da sequência de codificação SBDS humanos por PCR. Esta construção foi subclonado no vector de expressão pRSET-A e transformada em células C41 de Escherichia coli para expressar uma proteína que codifica uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal (His-tag), as SBDS humanos e uma sequência C-terminal ¹⁰ Flash tag de codificação.

1. A expressão da proteína SBDS-flash
   1. Transformar E. competente coli C4....

Resultados

Para realizar qualquer experiência anisotropia é importante para descartar grandes mudanças na intensidade de fluorescência do fluoróforo uma vez que a anisotropia observada de uma mistura de espécies é representado pela Equação 5:

onde F _i representa a fluorescência fraccionada de .......

Discussão

A maioria das experiências bioquímicas com proteínas requerem não só proteína pura, mas também uma grande quantidade deles, independentemente da técnica utilizada. Por esta razão, as proteínas utilizadas para este tipo de experiências são obtidos por expressão heteróloga, como era o caso aqui apresentado. espectroscopia de fluorescência requer a presença de um fluoróforo na molécula estudada. resíduos aromáticos constituem os fluoróforos intrínsecas de uma proteína, no entanto, utilizando o seu sinal para estudar as int.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Contas de vidro de 0,5 mm	Produtos Biospec	11079105
Base Tris	Para Médio	TRIS01	Corante ultra puro
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolano-2-il) fluoresceína	ThermoFischer Scientific	LC6090	Este kit contém o corante para rotular uma etiqueta FlAsH
Ampicilina	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glicose Anidra	Para Meio	GLU03
D(+)-Galactose	Para Meio	GAL03
L-Leucina	Para	Meio DOC0157
L-Triptofano	Para hidrocloro	de
	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Fluoreto de fenilmetilsulfonil
NaCl	Para cloreto	NAC02	para médio
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Cloreto de Magnésio
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Fosfato de potássio dibásico
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Fosfato de sódio monobásico
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos	Formedium	CYN0410
Extrato de levedura	Formedium	YEM03	Micro Granulated
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
sulfato	de adeninaPara médio	DOC0230
Ácidos Casamino	Para médio	CAS03
Triptona	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Para médio	IPTG025
Unidades de filtração	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10  Filtro de Membrana kDa
	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Filtro de Membrana, ésteres de celulose mistos, Hidrofílico, 0.22  µ m, 47  mm, branco, liso
Ni2+ coluna de afinidade	QIAGEN	30760	Cartucho pré-preenchido com 5  ml Coluna de
trocador de cátions de sulfopropil forte	Superflow GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Coluna de exclusão de tamanho	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Célula de fluorescência	Hellma Analytics	111-057-40
Espectrofotômetro	Agilent Technologies	G6860AA	Agitador UV-Vis Cary 60
	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Faixa de temperatura de bancada Ambiente-15° a 60°
C Centrífuga	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Sistema FPLC descontinuado	condutividade Monitor UV-MM II P500 fração da bomba
Espectrofluorômetro	Olis	Não aplicável	Olis DM 45 com caixa de ferramentas de polarização

bezamidina DOC0189 médio de sódio Ni-NTA