Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

As células contêm um grande número de biomacromoléculas constantemente que interagem uns com os outros. Esta associação dá origem a complexos que participam nas vias celulares responsáveis ​​para o seu funcionamento na transdução de sinal, a regulação da expressão do gene e a migração de células, entre outros. Todas as interacções proteína-proteína que ocorrem numa célula compreendem uma rede conhecida como a interactoma. Em Saccharomyces cerevisiae foram mostrados mais do que 70% das suas proteínas de ter parceiros interactuantes ^1. Compreender o interactome de uma célula e suas funções fornecem informações relevantes sobre a complexidade e diversidade dos organismos vivos. Várias metodologias têm sido descritos para identificar e caracterizar as interacções proteína-proteína. Diferente alta através de métodos colocados como a levedura de dois híbridos ^2, ensaios de complementação de proteína-fragmento de ^{3, 4} purificação por afinidade acoplada a espectrometria de massa e microarra proteínays são utilizados para identificar uma interacção ^5,6. Uma vez identificado, é necessário para a sua validação e pode variar numa base de caso-a-caso. Tipicamente, estas experiências envolvem interromper a interacção si ao nível dos membros individuais do par de interacção, por exemplo, por deleção do gene ou a superexpressão de uma das proteínas, e, em seguida, à procura de mudanças nas propriedades ou a função do outro membro do nível celular. Subsequentemente, as técnicas biofísicas ⁷ são usados para caracterizar a interacção proteína-proteína, a nível molecular. Para este fim, a estrutura dos complexos de proteína são determinadas por cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear e microscopia crio-electrões enquanto calorimetria e espectroscopia de fluorescência são usadas para quantitativamente e mecanisticamente os descrever.

Neste trabalho, Anisotropia de fluorescência foi usada como uma técnica para caracterizar a interacção entre a GTPase EFL1 e SBDproteína S. Estas proteínas participam na síntese de ribossomas, promovendo a libertação do factor de iniciação eucariótico 6 a partir da superfície das subunidade ribossomal 60S ^8. A proteína SBDS está mutado em uma doença conhecida como síndrome de Shwachman- diamante ⁹ e actua como um factor de troca do nucleótido guanina para EFL1 diminuindo a sua afinidade para o difosfato de guanosina ^10,11. mutações doença em SBDS abolir a interação com EFL1 e, assim, evitar a sua activação.

Anisotropia de fluorescência é comumente utilizado em aplicações biológicas para estudar proteína-péptido ou interacções proteína-ácido nucleico. Baseia-se no princípio de que um fluoróforo excitado com resultados de luz polarizada em uma emissão parcialmente polarizado. anisotropia de fluorescência é definido pela Equação 1:

onde _VV e _VH são osintensidades de fluorescência da vertical _(VV) e horizontal _(VH) polarizado emissão quando a amostra está animado com verticalmente luz polarizada ^12. Anisotropia de fluorescência é sensível a factores que afectam a taxa de difusão de rotação do fluororo e, portanto, depende da temperatura, da viscosidade da solução e o tamanho molecular aparente do fluoróforo. O tamanho aparente de uma proteína que contém um fluoróforo aumenta quando ele interage com uma outra proteína e em seguida, tal mudança pode ser avaliada como uma alteração na anisotropia. Mais especificamente, um fluoróforo, que roda lentamente em solução em relação ao seu tempo de vida de fluorescência terá um grande valor I _VV e o valor pequeno I _VH e, por conseguinte, irá apresentar uma relativamente grande anisotropia. Para fluoróforos que caem rapidamente em relação ao seu tempo de vida de fluorescência, eu _VV e _VH I será semelhante eo seu valor de anisotropia será pequeno ¹² (Figura 1). Além disso, para um bom sinal de anisotropia para medição de ruído, é necessário ter um fluoróforo com um tempo de vida de fluorescência similar ao tempo de correlação rotacional da molécula de interesse. Caso contrário, não é possível registar com precisão a diferença de anisotropia entre a proteína livre e que, no complexo. Por exemplo, a anisotropia de uma sonda fluorescente, com um tempo de vida perto de 4 ns, tais como fluoresceína ou rodamina ligados a um composto de baixo peso molecular de 100 Da é 0,05. A ligação a uma molécula de 160 kDa vai aumentar o seu valor de anisotropia de 0,29; uma diferença que pode ser medido com precisão. Em contraste, a mesma sonda fluorescente envolvido numa reacção de ligação cuja aumento no tamanho molecular varia de 65 a 1000 kDa só vai resultar numa alteração de anisotropia de 0,28 a 0,3, o que é demasiado pequeno para ser medido com precisão. Neste cenário, uma sonda com uma vida útil de 400 nanossegundos seria mais adequado ^12.

aplicações de fluorescência requerem a presença de um fluoróforo em qualquer uma das moléculas estudadas. Para estudar as interacções proteína-proteína, existem três tipos de fluoróforos: 1) os resíduos de triptofano presentes nas proteínas, 2) fluoróforos ligados quimicamente e 3) parceiros de fusão fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) e a sua derivativas. A maioria das proteínas têm resíduos de triptofano na sua estrutura, portanto, a forma mais fácil de medir uma interacção é através da monitorização das alterações na espectros de fluorescência correspondente ou por monitorização das alterações na intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. No entanto, os resíduos de triptofano podem estar presentes em ambas as proteínas que complicam a análise. Por outro lado, para um fluoróforo para alterar as suas propriedades fluorescentes, devido a uma interacção precisa de ser localizado em ou perto do local de ligação e que poderia interferir com a própria interacção. Este precisa de atenção especial quando se utiliza fluoróforos volumosos, como GFP. Se nenhum destes fluoróforos podem ser utilizados para estudos de ligação é necessário, em seguida, introduzir fluoróforos extrínsecos ao uma das proteínas envolvidas. Existem muitos fluoróforos quimicamente sintetizados e podem ser ligados covalentemente a proteínas através dos seus grupos reactivos tais como os grupos amina da cadeia lateral (de lisinas ou no terminal N) e os grupos tiol na cisteína. Fderivados luorophore com ésteres de succinimidilo e isotiocianato de reagir com grupos de amida, enquanto a iodoacetamida e maleimida são grupos ^13-tiol reactivos. Os corantes mais comuns usados ​​em aplicações de fluorescência são derivados da fluoresceína e rodamina os corantes verdes, cumarinas, e corantes BODIPY fluoróforos Alexa Fluor. Uma lista detalhada de fluoróforos disponíveis comercialmente e a sua utilização pode ser encontrada em referências ^14,15. Para a marcação com êxito, o grupo reactivo deve ser expostos na superfície da proteína, mas, devido ao grande número de grupos funcionais reactivos, tipicamente presentes em polipéptidos, é muito difícil conseguir a modificação específica do local. A proteína de interesse neste estudo, SBDS, contém 5 cisteínas livres e 33 lisinas que podem resultar na marcação de vários sites. rotulagem não uniforme pode afectar a ligação e vai complicar a análise de dados como moléculas fluoróforo diferentes podem provocar diferentes sinais de intensidade de fluorescência após a ligação. para overcome esse problema, foi utilizado o fluoróforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceína com o selo de site direto da proteína SBDS. Este é um corante arsenoxide com uma elevada afinidade para quatro cisteínas espaçadas num motivo conhecido como FLASH-tag que consiste na sequência de CCXXCC onde X é qualquer aminoácido excepto cisteína ^16,17. Este motivo tetraciste�a é adicionado à extremidade N ou C-terminal da proteína através da engenharia genética juntamente com um ligante apropriado para evitar o rompimento da dobragem global da proteína. O par constituído por corante flash e-tag foi originalmente concebido para proteínas de etiquetas específicas do local em células ¹⁷ que vivem, mas também pode ser usado para rotular proteínas purificadas in vitro, como é exemplificado aqui. Além disso, as estratégias enzimáticas também têm sido desenvolvidos para permitir a funcionalização do local específico de proteínas ^18.

Nesse artigo, procuramos descrever a utilidade da fluorescência anisotropia umferramenta sa para estudar as interações proteína-proteína. A ligação pode ser avaliada através de uma simples inspecção da forma da curva de ligação enquanto que a informação quantitativa pode ser obtida a partir do ajuste dos dados experimentais.

1. SBDS-flash Expressão Tag e purificação de proteínas

NOTA: Para as experiências de anisotropia, uma FLASH-tag que corresponde à sequência Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys foram adicionados ao C-terminal da sequência de codificação SBDS humanos por PCR. Esta construção foi subclonado no vector de expressão pRSET-A e transformada em células C41 de Escherichia coli para expressar uma proteína que codifica uma etiqueta de hexa-histidina N-terminal (His-tag), as SBDS humanos e uma sequência C-terminal ¹⁰ Flash tag de codificação.

1. A expressão da proteína SBDS-flash
   1. Transformar E. competente coli C41 com o plasmídeo pRSET-HisSBDS-flash usando um protocolo de choque térmico padrão de ^19. Placa as células em meios sólidos Luria-Bertani (LB) suplementado com 100 ug / ml de ampicilina. LB composição meio sólido consiste em 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levedura, 10 g de triptona e 20 g de agar para o volume de 1 litro.
   2. Culturas de bactérias transformadas a 37 ° C atéabsorvância a 600 nm (A ₆₀₀₎ atinge 0,5-0,7 em 1 L de meio líquido LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina.
   3. Induzir a expressão da proteína por adição de 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido para a cultura e a incubação continua durante mais 5 h.
   4. Recolha a suspensão bacteriana por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas.
2. Purificação de proteínas SBDS-flash
   NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de cromatografia líquida (FPLC) de proteína rápida ou uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni ²⁺ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 ml. cromatografia de troca aniônica usa um 5 ml forte coluna de permutador de sulfopropil cação. Uma taxa de fluxo de 3 ml / min foi usado para todos os passos cromatográficos.
   1. Ressuspender as células em 35 ml de lise b SBDSpode ser prejudicado (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) suplementado com fluoreto de 1 mM de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e lise por sonicação durante um tempo total de 4 minutos com ciclos de 10 segundos ligado e 30 segundos desligado, a 4 ° C.
   2. Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.
   3. Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares.
   4. Equilibrar a coluna de afinidade de Ni ²⁺ com 3 volumes de coluna (CV) de tampão de lise e SBDS introduzir a totalidade clarificada sobrenadante na coluna.
   5. Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise SBDS e eluir com 3 CV de tampão de eluição SBDS (tampão fosfato 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM).
   6. Dilui-se a proteína 6 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM pH 6,5 e remover possíveis agregados por filtração através de uma membrana de celulose de 0,22 um.
   7. Equilibrar a coluna sulfopropil cátion trocador com 3 CV de baixo teor de sal coluna Stampão (tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) e introduzir a amostra de proteína a partir do passo anterior.
   8. Lave o material não ligado com 3 CV de tampão de baixo teor de sal coluna de S e elui-se a proteína num único passo, com tampão de fosfato 50 mM pH 6,5, NaCl 1 M.
   9. Dilui-se a proteína de 3,3 vezes eluída com tampão fosfato 50 mM de pH 6,5. Concentra-se a proteína com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg durante 15 min. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazená-lo a -80 ° C até à sua utilização.
   10. Verifique a pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie ^20.

2. EFL1 Protein Expression and Purification

NOTA: EFL1 foi expressa sob a regulação da Gal 1/10 promotor divergente ²¹ e o Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR no pRS426 vetor. A proteína recombinante codifica a isoforma humana EFL1 1 fundido com uma protease de vírus do tabaco Etch (TEV) local de reconhecimento e um tag de hexa-histidina na extremidade C-terminal.

1. A expressão da proteína EFL1
   1. Transformar S. células cerevisiae BCY123 com o plasmídeo pRS426-EFL1TevHis utilizando um protocolo de acetato de lítio padrão ^22. Placa todas as células transformadas em queda para fora sintético sem uracilo meios (SD-URA) suplementado com 2% (w / v) de glucose. Composição dos meios SD-URA consiste de 8 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, casaminoácidos 11 g, 55 mg de sulfato de adenina, 55 mg de tirosina, leucina 60 mg e 60 mg de triptofano para o volume de 1 litro.
   2. Cultura de levedura transformadas a 30 ° C até ₆₀₀ um atinge 1,8 em 1 L de meio SD-URA suplementado com 0,5% (w / v) de glucose.
   3. Induzir a expressão da proteína por adição de 2,8% de galactose (v / w) para a cultura e a incubação continua durante mais 18 h a 30 ° C.
   4. Recolha a suspensão de levedura por centrifugação a 3800 xg durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.Neste ponto, quer armazenar o sedimento de células à temperatura de -20 ° C ou utilizar imediatamente para purificação de proteínas.
2. Purificação de proteínas EFL1
   NOTA: Todos os passos cromatográficos são realizadas utilizando um sistema de FPLC ou de uma bomba peristáltica. Cromatografia em Ni ²⁺ -affinity usa uma coluna de fluxo rápido de 5 mL a uma taxa de fluxo de 3 mL / min. A cromatografia de exclusão de tamanho usa uma coluna de 125 ml de pré-embalada com resina Superdex 200 com um caudal de 1 ml / min.
   1. Ressuspender as células em 50 ml de EFL1 tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, MgCl 5 _2, 10% glicerol) suplementado com PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM e à dissociação das células por atrito sobre um batedor de grânulo usando esferas de vidro (o = 0,5 mm) durante um tempo total de 6 min, utilizando ciclos de 2 minutos a 15 minutos e DESLIGADO, a 4 ° C.
   2. Centrifugar a amostra a 9000 xg durante 50 min a 4 ° C.
   3. Manter o sobrenadante e descartar o sedimento para remover os restos celulares.
   Equilibrar a coluna de afinidade de Ni ²⁺ com 3 CV de tampão de lise e EFL1 introduzir todo o sobrenadante clarificado numa coluna.
3. Remover a proteína não ligada por meio de lavagem com 3 CV de tampão de lise EFL1 e eluir com 3 CV de tampão de eluição EFL1 (50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl ₂ 5, 10% de glicerol).
4. Equilibrar a coluna de exclusão de tamanho, com 1,5 VC de tampão de anisotropia (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, MgCl ₂ 5, 10% de glicerol, 5 mM de β-mercaptoetanol).
5. Concentra-se a 1 ml da proteína EFL1 eluído a partir da coluna de afinidade de Ni ²⁺ com dispositivos de ultraf iltração por centrifugação a 3800 xg para o volume desejado. Introduzir a amostra na coluna de exclusão de tamanho.
6. Recolha a proteína eluida e concentra-se por ultrafiltração até uma concentração final de cerca de 30 uM. Flash congelar a proteína em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Verifique the pureza da proteína por análise de SDS-PAGE e coloração com Coomassie ^20.

3. Rotulagem de SBDS-flash com o flash corante fluorescente 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) Fluoresceína

1. Misturar 3 nmol de proteína SBDS-flash com 3 nmol do 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) corante f luoresceína em volume de 5 ul de tampão de anisotropia.
2. Deixe a reacção prosseguir durante 8 horas a 4 ° C. Diálise da amostra contra tampão Anisotropy durante a noite para remover o corante livre.
3. Usar a lei de Lambert-Beer para quantificar a% de proteína marcada. Medir a absorvância a 280 nm e 508 nm num espectrofotómetro usando uma cuveta de quartzo de volume apropriado. NOTA: Considere os seguintes coeficientes de absorção molar (M ^-1 cm ^-1):
   
4. Calcular a concentração de proteína SBDS-flash marcado usando a Equação 2.
   
5. Calcular a concentração de proteína total SBDS usando a Equação 3, substituindo o calculado C _SBDS-flash a partir do passo anterior.
   
6. Calcular a percentagem de proteína marcada usando a Equação 4.
   

4. Experiências de Anisotropia de fluorescência

NOTA: Anisotropia experiências foram feitas em um espectros luorómetro equipado com uma caixa de ferramentas de polarização e recolha de dados foi realizada utilizando o programa de anisotropia fornecida no software do equipamento. O comprimento de onda de excitação foi fixado em 494 nm com uma largura de banda espectral de 8 nm e a emissão foi registada utilizando um filtro passa-banda de 530 ± 25 nm. As medições foram realizadas a 25 ° C em 200 ul de uma cuvete com um comprimento do percurso ¹⁰ 5 milímetros.

1. Em uma tina de fluorescência, coloque 200 mL de 30 nm SBDS flashes em tampão anisotropia e titular 2 ul de EFL1 30? M. Misture bem e deixe a reacção repousar durante 3 min antes de medir o valor de anisotropia.
2. Repetir o passo 4.1 até um volume total de 40 ul de EFL1 foi adicionado.

Análise 5. Os dados

1. Ajustar os dados para o modelo de encadernação adequada usando um algoritmo de regressão por mínimos quadrados não-linear. As equações para os modelos mais comuns de ligação são apresentados na Tabela 1.
2. Avaliar o melhor modelo que descreve a interação entre as proteínas inspecionando os resíduos do ajuste ^23. Apoiar o modelo escolhido com experimentos adicionais.

Tabela 1. Modelos de ligação comum de interação proteína-proteína e as equações matemáticas que os descrevem.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Para realizar qualquer experiência anisotropia é importante para descartar grandes mudanças na intensidade de fluorescência do fluoróforo uma vez que a anisotropia observada de uma mistura de espécies é representado pela Equação 5:

onde F i representa a fluorescência fraccionada de cada componente e r i é a anisotropia correspondente. A fluorescência fraccionada de cada componente depende de ambas, a sua concentração e a sua fluorescência relativa, a qual é definida pela Equação 6:

em que X i representa a fracção molar de the i th espécie e Ø i é o rendimento quântico do i th espécie.

Assim, se a intensidade de fluorescência muda dramaticamente ao longo da titulação é melhor, quer medir a formação do complexo como uma função da alteração no sinal da fluorescência e não do sinal de anisotropia, ou corrigir o valor da anisotropia observadas por encaixe, tanto a intensidade da fluorescência e da anisotropia dados. A fluorescência de SBDS-flash muda não perceptível após ligação a EFL1 (Figura 2), sugerindo que a anisotropia de fluorescência é adequado para a medição da ligação entre as duas proteínas.

Figura 2. A emissão de fluorescência de SBDS-flash com titulação de concentrações crescentes de EFL1. As alterações na emissão de fluorescência do fluoróforo são negligible e aleatória ao longo da titulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um exemplo da fluorescência curva obtida a partir da titulação do EFL1 para SBDS-flash ligação anisotropia é mostrado na Figura 3. Qualitativamente, a forma do gráfico mostra claramente que as duas proteínas interagem como evidenciado por um aumento no sinal de anisotropia por adição de EFL1. Além disso, os valores de anisotropia atingido um patamar sugerindo que, no final da titulação toda a proteína SBDS-flash estava presente num complexo com EFL1. É possível, então, para descrever quantitativamente a interação entre essas proteínas e ajustar os dados usando mínimos quadrados não linear de regressão a um modelo de ligação presumido e obter a dissociação correspondente constante de equilíbrio. Montagem de um modelo de local de ligação que não gostaram aprodiatamente descrever os dados experimentais (Figura 3A). Isto é evidente não só do traço encaixe na curva de ligação, mas também de os desvios dos resíduos do ajuste (a diferença entre os dados teóricos e experimentais) que são significativos e não aleatória. Isto concorda bem com o facto de um único modelo de local de ligação é descrito matematicamente por uma curva hiperbólica e não uma curva sigmoidal que a observada para os dados experimentais apresentados na Figura 3. Por outro lado, os modelos, tais como dois idênticos ou dois de ligação diferente sites de descrever melhor os dados experimentais e os resíduos do show ajuste nenhum desvio sistemático apoiar um modelo de associação de dois locais (Figura 3B-C). Na ausência de qualquer outra informação experimental é difícil determinar qual dos dois modelos corresponder ao mecanismo de ligação entre EFL1 e SBDS. No entanto, SBDS e EFL1 são ambas proteínas monoméricas, por isso é difficult prever um modelo de dois locais de ligação idênticos.

. Figura isotérmica de ligação 3. Fluorescência anisotropia da interação entre EFL1 e SBDS-flash A linha contínua em cada uma das parcelas superiores corresponde ao ajuste dos dados para diferentes modelos de ligação: (A) em um único local, (B) dois locais idênticos e (C) dois locais não idênticos. Parcelas inferiores representam os resíduos do ajuste com o modelo correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar e não têm interesses financeiros concorrentes.