Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Resumo

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Resumo

deficiência límbica (LSCD) é um estado de mau funcionamento ou perda de células-tronco epiteliais do limbo, após o qual o epitélio corneano é substituído por conjuntiva. Os pacientes sofrem de defeitos da córnea recorrentes, dor, inflamação, e perda de visão.

Anteriormente, foi descrito um modelo de murídeo de LSCD e comparado com dois outros modelos. O objetivo era produzir um modelo de rato consistente de LSCD que ambos os imita o fenótipo em humanos e dura o tempo suficiente para torná-lo possível estudar a fisiopatologia da doença e avaliar novos tratamentos. Aqui, a técnica é descrita em mais detalhe.

Uma ferramenta motorizada com uma broca rotativa foi concebida para remover os anéis de ferrugem a partir da superfície da córnea ou para suavizar a cama pterígio em pacientes. É um dispositivo adequado para criar o modelo LSCD desejado. É um fácil de usar ferramenta prontamente disponível, com uma ponta fina que torna apropriado para trabalhar em pequenos olhos, comoem ratinhos. A sua aplicação impede traumas desnecessários ao olho e que não resultam em lesões indesejadas, como é frequentemente o caso com os modelos de lesão química. Ao contrário de um raspador romba, que remove o epitélio com a membrana basal. Neste protocolo, a área límbica foi desgastada duas vezes, e então todo o epitélio corneano foi raspada do limbo a limbo. Para evitar lesões estroma, o cuidado foi tomado para não escovar a superfície da córnea uma vez que o epitélio já foi removido.

Introdução

O epitélio corneano é necessária para manter a clareza ea integridade da córnea. É constantemente renovada ao longo da vida através das células estaminais epiteliais que residem no limbo-uma zona estreita na junção da córnea e da conjuntiva. Estas células estaminais do limbo auto-renovação desempenham um papel crucial na regeneração do epitélio da córnea, tanto normalmente e após a lesão. esgotamento parcial ou total destas células estaminais irão resultar em erosões corneanas recorrentes, dor, cicatrização da córnea e neovascularização, a aparência das células caliciformes, e, se deixados sem tratamento cegueira, da córnea. Esta condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) e pode ser idiopática; hereditária; ou adquirida devido a lesões químicas ou térmicas, lentes de contacto prolongado desgaste, e inflamação crônica ^1-6.

Investigação sobre LSCD exige um modelo animal adequado que não imita apenas a doença em seres humanos, mas é reprodutível e sustentável, com o mínimo ummontagem de prejuízo para outras estruturas da córnea e oculares. Este modelo é necessário avaliar tratamentos e esclarecer os mecanismos da doença em níveis moleculares e celulares. Tal como descrito antes ^1, com a utilização de uma broca rotativa, pode-se facilmente desenvolver um modelo de ratinho de LSCD que apresenta as vantagens acima mencionadas e persiste durante pelo menos três meses. O objetivo deste estudo é apresentar um modelo simples, reprodutível e sustentável do rato de LSCD.

A broca rotativa é uma ferramenta útil que remove uniformemente o epitélio sem ferir o estroma subjacente ^1. Ele tem sido usado para induzir a erosão da córnea central ^{7, 8} em estudos de cicatrização de feridas. A técnica apresentada, ora para criar LSCD em um mouse não tem sido relatada antes. Anteriormente introduzidos métodos de raspagem do epitélio com um resultado espátula romba num menos uniforme lesão, particularmente no limbo e um fenótipo mais variável ^{1, 9,} com mais restauração óepitélio normal da córnea f ^1. Ao contrário do raspador sem corte, a broca rotativa elimina a membrana basal epitelial bem como ^{7, 8, 10.} Outros métodos descritos para separar as células estaminais envolvem a utilização de produtos químicos, tais como hidróxido de sódio, n-heptanol, e cloreto de benzalcónio, o que não só pode induzir lesão indesejada para estruturas oculares subjacentes, mas também pode levar a inflamação significativa e subsequente opacificação da córnea ou metaplasia escamosa epitelial ^11-15. A rebarba de rotação não está associado a estas complicações graves. A remoção cirúrgica do epitélio do limbo, sozinho ou com o uso de produtos químicos ^{10, 11, 16,} é mais difícil de realizar e não é a melhor opção em animais com pequenas olhos e um epitélio do limbo fina (como ratos). Além disso, surpreendentemente, limbectomy pode ainda deixar algum do epitélio do limbo para trás ^10.

A técnica descrita abaixo irá resultar em LSCD com uma neovascularizaçãod conjuntivalização que imita a apresentação de LSCD completa em pacientes e tem a duração de pelo menos três meses ^1. É apropriado para aqueles que pretendem estudar LSCD ou fisiopatologia cicatrização de feridas, imunologia e potenciais tratamentos em ratinhos. Possivelmente, com algumas modificações, este procedimento pode ser realizado em ratos ou coelhos ^10. À medida que a rebarba rotativo remove eficientemente o epitélio, ele pode ser utilizado em qualquer pesquisa relativos à abrasão da córnea epitelial / ferimento e em qualquer tratamento relacionada ou estudos de biologia molecular.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em animais em conformidade com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declarações para o uso de animais em pesquisa visão. Quatorze quatro a 6J de seis meses de idade, macho / fêmea C57BL / tipo selvagem foram utilizados: dez ratos para o modelo de lesão e quatro como animais de controlo (córneas sem ferimentos).

1. Preparação de animais

1. Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de mistura de xilazina. Após a anestesia começou a produzir efeitos, apertar o dedo do pé para confirmar a profundidade da anestesia; o animal não deve reagir.
2. Inspecione o olho sob uma lâmpada de fenda antes de realizar os experimentos para verificar a ausência de qualquer lesão da córnea anterior.
3. Instilar uma gota de cloridrato de tetracaína a 1% para o olho. Depois de 60-90 segundos, teste do reflexo corneal para confirmar a ausência de sensação. Anestalcon 0,5% pode ser usado em seu lugar.
4. Quando a perda de sensibilidade da córnea édeterminado, suavemente colocar uma gota de 5% de povidona-iodo no olho e no cabelo em torno do olho. Limpe a queda após 1 min ou espalhá-lo sobre o cabelo ao redor do olho para evitar que o cabelo de interferir com a ponta da ferramenta.

2. Equipamento abrasivo do epitélio corneano

1. Usar luvas cirúrgicas e um vestido. Prepare as ferramentas necessárias: uma rebarba rotativa estéril e um par de pinças estéreis. Para um melhor controle, use uma pinça dobrados. Coloque as ferramentas em uma folha esterilizada durante o procedimento.
2. Usando a pinça dobrados, estabilizar o olho, agarrando as tampas do lado nasal e gentilmente proptosing o olho. Evitar o uso de muita pressão.
3. Sob um microscópio cirúrgico, fazer a barba 360 ° ao redor da área de limbo duas vezes utilizando a broca rotativa estéril. Vá ao redor do limbo com uma velocidade de 5-6 segundos por rodada.
   NOTA: A broca tem uma velocidade fixa. No entanto, para que o mesmo rode à velocidade estabelecida, a "porca final" deve ser completamente apertados.
4. Remover todo o epitélio corneano do limbo a limbo com a rebarba giratória. Para melhores resultados, mover a ferramenta de forma circular e prendê-lo de alguma forma paralela à superfície da córnea para trabalhar com a face lateral da ponta da mesma. Tome cuidado para não ferir o estroma por não re-escovar as áreas onde o epitélio já foi removido. Não aplique pressão sobre o olho. Limpe a ponta do pincel conforme necessário.
5. Instilar uma gota de tampão fosfato estéril sobre a córnea e limpe as folhas epiteliais isolada com um tecido de limpeza macio.
6. Raspar o epitélio remanescente, se alguma.
7. Preste atenção para a cauda do rato durante a cirurgia.
   NOTA: Se ocorrer qualquer movimento, a profundidade da anestesia se desvaneceu e mais injeção é necessária. Um terço a dois terços do volume injectado primária deve ser suficiente. Não overdose do animal com a medicação anestésica.
8. Esterilizar todas as ferramentas antes de usá-los em outro olho.

3. Confirmar remoção epitelial completa

1. Aplicar uma gota de 1 mg / ml de fluoresceína de sódio sobre a córnea. Limpe a córnea após 30 seg e examiná-lo sob um microscópio com um filtro azul cobalto para verificar a completa remoção do epitélio.
   NOTA: As áreas de córnea com defeitos epiteliais são visualizados em verde.

4. Pós-operação Cuidados

1. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento e mantê-lo em um lugar seguro (por exemplo, em sua gaiola), enquanto em recuperação. Não manter um animal inconsciente na companhia de os conscientes.
2. Aplicar uma pomada oftálmica% eritromicina. Isso também irá prevenir o ressecamento dos olhos. Continuar a aplicação da diária de antibiótico por uma semana.
3. Injectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, após o procedimento e novamente após 12 horas. Continuar a injecção duas vezes por dia durante dois dias.
4. Observar o animal durante 30 - 45 min, até a recuperação completa da anestesia.
   NOTA: Movimento suave dos músculos respiratórios na superfície ventral indica bem-estar animal enquanto em recuperação.

Resultados

Dentro de um mês após a realização desta técnica, 100% das córneas desenvolveram neovascularização superficial (Figura 1A. As fotos foram tiradas com uma câmera conectada a uma lâmpada de fenda sob um campo brilhante e filtro azul cobalto). Em 18/20 (90%) dos olhos, neovascularização envolvida a totalidade da superfície da córnea (Figura 1A). Em 2/20 (10%), a neovascularização foi observada em três dos quatro quadrantes da córnea, mas ainda atingido o ce...

Discussão

Este artigo descreve uma técnica reproduzível e relativamente simples para criar um modelo de mouse LSCD. Há vários aspectos importantes deste modelo que são dignos de nota. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos que usam produtos químicos ^{11, 12,} a lesão envolve primariamente o epitélio de superfície (e membrana basal), com danos mínimos para o estroma corneano subjacente ou para outras estruturas intra-oculares. Assim, existe apenas a inflamação limitada e cicatrizes, ambos os quais podem complicar o p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rebarba rotativa: Removedor de anel de ferrugem AlgerBrush II	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	rebarba de 0,5 mm. Também disponível em outras empresas.
Microscópio cirúrgico	Wild Heerbrugg, Suíça	Wild M691
Câmera digital	Nikon, Tailândia
Nikon FS-2 lâmpada de fenda	Nikon, Japão
Anticorpo policlonal anti-CK12	Santa Cruz Blotechnology, CA,	SC-17101	Concentração de 1:100
Anticorpo monoclonal anti-CK8	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	Concentração 1:50