Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Resumo

Microglia (células imunes do cérebro), são usadas como um biossensor substituto para determinar como as nanopartículas influenciam a neurotoxicidade. Descrevemos uma série de experimentos projetados para testar a resposta microglial a nanopartículas e a exposição de neurônios hipotalâmicos ao sobrenadante da micróglia ativada para determinar a neurotoxicidade.

Resumo

Nanopartículas encontradas em poluentes atmosféricos podem alterar perfis de neurotransmissores, aumentar a neuroinflamação e alterar a função cerebral. Portanto, o ensaio descrito aqui ajudará a elucidar o papel da microglia na neuroinflamação e doenças neurodegenerativas. O uso da microglia, células imunes residentes do cérebro, como um biossensor substituto fornece uma nova visão sobre como as respostas inflamatórias medeiam insultos neuronais. Aqui, utilizamos uma linha celular microglial murina imortalizada, designada BV2, e descrevemos um método para exposição a nanopartículas usando nanopartículas de prata (AgNPs) como padrão. Descrevemos como expor a microglia a nanopartículas, como remover nanopartículas do sobrenadante e como usar o sobrenadante da microglia ativada para determinar a toxicidade, usando a sobrevivência das células hipotalâmicas como medida. Após a exposição ao AgNP, a ativação microglial do BV2 foi validada usando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). O sobrenadante foi filtrado para remover o AgNP e permitir que citocinas e outros fatores secretados permanecessem no meio condicionado. As células hipotalâmicas foram então expostas ao sobrenadante da microglia ativada por AgNP e a sobrevivência dos neurônios foi determinada usando um ensaio fluorescente baseado em resazurina. Esta técnica é útil para utilizar a microglia como um biomarcador substituto da neuroinflamação e determinar o efeito da neuroinflamação em outros tipos de células.

Introdução

Poluições ambientais, especialmente aqueles da gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diâmetro), têm sido associadas com a obesidade e outras doenças neurodegenerativas, devido à capacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica ^1-3. Exposição elevada a poluição pode induzir a inflamação do sistema nervoso central, incluindo o hipotálamo ^1. Um potencial mecanismo no qual isto ocorre pode ser através da activação induzida por nanopartículas de microglia (células imunes do cérebro) ^4. Estudos anteriores têm utilizado em modelos in vivo para estudar os efeitos de NPs sobre a saúde do cérebro, que são consumidoras de tempo, é caro, e não responde directamente à questão de como o NPS influenciar microglia. Microglia desempenhar um papel multifacetado no sistema nervoso central, incluindo a manutenção do microambiente do cérebro e comunicando com circundante neurónios através da libertação de factores secretados e citocinas. Dependendo dos estímulos, microglia pode ser activado a uma pr M1o-inflamatória ou um estado anti-inflamatório M2. Por exemplo, a microglia activada M1 libertar citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), enquanto M2 activado libertação microglia citocinas anti-inflamatórias, incluindo a interleucina-4 (IL-4). Para validar o nosso substituto no biossensor vitro para determinar a neurotoxicidade dos poluentes do ar, medimos microglial 20 nanopartículas de prata nm (AGNPS). O objetivo deste artigo é descrever como um in vitro linha de células microgliais pode ser usado como um marcador biossensor substituto para testar a resposta microglial murino para o NPS e como microglial ativação afeta as células do hipotálamo. A longo prazo aplicação pretendida para este modelo validado é testar efeitos dos poluentes do mundo real para a saúde do cérebro e doenças neurodegenerativas. Fornecemos uma descrição detalhada de um ensaio in vitro em formato de 96 poços para a medição da activação da microglia e sobrevivência das células do hipotálamo após a exposição de MIC roglial meios condicionados.

activação da microglia foi determinada após a exposição AgNP usando uma enzima de TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Para determinar o efeito da microglia activada em células do hipotálamo, os AGNPS foram removidas a partir do sobrenadante da microglia (meio condicionado), utilizando um dispositivo de filtração. O dispositivo de filtração mantém citocinas, excluindo os AGNPS com base no tamanho. Resumidamente, o sobrenadante da microglia tratados com ou sem AGNPS foi recolhido, adicionado aos filtros, e centrifugado a 14000 xg durante 15 min. Foram então capaz de determinar a influência de citocinas secretadas microgliais sobre a viabilidade das células do hipotálamo. Toxicidade celular após a exposição ao meio condicionado (contendo citocinas) foi determinada através de um ensaio baseado em resazurina ^5,6 como anteriormente descrito. Metabolicamente activas células reduzir resazurina e produzir um sinal fluorescente proporcional ao número de células viáveis ^7.

nt "> Existem várias vantagens de usar esta técnica em detrimento de outros (como co-cultura, configurações trans-bem, ou in vivo). O nosso modelo fornece a capacidade de ativar diretamente microglia e determinar se fatores secretados são tóxicos para os neurônios ⁸ . O protocolo atual usa imortalizado microglia BV2 estimulados com nanopartículas de 20 nm de diâmetro, e imortalizado células do hipotálamo murino (designado mHypo-A1 / 2) ⁹ para a determinação da resposta subseqüente. Embora este protocolo foi optimizado para essas condições específicas, os métodos podem ser alterada para ser usado em outros modelos de morte celular induzida por microglia, ou com outros tipos de células, incluindo neurónios e microglia primária.

Protocolo

1. Manutenção Cultura de Células microglia

1. meio de cultura de célula quente (Dulbecco Modified Eagle Médium; DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
2. Obter massa congelada de células microgliais bv2 na passagem 18 - 25 a partir do armazenamento a -80 ° C. Rapidamente descongelar células em 37 ° C banho de água.
3. Suavemente transferir as células para um frasco de 75 centímetros ventilado ² contendo meio de cultura de células de 10 ml.
4. Incubar balão em 5% de _CO2 a 37 ° C. media aspirado após 24 horas e substituir por meios frescos. Crescer as células até cerca de 70 - 80% de confluência.

2. Contagem e Células chapeamento

1. Em um banho de água a 37 ° C, e uma solução de DMEM morno-1x tripsina-EDTA.
2. Aspirar meios de células e adicionar 500 ul de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 2-5 min.
3. Utilizando um raspador, remover as células do frasco e suspender em 5 mlde DMEM. Passar as células através de um filtro de 70 um para um tubo de 50 ml, três vezes.
4. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e semear 8000 células / cavidade em uma placa de fundo preto walled clear em um volume final de 200 ul de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN. Incubar a placa em 5% de _CO2 a 37 ° C durante 24 h.
5. Remover antigo DMEM e substituir com 200 mL de DMEM aquecido suplementado com 1% PSN ao soro fome microglia. Incubar a placa em 5% de _CO2 a 37 ° C durante 24 h.

3. Ativação Microglia

1. Em tubos separados, diluir AGNPS (0,01, 0,05 ou 0,1 ug / ml) e veículo / controlo neutro (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM isento de soro suplementado com 1% de PSN para concentrações finais de trabalho.
2. Retirar 100 ul de meio de cada poço e substituir com 100 ul de composto de tratamento apropriado.
3. Incubar a placa em 5% de _CO2 a 37 ° C durante 24 h.

4. Filtragem meios condicionados

1. Recolhe 200 ul de sobrenadante de meio de cada poço e transferir para um filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) com o tubo de recolha (1,5 a 2 ml de capacidade).
2. Centrifugar a 14000 xg à temperatura ambiente durante 15 min.
3. Descartar o fluxo de passagem (sobrenadante com partículas) e colocar o filtro de cabeça para baixo para um novo tubo de recolha.
4. Centrifugar a 1000 xg à temperatura ambiente durante 2 min.
   NOTA: A mídia filtrado resultante (contendo citocinas secretadas) é concentrada por seis vezes.
5. Levar o volume do concentrado para 400 ul com DMEM fresco suplementado com FBS a 10% e PSN a 1% e armazenar em gelo.
   NOTA: Para garantir AGNPS residuais são removidos da mídia filtrados, gerar uma concentração AgNP com base no pico característico em cerca de 390-420 nm ^10. Resumidamente, preparar alíquotas de AGNPS não filtradas (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, e 0,2 ug / ml tal como descrito no passo 3.1) e filtradacontrolo de veículo (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM isento de soro. Alíquota de 50 ul de amostras e padrões filtrada para um preto murado placa de fundo claro. Usando um espectrofotômetro, medir a absorvância a 390-410 nm e comparar as leituras para a curva de concentração AgNP. Se as amostras filtradas têm o mesmo valor de absorvância como a amostra de controlo com veículo, pode-se supor AGNPS residuais são removidos.
6. Utilizar metade das meios filtrados para determinar seguintes instruções de secreção de TNF-α a partir de um kit disponível comercialmente.

5. hipotálamo Manutenção Cultura de Células

1. meio de cultura celular DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de PSN para 37 ° C.
2. Obter massa congelada de células no hipotálamo passagem 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 armazenados a 80 ° C. Rapidamente descongelar células em 37 ° C banho de água.
3. Suavemente transferir as células para um frasco de 75 centímetros ventilado ² contendo meio de cultura de células de 10 ml.
4. Incubar balão em 5% de CO ₂ a 37 ° C. media aspirado após 24 horas e substituir por meios frescos. Crescer as células até aproximadamente a 70 - 80% de confluência.

6. Determinar a toxicidade celular hipotálamo

1. DMEM morno e solução 1x tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C.
2. Aspirar meios de células hipotalâmicas e adicionar 500 ul de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 2-5 min. Remover as células de balão usando um raspador tal como descrito acima no passo 2.
3. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa células hipotalâmicas a 5000 células / poço num preto walled placa de fundo claro, num volume final de 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de PSN e incubar durante a noite em 5% de _CO2 a 37 ° C .
4. Retirar 100 ul de meios de idade, utilizando um pipetador multicanal e adicionar 100 ul de meios condicionados concentrados filtrada, para uma concentração final de 1x.
5. Incubar a placa em 5% de _CO2 a 37 ° C durante 24 h.
6. Adicionar 221; L de reagente de resazurina e Incubar a placa durante 20 minutos em 5% de _CO2 a 37 ° C.
7. Usando um espectrofotômetro multimodo, fluorescência registro (560 nm EX / 590 nm EM) para medir a viabilidade celular. Relatar os resultados como unidades de fluorescência relativas (RFU).

Resultados

Mostra-se que a função da microglia como um substituto para o biossensor resposta do cérebro com as nanopartículas utilizando o protocolo anterior. Os resultados incluem a medição dos efeitos tóxicos da activação microglial na morte celular neuronal jusante. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho do protocolo para ativar a microglia e determinar se as citocinas secretadas reduzir a viabilidade dos neurônios do hipotálamo. Secreção de TNF-α foi significativamente aumentad...

Discussão

Estudos recentes sustentam que a exposição ambiental contribui para a obesidade e outras doenças neurodegenerativas ^11,12. No entanto, as técnicas usadas em estudos anteriores são demoradas e caras. Considerações econômicas, sistemas de entrega fisiologicamente relevantes, questões éticas com o uso extensivo de modelos animais in vivo e dificuldade em traduzir descobertas em recomendações de saúde significativas são alguns dos principais desafios que impediram os avanços no estudo da neurotoxicidade i...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células/Reagentes
Linha celular microglial de camundongo (BV2)	Coleção de linha celular interlab (Gênova, Itália	)ATL03001
Linha celular de hipotálamo de camundongo adulto mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium	Invitrogen	10313-039
Soro fetal bovino	PAA Labs	A15-751
Penicilina/Estreptomicina/Neomicina	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Nanopartículas de prata (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Reagente de viabilidade celular	Invitrogen	A13262
Mouse TNF- &alfa; ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolissacarídeo	Sigma-Aldrich	L4391
Citrato de Sódio	Sigma-Aldrich	S4641
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Equipamento
96 W Placa Inferior Óptica, Poliestireno Preto, Tratamento para Cultura de Células, com tampa, Estéril	Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 com membrana Ultracel-10	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Microplaca Multimodo	Molecular Devices	M5
Falcon Centrífuga Cônica de 50 ml Tubos	Corning, Inc	14-432-22
Filtros de Célula Falcon 70 μ m	Corning, Inc	08-771-2
Centrífuga de mesa 5430	Eppendorf	22620560