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Artigo de método

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed

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DOI:

10.3791/54666

⸱

31 de outubro de 2016

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

Neste artigo

Resumo

Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

Resumo

A segregação cromossômica em oócitos humanos é propensa a erros, resultando em aneuploidia, que é a principal causa genética de aborto espontâneo e defeitos congênitos. O estudo do comportamento cromossômico em oócitos de organismos modelo é muito promissor para descobrir a base molecular da suscetibilidade de oócitos humanos à aneuploidia. Drosophila melanogaster é passível de manipulação genética, com mais de 100 anos de pesquisa, comunidade e desenvolvimento de técnicas. A visualização do comportamento cromossômico e da montagem do fuso em oócitos de Drosophila tem desafios particulares, no entanto, devido principalmente à presença de membranas ao redor do oócito que são impenetráveis aos anticorpos. Descrevemos aqui protocolos para a coleta, preparação e imagem da montagem do fuso da meiose I e do comportamento cromossômico em oócitos de Drosophila, que permitem a dissecção molecular da segregação cromossômica neste importante organismo modelo.

Introdução

O estudo da meiose às vezes é descrito como a "genética da genética". Isso ocorre porque as propriedades fundamentais da herança cromossômica e do sortimento independente são realizadas por meio da segregação dos cromossomos durante a produção dos gametas. Uma demonstração importante da teoria cromossômica da herança veio em 1916 do trabalho de Calvin Bridges em Drosophila melanogaster1. Este e outros estudos de genética clássica em Drosophila contribuíram muito para nossa compreensão da genética. O exame citológico de cromossomos meióticos em oócitos de Drosophila, no entanto, tem sido um desafio. Isso ocorre principalmente porque a imunofluorescência de oócitos de Drosophila em estágio avançado, quando o fuso se reúne e os cromossomos são orientados para segregação, é dificultada pela presença de membranas que tornam o oócito impenetrável aos anticorpos.

Apesar desse desafio, os oócitos de Drosophila continuam sendo um modelo atraente para o estudo do comportamento cromossômico e da montagem do fuso. Isso se deve às poderosas ferramentas genéticas disponíveis na Drosophila, mas também porque os oócitos param na metáfase I, quando os cromossomos são orientados e o fuso está totalmente formado. Isso facilita a coleta e o exame de um grande número de oócitos neste importante estágio da divisão celular. Além disso, um organismo modelo simples que é passível de manipulação genética para o estudo da segregação cromossômica de oócitos pode fornecer uma contribuição importante para nossa compreensão da saúde reprodutiva humana. Erros no número de cromossomos são a principal causa genética de aborto espontâneo e defeitos congênitos em humanos2. A maioria desses erros pode ser atribuída ao oócito e está correlacionada com o aumento da idade materna. A idade média das mães nos EUA tem aumentado, tornando isso uma grande preocupação de saúde pública.

Descrevemos aqui métodos para o exame citológico de oócitos de Drosophila, incluindo uma demonstração de como remover as membranas do oócito. Esses métodos são modificações de protocolos descritos pela primeira vez por Theurkauf e Hawley3, Zou et al.4, e Dernburg et al.5. Também incluímos métodos para o enriquecimento de diferentes estágios de oócitos, com base em um protocolo descrito pela primeira vez por Gilliland et al.6. Finalmente, adicionamos instruções para o tratamento medicamentoso de oócitos de Drosophila. Juntos, esses métodos permitem a investigação citológica da segregação cromossômica oocitária e montagem do fuso em Drosophila.

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Protocolo

Nota: Os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra maneira. incubadoras de temperatura controlada são usados ​​para manter as temperaturas para criação mosca e cruza salvo indicação em contrário.

1. Preparações

  1. Prepare Moscas.
    1. Prometáfase enriquecido coleções de ovócitos.
      1. Limpar moscas adultas a partir saudáveis, jovens de ações ou transversais culturas. garrafas de idade para dois dias a 25 ° C.
        Nota: Geralmente duas garrafas saudáveis ​​serão suficientes, embora mais podem ser necessários para algumas culturas cruzadas.
      2. Após dois dias, recolher ~ 100 a 300 (fêmeas que são 0 a 2 dias de idade, neste ponto) de garrafas. As fêmeas não precisa ser virgens. Adicionar uma pincelada de pasta de levedura para o lado de um frasco e colocá-30 fêmeas e 10 machos e 15 cada um em frascos yeasted. frascos de idade para dois dias a 25 ° C.
    2. Metaphase enriquecido ovócitos Collections.
      1. Recolha ~ 100 a 300 fêmeas de estoque ou cross cultures. Adicionar uma pincelada de pasta de levedura para o lado de um frasco e colocar cada 30 fêmeas (sem machos adicionados) para dentro de frascos yeasted. frascos de idade para três a cinco dias a 25 ° C.
  2. Prepare Solutions.
    Nota: As soluções podem ser armazenadas indefinidamente à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra maneira.
    1. Preparar tampão de modificação de Robb (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de sacarose, acetato de sódio 275 mM, acetato de potássio 200 mM, glicose 50 mM, cloreto de magnésio a 6 mM, e cloreto de cálcio 5 mM. Use 10 N 11: 8 de hidróxido de sódio: hidróxido de potássio para trazer o pH para 7,4. Esterilizar por filtração; Não autoclave. Armazenar a -20 ° C. Descongelar conforme necessário para preparar ~ 200 ml de 1x Robb por ovócitos prep.
    2. Fixação Solutions.
      1. Opção # 1: Prepare formaldeído / fixação heptano. Preparar tampão de fixação: solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS), mais 150 mM de sacarose. Para usar, faça fresco com 687,5 ul Fixação de buffer e 312,5 mL de 16% de formaldeídopor prep oócito.
        CUIDADO: Use luvas enquanto estiver usando soluções de formaldeído em um exaustor. Descarte de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais.
      2. Opção # 2: Preparar o formaldeído / fixação cacodilato. Prepare a mistura Fix: sacarose 250 mM, acetato de potássio 100 mM (pH 7,5), acetato de sódio 25 mM (pH 7,0), e EGTA 25 mM (pH 8,0). Para usar, faça fresco com 400 ul Fix Mix, 100 cacodilato ul de potássio (1 M, pH 7,2), e 500 mL de 16% de formaldeído por prep oócito.
        CUIDADO: cacodilato de potássio contém arsênico.
    3. Prepare PBS / Triton X-100: 1x PBS mais 1% ou 0,05% de Triton X-100. Armazenar a 4 ° C.
    4. Prepare PBS-Tween 20 Albumina de Soro Bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, BSA a 0,5% (w / v) e 0,1% de Tween-20. Pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana.
    5. A fluorescência in situ fluorescente (FISH) Soluções.
      1. Prepara-cloreto de sódio 20X Citrato de sódio (SSC): 3 M de cloreto de sódio e citrato de sódio 0,3 M.
      2. Prepare 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2 x SSC mais 0,1% de Tween-20. Faça frescas, ~ 20 ml por prep oócito.
      3. Preparar soluções de formamida: 2 x SSC, 0,1% de Tween-20, além de formamida. Adicione fresco, 1 ml de 20% de formamida, 0,5 ml de formamida a 40%, e 2 ml de formamida a 50% por preparação de oócitos.
        CUIDADO: Use luvas enquanto estiver usando soluções de formamida em um exaustor. Descarte de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais.
      4. Preparar a solução de hibridização: 2 x SSC, formamida a 50%, e 10% de sulfato de dextrano (w / v). Armazenar a 4 ° C.
    6. Sondas peixe.
      1. Oligonucleotídeos ordem (ver Tabela 1 para sequências) com HPLC e desejado 5 'modificação fluorescente (por exemplo, Cy3 ou Cy5). Ressuspender em Tris-EDTA (TE) a 50 ng / ul.
        NOTA: Proteja oligos da exposição à luz em todos os momentos.

2. Recolha de tarde-estágio Drosophila Oócitos

  1. Como oócitos de Drosophila com membranas íntegras vai ficar com plástico e vidro, pré-revestir o interior de um tubo de 5 ml e uma pipeta de Pasteur por prep ovócito com PTB.
  2. Anestesiar todos os ~ 100 a 300 moscas yeasted com dióxido de carbono e adicionar a um misturador contendo ~ 100 ml de 1X tampão de Robb. Pulso três vezes (~ 1 segundo cada). Mantenha oócitos em Robb para <20 min para evitar a activação.
    NOTA: Como alternativa, os oócitos podem ser mão-dissecados das fêmeas. A vantagem deste método é que ele exige menos fêmeas. No entanto, os cuidados devem ser tomadas para limitar a exposição ao dióxido de carbono para apenas alguns minutos para evitar erros associados à hipóxia 7.
  3. Filtrar através de malha grande (~ 1.500 mm) em 250 ml copo para remover partes do corpo grandes. Se muitos abdomens intactas permanecer no material de malha, re-moagem usando adicional buffer de Robb e filtro novamente. Vamos resolver ~ 2 min, em seguida, aspirar off camada superior, removendo como muitos dos grandes partes do corpo quanto possível.
  4. Filtro através de malha pequena (~ 300 uM) para uma proveta de 250 ml. Lavar ovócitos restantes fora do primeiro copo usando adicional de Robb e revestido Pasteur pipeta. Vamos settle ~ 3 min; oócitos vai resolver fora. Aspirar off todos, mas ~ 10 ml.
  5. Despeje o máximo de 10 ml como se encaixam em revestido tubo de 5 ml. Vamos resolver, remover o líquido, e repita com o restante. Lavar ovócitos restantes fora do copo usando Pasteur pipeta adicional de Robb e revestido. Vamos resolver em 5 ml tubo para ~ 3-5 min.

3. Os tratamentos medicamentosos (Opcional)

  1. Revestimento de um segundo tubo de 5 ml com PTB para cada prep oócito. Adicionar solvente apropriado (controle) ou de drogas para 1 ml de Robb cada oócito para cada preparação (Tabela 2).
  2. oócitos dividida em segunda revestido tubo de 5 ml. Vamos Settle, remover o líquido e adicionar 1 ml Robb das mais solventes em um tubo e 1 ml Robb de mais droga no segundo tubo. Nutar para a quantidade de tempo apropriado para o tratamento de drogas (Tabela 2). euet resolver.

4. Fixação

  1. Aspirar off todo o líquido e imediatamente adicionar 1 ml Fix.
  2. Opção # 1: Formaldeído / fixação heptano (Tampão de Fixação mais 5% de formaldeído).
    1. Fixar para 2.5 min em um nutator. Adicionar 1 ml de heptano e vortex 1 min. Vamos settle ~ 1 min.
    2. Retire todo o líquido e, em seguida adicionar 1 ml 1x PBS. Vortex 30 seg. Vamos settle ~ 1 min.
    3. Retire todo o líquido e, em seguida, preencher tubo com 1x PBS.
      NOTA: Os oócitos podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator durante várias horas à temperatura ambiente.
  3. Opção # 2: fixação de formaldeído / cacodilato (Fix Mix mais 8% formaldeído e cacodilato 100 mM).
    1. Correção para 6 min em um nutator. Vamos contentar 2 min. Remover o líquido e, em seguida, preencher tubo com 1x PBS.
      NOTA: Os oócitos podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator durante várias horas à temperatura ambiente.

5. Removendo membranas ( "Rolling")

  1. Usando revestido pipeta de Pasteur, adicione ~ 500 a 1.000 oócitos para a parte fosco (jacto de areia) de uma lâmina de vidro. Remover todas as partes do corpo e materiais usando uma pinça estranhos. Não deixe oócitos secar; adicionar 1x PBS conforme necessário.
  2. Coloque uma lamela em cima dos oócitos e gentilmente oócitos "Roll" até que todas as membranas são removidos (arrastando a borda da lamela entre os oócitos funciona melhor.) Verifique periodicamente o progresso sob o microscópio, adicionando mais 1x PBS, conforme necessário. Tome cuidado como muita pressão irá destruir os ovócitos.
    NOTA: Para imunofluorescência somente, continue com o Passo 6. Para peixes (com ou sem imunofluorescência), continue na Etapa 7.

6. Coloração de anticorpos de Drosophila Oócitos

  1. Extração e Bloqueio
    1. Lavar oócitos enroladas em um tubo cónico de 15 mL contendo ~ 15 mL de PBS / 1% de Triton X-100. oócitos nutar nesta solução por não menos do que 1,5 horas e não mais do que 2 h.Este passo permite a penetração do anticorpo.
    2. Vamos oócitos resolver ~ 2 min. Remover o líquido, juntamente com o maior número de membranas quanto possível, em seguida, adicionar PBS / 0,05% de Triton X-100.
      NOTA: Membranas vai resolver mais lento do que oócitos laminados.
    3. Deixe oócitos resolver ~ 2 min, em seguida, remover todos, mas ~ 1 ml de líquido. oócitos de transferência para se formou 1,5 tubo ml e remover o líquido remanescente. Adicionar 1 ml de TBP para o bloqueio e nutar durante 1 h.
  2. coloração de anticorpos
    1. Pré-absorção de anticorpos secundários contra embriões.
      NOTA: Este passo elimina a coloração de fundo a partir de interações de anticorpos não específicos com proteínas de Drosophila.
      1. Recolher e corrigir embriões de Drosophila (~ 25 ul) por típico procedimento 8. Armazenar em metanol a -20 ° C.
      2. Remover o metanol a partir de embriões, adicionar 800 mL de metanol, com 200 ul de 1x PBS, e nutar durante 15 min. Retirar 500 ul de sobrenadante e substituir com 500 ul de PBS 1x. Então nutar para 15 min. Repita duas vezes (para um total de ~ 1 hr de lavagens), e depois terminar no PTB.
        NOTA: Os embriões podem ser utilizadas imediatamente ou mantidas no nutator por várias horas à temperatura ambiente.
      3. Remover o líquido, encher com PTB para 200 mL por prep oócito, e adicionar anticorpos secundários fluorescente-etiquetados em diluições adequadas (tendo em mente que o volume final será de 300 ul;. Consulte o passo 7.4) nutar a 4 ° C durante a noite (preferível) ou à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas.
        NOTA: Os anticorpos pré-absorvida irá ser utilizado no Passo 6.2.4.
        NOTA: Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível, uma vez anticorpos fluorescentes foram adicionados.
    2. Remover o líquido a partir de oócitos, encher com PTB até 300 ml, e adicionar anticorpos primários nas diluições apropriadas. Nutar a 4 ° C durante a noite (preferível) ou à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas.
    3. Lavar oócitos quatro vezes durante 15 minutos cada um com 1 ml PTB.
    4. Removerlíquido a partir de oócitos, adicionar 200 ul de sobrenadante a partir de embriões pré-absorvida (anticorpos secundários). Em seguida, preencha com PTB para 300 l. Nutar à temperatura ambiente durante 3 a 4 horas (preferivelmente) ou a 4 ° C durante a noite.
    5. Lavar oócitos uma vez durante 15 min com 1 ml PTB, remover o líquido. Em seguida, adicione 0,5 mL Hoechst 33342 e 500 ul PTB e nutar para 7 min.
    6. Lavar oócitos duas vezes durante 15 minutos cada um com 1 ml PTB.
      NOTA: Os oócitos pode ser montada numa lamela imediatamente ou pode ser armazenada na TBP a 4 ° C até estar pronto para a imagiologia.

7. FISH (Continue a partir do passo 5 acima)

  1. Lavar oócitos enroladas em um tubo cônico de 15 ml contendo ~ 15 ml 2x SSCT. Vamos oócitos resolver ~ 2 min. Remova todos, mas ~ 0,5 ml de líquido, juntamente com o maior número de membranas quanto possível.
    NOTA: Membranas vai resolver mais lento do que oócitos laminados.
  2. Transferência de oócitos para 0,5 tubo ml e remover o líquido remanescente. Sucessivamente adicionar e remover 500 mL20%, 40%, 50% e soluções de formamida, de nutação durante 10 minutos em cada solução.
    NOTA: Os oócitos vai resolver mais lento com maiores percentagens de formamida.
  3. Remover o líquido, em seguida, adicionar solução de formamida a 500 ul de 50%, e nutar a 37 ° C durante 1 a 5 horas.
    NOTA: Longer incubações resultar em uma melhor penetração da sonda.
  4. Remover o líquido, deixando para trás nada mais do que ~ 100 ul de oócitos, e adicionar 36 ul de solução de hibridação mais 2 ul de sonda (50 ng / mL) e 2 mL de água ou 2 mL de uma sonda 2 ND (Tabela 1).
  5. Incubar a 91 ° C durante 3 min (apenas FISH) ou 80 ° C durante 20 min (FISH e de imunofluorescência), seguido por incubação num banho de água a 37 ° C durante a noite.
    NOTA: Estes passos podem ser efectuados num termociclador.
  6. Não remover o líquido. Adicionar 500 ul de solução a 50% de formamida e nutar a 37 ° C durante 1 h.
  7. Vamos Settle, remover o líquido, adicione a solução de formamida 500 mL de 50%, umd nutar a 37 ° C durante 1 h.
  8. Vamos assentar, remover o líquido, adicionar solução de formamida a 500 ul de 20%, e nutar à temperatura ambiente durante 10 min.
  9. Execute três lavagens rápidas em 500 ul 2x SSCT (vamos Settle, remover, em seguida, adicione o líquido, inverter várias vezes, repetir.) Vamos Settle, remover o líquido, em seguida, adicionar 500 mL PTB e nutar durante 4 h.

8. Coloração de anticorpos após FISH

  1. Remover o líquido a partir de oócitos, encher com 300 uL de TBP, e adicionar anticorpo anti-tubulina α 10 ul conjugado com FITC. Alternativamente, outros anticorpos podem ser utilizados, seguindo o protocolo acima. Nutar à temperatura ambiente durante a noite.
  2. Lavar oócitos uma vez durante 15 min com 500 uL PTB, remover o líquido, em seguida, junta-se 0,5 ul de Hoechst 33342 e 500 ul PTB e nutar durante 7 min.
  3. Lavar oócitos duas vezes durante 15 minutos cada um com 500 ul PTB.
    NOTA: Os oócitos pode ser montada numa lamela imediatamente ou pode ser armazenada na TBP a 4 ° C até pronto para serimagiologia. Mantenha oócitos no escuro, tanto quanto possível, uma vez anticorpos fluorescentes foram adicionados.
Repita Nome Cromossoma Seqüência Oligo *
359 X GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 sequência de Eric Joyce, comunicação pessoal, outras sequências de Sullivan et al. 8

Tabela 1: sondas de peixe para repete centroméricas de Drosophila.

Droga Solvente da concentração A concentração final Tempo de tratamento Efeito
colchicina etanol 125 mM 150 uM 10 min ou 30 min desestabilizar não cinetocoro (10 min), 9 ou todos os microtúbulos (30 min)
paclitaxel DMSO 10 mM 10 uM 10 min estabilizar microtubules
Binucleine 2 DMSO 25 mM 25 uM 20 min inibir Aurora B quinase 10

Tabela 2: O tratamento medicamentoso.

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Resultados

Os métodos que descrevemos aqui resultará na coleta de oócitos em estágio final de Drosophila representam três fases da meiose (Figura 1). Os oócitos na profase distinguem-se pela presença do envelope nuclear, que é visível pela falta de sinal de tubulina na região em torno do cariossomo (Figura 1A). Prometáfase é o período após nuclear quebra envelope durante o qual os monta fuso. Durante prometáfase, o cariossomo assume uma forma distinta, tor...

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Discussão

Staging Drosophila Oócitos

Embora um cariossomo alongada é muitas vezes visto em oócitos prometáfase, usando cariossomo forma de distinguir prometáfase a partir de oócitos metafase pode ser problemático. Durante prometáfase, o cariossomo começa como uma forma redonda, alonga, e, em seguida, se retrai para uma forma redonda como o oócito se aproxima da prisão metáfase. Isto significa que muitos oócitos prometáfase não tem uma cariossomo alongado. Além disso, se os oó...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Christian Lehner por fornecer o anticorpo CENP-C e a Eric Joyce por recomendações sobre FISH. O trabalho no laboratório McKim foi financiado por uma bolsa do NIH (GM101955).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos cônicos de 15 mlVários
formaldeído a 16% TedPella, Inc.18505PERIGOSO; uma vez aberto, descartar após um mês
Copos de 250 mlVários
tubos de 5 mlVários
fermentos secos ativosVáriosmisturam com água para fazer uma pasta com a consistência de
anticorpo anti-alfa;-tubulinaclone DM1ASigmaF2168
SigmaB1186Misturador PERIGOSO
Várias
albuminas de soro bovinoSigmaA4161
Várias
colchicinasSigmaC-9754LAMÍNULAS
PERIGOSASVWR48366-227No. 1 1/2
sulfato de dextranoVários
DMSOVários
EGTAVários
etanolVárias
pinçasTed Pella, Inc.5622Dumont pinças de alta precisão grau estilo 5
formamidaSigma47670-250ML-F
lâminas de vidroVWR48312-003
glicoseVários
tubos graduados de 1,5 mlVários
HEPESVWREM-5330disponíveis em vários vendedores
Hoechst 33342Vários
cloreto de magnésioVários
metanolVárias
malhas grandes (~ 1.500 µ m)VWRAA43657-NKvariedade de formatos e outros fornecedores, malha pequena de 12 ou 14 malhas
(~300 µ m)Spectrum labs146 424variedade de formatos, e.g., 146 422 ou 146 486
nutatorVárias
pipetas de PasteurAcetato de potássio diverso
Ácido cacodílicoSigma
hidróxido Vários
acetato de sódioVários
cloreto de sódioVários
citrato de sódioVários
hidróxido de sódioVários
sacaroseVários
taxol (paclitaxel)SigmaT1912PERIGOSO
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
vórticeVários
de manteiga de amendoim conjugado ao Binucleína 2 do FITC Cloreto de cálcio C0125 PERIGOSO; alternativamente, o cacodilato de sódio pode ser substituído por potássio

Referências

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  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
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  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
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  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Montagem do FusoComportamento CromossômicoRemoção de MembranaImunofluorescênciaMicroscopia ConfocalPenetração de AnticorposFixação de OócitosAnálise do Cariossoma
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