Artigo de método

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

DOI:

10.3791/54673

⸱

11 de novembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

relógios circadianos são funcionais em todos os organismos sensíveis à luz, permitindo uma adaptação ao mundo externo, antecipando mudanças ambientais diárias. progressos consideráveis ​​na nossa compreensão da estreita ligação entre o relógio circadiano e a maioria dos aspectos da fisiologia tem sido feito no campo ao longo da última década. Entretanto, desfazendo a base molecular que está na base da função do oscilador circadiano em humanos permanece mais elevada do desafio técnico. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de uma abordagem experimental para o longo prazo (2-5 dias) de gravação bioluminescência e coleta médio saída em células primárias humanas cultivadas. Para este fim, temos transduzidas células primárias com um repórter de luciferase de lentivírus que está sob o controle de um promotor do gene do núcleo do relógio, o que permite a avaliação paralela de secreção hormonal e bioluminescência circadiano. Além disso, descrevemos as condições para interromper o relógio circadiano no prcélulas humanas imary por transfecção siRNA CLOCK segmentação. Nossos resultados sobre a regulação circadiana da secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas humanas e Myokine secreção pelas células de músculo esquelético humano, são aqui apresentados para ilustrar a aplicação desta metodologia. Essas configurações podem ser usadas para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e analisar o seu impacto funcional em células primárias em condições fisiológicas ou fisiopatológicas.

Introdução

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O sistema de temporização circadiano (do latim "Circa diem") surgiu em todos os organismos sensíveis à luz, como um mecanismo adaptativo à rotação da Terra. Nos mamíferos, ele é organizado de uma maneira hierárquica, englobando o relógio central, que está situado no núcleo supraquiasmático do hipotálamo ventral e periférica (ou secundário) osciladores que se encontram em vigor nos diferentes órgãos. Além disso, estes osciladores autónomos auto-sustentadas de células são funcionais em quase todas as células do corpo 1. Sinais fóticas representam uma sugestão de sincronização dominante (Zeitgeber) para os neurônios SCN, enquanto que os sinais neurais e humorais que emanam do SCN repor os relógios periféricos. Em ritmos de repouso-atividade de adição, que dirigem em ciclos de alimentação-jejum, por sua vez, são outros sincronizadores para relógios periféricos 2. De acordo com o nosso conhecimento actual, a composição molecular do clock do núcleo é baseada na transcrição e translaçãoloops de feedback adicionais, que são conservadas entre organismos. Esta inclui os activadores de transcrição BMAL1 e CLOCK, que juntos ativam a transcrição dos genes negativos núcleo de clock por e chorar. Altos níveis de PER e proteínas Cry vai inibir a sua própria transcrição através da inibição do complexo / CLOCK BMAL1. Um circuito auxiliar consiste nos receptores nucleares REV-ERBs e Rors, que também regulam a transcrição de BMAL1 e CLOCK. Além disso, os eventos pós-translacionais, incluindo a fosforilação, sumoylation, acetilação, O-GlcNAcylation, a degradação ea entrada nuclear das proteínas do núcleo do relógio representam uma camada de regulamentação adicional importante no estabelecimento do 24 hr ciclo de oscilação 3.

Evidências acumuladas resulta de estudos em modelos de roedores e destaca o papel crítico do sistema circadiano na coordenação das funções metabólicas e endócrinas 4-5. Um número de large-escala transcriptoma análise sugerem que a alimentação - ciclos jejum desempenhar um papel central na sincronização dos osciladores periféricos 6-8. Num acordo com estes estudos, a análise metabolômico e lipidomas em roedores e seres humanos revelaram que um grande número de metabolitos oscilar em tecidos, plasma, saliva e de um modo circadiano 9-11. É importante ressaltar que a maioria dos hormônios apresentam ritmos circadianos em 5,12-13 sangue. Além disso, relógios circadianos do hormônio correspondente produzindo tecidos periféricos pode regular a secreção hormonal localmente. Osciladores circadianos Cell-autónoma foram descritos em roedores e células de ilhéus pancreáticos humanos 14-16. Estes osciladores desempenham um papel essencial na regulação do transcriptoma de ilhotas pancreáticas e função 15,17-18. Além disso, Myokine secreção por miotubos esqueléticos humanos tem sido recentemente demonstrada a exibir um padrão circadiano, que é regulada por osciladores de células-autônomaRS operatórias nestas células 19.

Várias abordagens para estudar ritmos circadianos em humanos in vivo têm sido amplamente utilizados. Por exemplo, a melatonina plasma ou níveis de cortisol, bem como a temperatura da superfície da pele torácica (revisto em referências 3,20) foram estudados para avaliar relógios circadianos endógenos. Embora estes métodos permitem estudar oscilações circadiano sistêmicos in vivo, eles estão longe de fornecer uma avaliação fiável dos ritmos circadianos autónomas free-running em diferentes órgãos e tecidos. No entanto, como dissecção da regulação sistêmica seria uma ferramenta indispensável para compreender o efeito específico de relógios moleculares intracelulares sobre a função destas células. Portanto, um esforço substancial tem sido empreendido para desenvolver abordagens confiáveis para estudar relógios humanos em cultura de células imortalizadas ou primárias sincronizados in vitro. Mais importante, foi demonstrado quecaracterísticas relógio medidos em células de fibroblastos da pele primária cultivadas reflecte fielmente as propriedades de clock individuais de todo o organismo 21. O desenvolvimento de repórteres circadianos fluorescentes e bioluminescentes avançou fortemente esta abordagem 22-27. Além disso, os relógios que estudam células primárias que são derivadas de diferentes órgãos periféricos permite a investigação das propriedades moleculares de relógios específicos de tecidos humanos 3,5,16,19-20,28. Assim, a avaliação dos relógios circadianos in vitro explantes ou células primárias sincronizados, usando repórteres bioluminescentes, representa um método muito útil para estudar a composição molecular de relógios periféricos humanos e seu impacto na função do órgão.

Neste artigo, vamos apresentar protocolos detalhados para avaliar a expressão do gene circadiano nas células das ilhotas primário e músculo-esquelético humano sincronizados in vitro, bem como o impacto do relógio celular autónomaperturbações da função secretora destas células.

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Protocolo

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Declaração de ética: Manipulações incluídos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê do Hospital Universitário de Genebra de Ética e pela Comissão de Ética SUD EST IV (Acordo 12/111) 19. Ilhotas humanas foram isoladas de pâncreas de doadores de múltiplos órgãos com morte cerebral na Transplantation Centro Ilhota no Hospital Universitário de Genebra (Suíça), conforme descrito por nós em referências 16,18, ou obtidos de uma fonte comercial.

1. Preparação da cultura de células primárias

  1. Isolamento Islet humana Pancreatic, dissociação e Cultura
    NOTA: Revestimento cada tubo, a ponta de plástico ou com pipeta Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) médio, a fim de evitar ilhéus ou células dos ilhéus se colem à superfície do plástico, o que pode levar a uma perda significativa de material celular.
    1. Um dia antes da ilhota de dissociação de células adicionar 1 ml de matriz extracelular rica laminina-5-(derivados de células como descri 804Gcama na referência 29) para 3,5 cm de placa. Antes do plaqueamento de células, a matriz aspirar e lavar o prato 3 vezes com água bi-destilada estéril. Colocar a placa de a secar sob a câmara de fluxo laminar durante 5 min.
    2. Dentro da câmara de fluxo laminar, distribuir as ilhotas obtidas com meio CMRL em 15 de tubo (s) ml. Centrifugar a 272 xg durante 5 min.
    3. Aspirar o sobrenadante, e em seguida ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) pré-aquecido a 37 ° C sem cálcio e magnésio. Centrifugar a 272 xg durante 5 min.
    4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de DPBS.
    5. Para contar o número total de ilhéus, de pipeta 10 ul da suspensão de ilhotas de 1 ml para um novo prato de 3,5 centímetros. Contar o número de ilhotas na gota de 10 ul sob o microscópio e a partir deste cálculo do número total de ilhéus na suspensão de ilhotas de 1 ml. Adicionar 14 ml de DPBS e centrifugar a suspensão de células uma maistempo em 272 xg durante 5 min.
    6. Para a dissociação de células ilhotas, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução de separação celular para um máximo de 1.000 equivalentes de ilhotas (IEQ). Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C e misturar suavemente as ilhotas por pipetagem para cima e para baixo várias vezes por minuto, durante 6-10 min.
      NOTA: Para verificar a qualidade da digestão, pipetar uma gota 2 ul de suspensão sobre uma lâmina de vidro e verifique sob o microscópio que todas as células são bem separados, e que não doublets ou aglomerados de células permaneceram.
    7. Parar a reacção por adição de 14 ml de CMRL frio com suplementos (soro de bovino fetal a 10% (FBS), 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S), 1% de gentamicina, 1 % de piruvato de sódio). Centrifugar a 425 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 15 ml de meio CMRL ao sedimento celular.
    8. Ressuspender o sedimento num pequeno volume de CMRL com suplementos. Contar o número de células ao microscópio usando uma hemocytometros, ajustar o volume CMRL, a fim de se obter uma concentração celular de ~ 650, 000 células / ml.
    9. Pipetar 3 separados gotas de 100 ul cada da suspensão de células dispersas, obtido no passo 1.1.8 em um 3,5 cm de placa pré-revestida com laminina.
      NOTA: As células anexar ao prato em cerca de 24 horas.
    10. Incubar as células (Figura 1A) numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C numa câmara húmida. Alterar a forma da célula de gotas a cada 2-3 dias por aspiração de 100 ul de cada gota e substituindo-o com o mesmo volume de meio fresco.
  2. Mioblasto cultura primária humana e diferenciação em Miotubos
    1. biópsia de tecido, isolamento das células e cultura de mioblastos satélite
      Nota: As biópsias musculares foram obtidos a partir do grupo de Etienne Lefai (INSERM, Lyon, França) 19.
      1. Purificar mioblastos esqueléticos primários de acordo com o procedimento previamente descrito 30.
    2. diferenciando pmioblastos humanos rimary em miotubos
      1. Tomar um frasco (1 x 10 6 células) de mioblastos humanos armazenados em azoto líquido e descongelar células rapidamente, colocando o frasco durante 30 segundos a 1 min num banho de água a 37 ° C com agitação.
      2. células de pipeta (1 ml) em 24 ml de meio de crescimento, composto de Ham F-10 suplementado com 20% FBS, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B.
      3. Centrifugar 5 min a 150 x g.
      4. Remover as células sobrenadante e ressuspender com 15 ml de meio de crescimento fresco por 2,5 x 10 5 células.
      5. Placa, pelo menos, 2,5 x 10 5 células por balão F75 aderente. Manter os mioblastos em uma incubadora celular a 37 ° C e 5% de CO 2.
      6. Uma vez que as células atingem 60-80% de confluência, dissociar as células com tripsina-EDTA a 0,05%, durante 1-2 min e placa-los em 2 ml de meio de crescimento sobre aderentes 3,5 cm pratos de petri.
      7. Depois de atingir a confluência, remover o meio de crescimento.
      8. Inicie o proto diferenciaçãoCol de mioblastos humanos em miotubos através da sua cultura em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo 1 g / L de glucose, 2% de FBS, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B (meio de diferenciação) numa incubadora celular a 37 ° C e 5% de CO 2. Mudar o meio cada 2 a 3 dias.
        NOTA: Miotubos são geralmente formadas dentro de 7-10 dias.
      9. Verifique a diferenciação de células de músculo sob o microscópio (Figura 2A) através da observação da fusão de mioblastos em miotubos polynucleated 19.

2. pequeno ARN interferente (siRNA) Transfecção

  1. siRNA Transfecção de células de ilhéus humanos
    NOTA: O protocolo de transfecção é realizada em gotas de 100 ul no dia seguinte, depois de dissociação de células (passos 1.1.1-1.1.10).
    1. Aspirar 100 ul de meio CMRL de cada gota e substituí-la com o mesmo volume de soro livre de Meio Essencial Mínimo (MEM), 2 hrantes da transfecção por pipetagem.
    2. Prepara-se uma mistura à base de MEM de reagente de transfecção e 50 nM de alvo ARNsi (siClock) ou 50 nM de não-siControl segmentação de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Para um prato com 3 gotas preparar dois tubos de 1,5 ml com 200 ul de MEM cada.
      2. Adicionar a um destes tubos de 4 ul de reagente de transfecção.
      3. Adicionar ao segundo tubo 1 ul da solução de estoque de siRNA apropriado (20 pM).
      4. Agita-se estes dois tubos lentamente no agitador orbital durante 5 minutos e, em seguida, misturar o conteúdo dos tubos em conjunto e agitar por mais 20 min.
    3. Aspirar 100 ul de MEM de cada gota e substituí-lo com o mesmo volume de mistura de transfecção obtido na etapa anterior por pipetagem.
    4. Substituir a solução de transfecção com meio CMRL após 4 h de incubação a 37 ° C. Repita os passos 2.1.1-2.1.3 no dia seguinte para a célula re-transfecção.
  2. Transfection siRNA de Miotubos Humanos
    1. Antes da transfecção, substituir o meio (ver passo 1.2.2.8) com 2 ml de meio fresco diferenciação por 3,5 centímetros prato de petri.
    2. Em um tubo esterilizado de 1,5 mL, preparar uma mistura de 20 nM de ARNsi (siControl ou siClock), o que corresponde a 2,4 mL de uma solução 20 uM de siRNA, e 12 ul de reagente de transfecção diluído em 100 ul de meio de diferenciação. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 15 min com agitação suave.
    3. Transfectar células com 114,4 ul da mistura de ARNsi por 3,5 cm de petri de células de prato e colocar num incubador de cultura de tecido a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.

3. contínuo a longo prazo circadiano Bioluminescência Gravação realizados em paralelo com a avaliação da hormona secreção em células vivas humanas primárias

  1. Apresentando circadianos Bioluminescência repórteres em células primárias humanas porTransdução Lentivirus
    NOTA: Todos os procedimentos com partículas lentivirais deve ser realizada em um Nível de Biossegurança 2 facilidade para tomar precauções adicionais para o trabalho com agentes que representam um perigo potencial moderado a funcionários e ao ambiente.
    1. Prepare partículas repórter lentivirais por co-transfecção do vector de interesse pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-Luc ou com 31 plasmídeo vectores lentivirais pMD2G pLV156-Per2-dLuc (chamado Bmal1-Luc e Per2-Luc, respectivamente,) e psPAX em células 293T utilizando o método de polietilenimina (por procedimento detalhado ver referência 16).
    2. Titula-se as partículas obtidas lentivirais (detalhes sobre a titulação pode ser obtido em http://lentilab.unige.ch/). Para outras experiências, usar lentivírus com títulos variando de 10 4 a 10 5 unidades de transdução [TU / mL].
    3. Coloque a loiça com células das ilhotas humanos ou mioblastos humanos (em 30-50% de confluência) no interior da cabine de fluxo laminaret e substituir o meio com 2 ml de meio CMRL suplementado fresco (veja o passo 1.1.7) ou meio de crescimento (veja o passo 1.2.2.2), respectivamente.
    4. Calcula-se a multiplicidade de infecção (MOI) (isto é, partículas infecciosas (unidades de transdução) / número de células).
    5. Transduzir a cultura de células primárias por pipetagem solução lentivírus para o prato, a fim de obter um MOI = 3 (por exemplo, para 65000 células ligadas adicionar 3 mL da solução de vírus com o título de 6,5 x 10 4-100 gota forma ul).
    6. Incubar durante a noite numa incubadora de cultura de tecidos. Alterar meio do dia seguinte.
      NOTA: transduzir células de ilhéus humanos, pelo menos, 4 dias antes da gravação bioluminescência, a fim de atingir uma expressão suficiente da construção repórter. Os mioblastos são transduzidas durante a fase de expansão, depois deixadas crescer até à confluência, e subsequentemente diferenciados em miotubos.
  2. In Vitro sincronização de células humanas primárias
    1. Adiciona-se 10 uM de adenilil ciclase activador em 2 ml de meio por 3,5 centímetros prato de petri contendo as células primárias transduzidas anteriormente no passo 3.1.5.
    2. Incubar durante 60 minutos a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
    3. Mudar o meio contendo o activador de adenilciclase com 2,5 ml do meio de gravação contendo 100 | iM de luciferina.
      NOTA: Para as células de ilhéus humanos usar CMRL suplementado com 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 1% de gentamicina; para miotubos humanos usar vermelho de fenol - DMEM livre com 1 g / L de glicose, suplementado com 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B.

4. Avaliação paralela de circadiano Bioluminescência Gravação e hormonal Secreção Perfis em células sincronizadas Humano secretora primárias

  1. Configurando a longo prazo perifusão constante e bioluminescência Gravação de células primárias humanas.
    NOTA: saídas Ao trabalharide a câmara de fluxo laminar, limpar todas as superfícies de contato e limitar a exposição de culturas ou meio para o ar para evitar a contaminação.
    1. Para preparar o meio perifusão, adicionar 100? M de luciferina ao meio.
      NOTA: Para as células de ilhéus humanos usar CMRL suplementado com 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 1% de gentamicina; para miotubos humanos usar vermelho de fenol - DMEM livre com 1 g / L de glicose, suplementado com 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de P / S, 0,5% de gentamicina e 0,2% de anfotericina B.
    2. No interior da câmara de fluxo laminar, abrir os 3,5 cm placas contendo as culturas transduzidas, transfectadas e sincronizados primárias de células (células dos ilhéus ou miotubos) como descrito acima. Insira tampas metálicas estéreis (desenvolvidos em casa) (Figura 1B2) nos cm pratos de 3,5, que estão equipados com silicone influxo / efluxo tubos de ligação (Figura 1B1 / B5).
    3. Coloque os pratos na plataforma de medição no 37 ° C light estanque incubadora. Corrigir os pratos para a plataforma usando um adaptador screwable (Figura 1B3). Inserir os tubos de influxo / efluxo de o sistema de perifusão para os tubos de silicone apropriadas da tampa (Figura 1B1 / B5) e ajustar a velocidade da bomba a uma taxa de fluxo de ~ 0,5 mL de meio por 1 h.
    4. Abra o software Drip-biolumicorder desenvolvido in-house que registra os sinais do tubo fotomultiplicador (PMT) detector. Escolheu o diretório onde os dados serão armazenados e começar a bioluminescência contínua gravação de cada prato, clicando no ícone "Iniciar".
      NOTA: Como alternativa ao software Drip-biolumicorder, outros programas (por exemplo LumiCycle), pode ser usado para gravar sinais de detector PMT.
    5. Colocar as placas de cultura de tecidos de 6 poços estéreis na caixa de recolha em gelo.
    6. Abra o software de controlo que controla a temporização do interruptor automático, entre os poços de captação. Configurar o tempo window da recolha de meio (s). Iniciar a coleta do meio de saída a cada 4 horas (14.400 seg; ~ 2 ml por ponto de tempo), clicando no ícone "run".
    7. Transferir e medir o meio de saída de cada coleção bem em estéreis tubos de 2 ml por pipetagem. Manter os tubos em um congelador a -20 ° C antes de iniciar o próximo passo. Repita os passos 4.1.5-4.1.6 a cada 24 horas.
    8. Parar a gravação bioluminescência eo fluxo médio, clicando no ícone "parar" no software correspondente. Retire as tampas metálicas e aspirar o meio residual dos pratos.
    9. A fim de normalizar os valores de proteínas secretadas obtidas em diferentes experiências, quer extrair ADN (normalização por conteúdo de DNA genómico para miotubos 19), ou adicionar 1 ml de tampão de lise de ácido-etanol (normalização pelo teor total de hormona de células das ilhotas 18) para o pratos.

5. medição dos níveis de Ilhota hormonais e Myokine na saídaMédio Obtido por perifusão contínua de células endócrinas humanas primárias

  1. Insulina
    1. Quantificar os níveis basais de insulina no meio de saída de pontos de tempo recolhidos utilizando um ensaio imunoabsorvente (ELISA) kit ligado a enzima insulina humana seguindo as instruções do fabricante.
    2. Normalizar os dados para o volume absoluto do meio recolhido em cada poço e para o teor total de insulina, extraída a partir de células tratadas com ácido-etanol, no final da experiência (passo 4.1.9) 18.
  2. A interleucina-6 (IL-6)
    1. Quantificar basal IL-6 níveis no meio de saída de tempos em pontos coletados usando um IL-6 kit ELISA humana seguindo as instruções do fabricante.
    2. Normalizar os dados para o volume absoluto do meio recolhido em cada poço e para o conteúdo de ADN genómico no final da experiência (passo 4.1.9).

6. Análise de Conjunto de Dados circadianos para Bioluminescência e hormonal Secreção Profiles

  1. Análise bioluminescência
    1. Analisar o perfil de bioluminescência usando o software fornecido 19.
  2. A análise do ciclo JTK
    1. Analisar os perfis de secreção de hormônios e resultados de gravação bioluminescência usando o algoritmo JTK_CYCLE 32.
    2. Definir a largura período circadiano a 20-24 h.
      NOTA: Se as condições experimentais foram registados em paralelo, uma análise estatística emparelhado pode ser realizado para comparar as experiências.
  3. Análise CosinorJ
    1. Alternativamente, analisar a secreção hormonal e perfis bioluminescência circadiano usando o software CosinorJ 28.

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Resultados

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Avaliação da Ilhota Hormone Secreção com Parallel circadiano Bioluminescência Gravar a partir de células Perifused ilhéus humanos

Depois de fornecer uma primeira caracterização molecular do relógio circadiano, operativo em células das ilhotas humanos 16, que teve como objetivo estudar o impacto da interrupção do relógio sobre a função das ilhotas e transcrição 18. Montamos um protocolo eficiente siClo...

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Discussão

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As configurações experimentais aqui descritos são compostos de fornecimento de lentivírus de repórteres bioluminescência circadianos em células primárias humanas cultivadas, seguido por sincronização subsequente in vitro e gravação contínua de bioluminescência durante vários dias, e a análise paralela de secreção da hormona pelas mesmas células. Eles representam uma abordagem eficiente para explorar os mecanismos moleculares e aspectos funcionais dos relógios circadianos em células primárias humanas.

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somos gratos aos nossos colegas da Universidade de Genebra: Jacques Philippe para comentários construtivos sobre este trabalho, Ueli Schibler para ajuda inestimável com o desenvolvimento do sistema perifusão e de inspiração científica, André Liani para o ter concebido o projeto, fabricação e comissionamento de o sistema de perfusão, empresa Lesa-Technology LTD para a assistência no sistema perifusão e desenvolvimento de software Drip-biolumicorder, George Severi para assistência com os experimentos perifusão, Ursula Loizides-Mangold pela leitura crítica do manuscrito, e Anne-Marie Makhlouf para preparações lentivírus ; de Etienne Lefai, Stéphanie Chanon e Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para a preparação de mioblastos primários humanos; e Domenico Bosco e Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Hospital Universitário de Genebra) para a prestação de ilhotas humanas. Este trabalho foi financiado pelo No. Swiss National Science Foundation Grant 31003A_146475 / 1, o Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation pour la Recherche Romande sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fundação Ernst et Lucie Schmidheiny e Sociedade Acadêmica de Genebra (CD).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tripsina-EDTAInvitrogen25300-054Para digestão de biópsia muscular
DPBS sem cálcio sem magnésioInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021Para cultura de mioblastos
FBSInvitrogen10270Suplemento ao meio de cultura
Penicilina-EstreptomicinaSigmaP0781-100Suplemento ao meio de cultura
GentamicinaAxônioA1492.0001Suplemento ao meio de cultura
FungizoneInvitrogen15290-026Anfotericina B, suplemento ao meio de cultura
DMEM 1g/L glicose + Na piruvato + glutamax Invitrogen21885-025Para cultura de miotubos
DMEM 1g/L glicose -Na Piruvato - glutamaxInvitrogen11880-028Meio de gravação para LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-alanil-L-glutamina dipeptídeo, suplemento ao meio de gravação
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Solução de desprendimento de células, para dissociação de células de ilhotas
CMRLGibco21530-027 Meio decultura para células de ilhotas
Pyruvate de SódioGibco11360-039Suplemento para meio de cultura
15 ml Tubo Cônico de Polipropileno de Alta ClarezaFalcon352096
F75 frascoBD Falcon353136
placa de Petri de 3,5 cm BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Ativador de adenilil ciclase, usado para sincronização
LuciferinaProlume LTD260150Suplemento para o meio de gravação
OptiMEM Invitrogen51985-026Meio Essencial Mínimo (MEM) sem soro usado para transfecção de células de ilhotas humanas
Reagente Lipofectamine RNAiMAX ReagenteInvitrogen13778-150Reagente de transfecção
HiPerFectQiagen301705Reagente de transfecção
ON-TARGET mais siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET mais siRNA #1 não direcionado (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & Kit de lenços de papelQiagen69504Para extração de DNA de miotubos
RNeasy Plus Mini kit Qiagen74104Para extração de RNA de miotubos
QIAshredder Qiagen79654Para extração de RNA de miotubos
2 ml tubos coletoresAxygen311-10-051Para coletar o meio com a perfusão
Placa de cultura de tecidos, 6 PoçosBD Falcon 353046Para coletar o meio com o kit de perifusão
RNeasy Plus Micro Qiagen74034Para extração de RNA de ilhotas
Kit ELISA instantâneo IL-6 humano eBioscience88-7066-22
Kit de Insulina Humana MercodiaMercodia10-1113-01
Ácido clorídrico, min,37%,a.a.Acros organics124630010Usado para a preparação de tampão de lise (375 ml de etanol + 7,5% HCl + 117,5% H2O)
Etanol (>99,8%)Fluka Analytical02860-1LUsado para preparação de tampão de lise (375 ml de etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O)
Ilhotas humanas para laboratórios de pesquisaProdo
NomeCompanyNúmero de catálogoComentários
Equipamento:
CentrifugeHeraeusMegafuge 1.0R
Banho-mariaVWR1112A  em 37 & Capuz
de cultura C TissuMais rápido SafeFastElite
TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 a 37 ° C, sem água devido à instalação do LumiCycle
Incubadora de culturas TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 a 37 ° C, sem água devido à instalação do LumiCycle
Incubadora de cultura TissuThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 a 37 ° C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010Para agitação da mistura de siRNA
LumiCycleActimetrics
Software LumiCycleSoftware Actimetrics
CosinorJEPFLDisponível gratuitamente em: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHSoftware de controle que controla o tempo da chave automatizada
Incubadora de cultura

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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