The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

Annika Weigand; Justus P. Beier; Andreas Arkudas; Majida Al-Abboodi; Elias Polykandriotis; Raymund E. Horch; Anja M. Boos

doi:10.3791/54676

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Artigo de método

The Loop arteriovenosa (AV) em um modelo animal pequeno para estudar angiogénese e Engenharia de tecido vascularizado

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DOI:

10.3791/54676

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2 de novembro de 2016

Annika Weigand¹ , Justus P. Beier¹ , Andreas Arkudas¹ , Majida Al-Abboodi¹^,² , Elias Polykandriotis³ , Raymund E. Horch¹ , Anja M. Boos¹

¹Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), ²Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, ³Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

Neste artigo

Resumo

Descrevemos uma abordagem microcirúrgico para a geração de um circuito arteriovenoso (AV) como um modelo para analisar a vascularização in vivo num ambiente isolado e bem caracterizado. Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a engenharia axial vascularizado e tecidos transplantáveis.

Resumo

Uma rede de vasos sanguíneos funcional é um pré-requisito para a sobrevivência e crescimento de quase todos os tecidos e órgãos do corpo humano. Além disso, em situações patológicas como o câncer, a vascularização desempenha um papel preponderante na progressão da doença. Consequentemente, há uma forte necessidade de um modelo in vivo padronizado e bem caracterizado para elucidar os mecanismos de neovascularização e desenvolver diferentes abordagens de vascularização para engenharia de tecidos e medicina regenerativa.

Descrevemos uma abordagem microcirúrgica para um modelo de pequeno animal para indução de um eixo vascular que consiste em uma veia e uma artéria que são anastomosadas a uma alça arteriovenosa (AV). A alça AV é transferida para uma câmara de implantação fechada para criar um microambiente isolado in vivo, que é conectado ao organismo vivo apenas por meio do eixo vascular. Usando imagens 3D (ressonância magnética, micro-CT) e imunohistologia, a vasculatura em crescimento pode ser visualizada ao longo do tempo. Ao implantar diferentes células, fatores de crescimento e matrizes, sua função na formação da rede de vasos sanguíneos pode ser analisada sem quaisquer influências perturbadoras do ambiente em um ambiente bem controlável.

Além dos estudos de angiogênese e antiangiogênese, o modelo de alça AV também é perfeitamente adequado para a engenharia de tecidos vascularizados. Após um certo tempo de pré-vascularização, os tecidos gerados podem ser transplantados para o local do defeito e conectados microcirurgicamente aos vasos locais, garantindo assim o suprimento sanguíneo imediato e a integração do tecido projetado. Ao variar as matrizes, células, fatores de crescimento e arquitetura da câmara, é possível gerar vários tecidos, que podem ser adaptados às necessidades individuais do paciente.

Introdução

A maior parte dos tecidos e órgãos no corpo humano são dependentes de uma rede de vasos sanguíneos funcionais que fornece nutrientes, trocas gasosas e remove os resíduos. Mau funcionamento deste sistema causado por problemas vasculares locais ou sistémicas pode conduzir a uma variedade de doenças graves. Além disso, nas áreas de pesquisa, como a engenharia de tecidos ou medicina regenerativa, uma rede de vasos sanguíneos funcional dentro tecidos geradas artificialmente ou órgãos transplantados é indispensável para a aplicação clínica de sucesso.

Durante décadas, os investigadores têm investigado os mecanismos exatos envolvidos na vasculatura crescente para ganhar uma compreensão mais profunda situações patológicas a fim de encontrar novas intervenções terapêuticas e proporcionar uma melhor prevenção das doenças vasculares. No primeiro passo, os processos básicos, tais como as interacções célula-célula ou o efeito das moléculas sobre as células do sistema vascular são geralmente investigados in vitro por 2D ou 3Dexperimentos. modelos 2D tradicionais são fáceis de executar, estão bem estabelecidos e têm contribuído grandemente para uma melhor compreensão destes processos. Pela primeira vez em 1980, Folkman et ai. relataram na semeadura angiogénese in vitro de células endoteliais capilares em placas revestidas com gelatina ^1. Isto imediatamente deu lugar a publicação de uma multiplicidade de outras experiências de angiogénese 2D em tubo de ensaio de formação de célula endotelial ^2, ³ ensaio de migração e a co-cultura de diferentes tipos de células ^4, bem como outros. Estes ensaios são usadas ainda hoje e aceito como padrão métodos in vitro.

No entanto, este arranjo experimental nem sempre é apropriado para o estudo do comportamento das células in vivo uma vez que a maioria dos tipos de células necessitam de um ambiente 3D para formar estruturas de tecido fisiológicas relevantes ^5. Pode ser mostrado que a arquitectura da matriz 3D é decisivo para morphogenesi capilars ⁶ e que as interações celulares extra-matriz celular (ECM) e de cultura 3D condições regulam fatores importantes envolvidos na angiogénese tumoral ^7. A matriz 3D oferece entradas mecânicas complexas, pode ligar proteínas efetoras e estabelecer escala tecidos gradientes de concentração de solutos. Além disso, considera-se necessário, a fim de imitar morfogenética vivo e as etapas de remodelação em tecidos complexos ^5. Nestes sistemas, tanto a angiogénese e vasculogénese pode ser estudada. Enquanto angiogênese descreve o surgimento de vasos capilares a partir de vasos preexistentes sangue ^8, vasculogênese refere-se à formação de novo de vasos sanguíneos através de células endoteliais ou seus progenitores ^9,10. A maturação dos vasos é descrito num processo chamado de "arteriogénese" via do recrutamento das células musculares lisas ^11. A angiogênico típico modelo in vitro é o surgimento de células endoteliais da monocamada existentes semeadas como uma monocamada em superfícies de gel, na superfície das microesferas incorporados dentro de um gel ou através da construção de esferóides de células endoteliais ^12. Em modelos vasculogénicos células endoteliais individuais são aprisionadas num gel 3D. Eles interagem com as células endoteliais adjacentes para formar estruturas e redes vasculares de novo, tipicamente em combinação com células de suporte ^12.

No entanto, mesmo em 3D complexos em modelos in vitro não reproduzem em ambientes vivo dado completamente a multidão de célula-célula e célula-ECM interações ^13. Substâncias com alta atividade in vitro não mostram automaticamente os mesmos efeitos in vivo e vice-versa ^14. Para uma análise abrangente da vascularização processa há uma necessidade urgente de desenvolver modelos in vivo que simulam melhor a situação no corpo. Uma grande variedade de ensaios in vivo da angiogénese são descritos na literatura, incluindo oensaio de pintainho membrana corioalantóica (CAM), o modelo de peixe-zebra, o ensaio de angiogénese da córnea, o modelo de saco de ar dorsal, a câmara dorsal dobra cutânea, os modelos de tumores subcutâneos ^14. No entanto, estes ensaios são frequentemente associados com limitações, tais como alterações morfológicas rápidas, problemas em novos capilares a partir de distintivos já existentes no ensaio da CAM, ou o espaço limitado no ensaio de angiogénese da córnea ^15. Além disso, os sistemas de não-mamíferos são utilizados (por exemplo., O modelo de peixe-zebra ^16), o que leva a problemas em xenotransplantes ^17. No modelo de tumor subcutâneo, angiogénese proveniente apenas do tumor em si não pode ser analisado uma vez que o tecido adjacente contribui significativamente para o processo de vascularização. Além disso, o tecido circundante pode ter um papel decisivo na formação do microambiente do tumor ^18.

Não só para estudar angiogénese ou vasculogénese há uma forte need para um padronizado e bem caracterizada no modelo vivo, mas também para estudar diferentes estratégias de vascularização em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Hoje, a geração de órgãos ou tecidos artificiais complexas é possível tanto in vitro como in vivo. Bioprinting 3D proporciona uma técnica de fabricação sob demanda para a geração 3D complexos tecidos vivos funcional ^19. Além disso, biorreactores pode ser usada para a geração de tecidos ^{de 20} ou até mesmo o próprio corpo pode ser usada como biorreactor de ^21. No entanto, a principal barreira para a aplicação com sucesso de tecidos gerados artificialmente é a falta de vascularização dentro das construções de engenharia. conexão imediata com a vasculatura do hospedeiro após o transplante é um importante pré-requisito para a sobrevivência, especialmente no caso de tecidos ou órgãos artificiais de grande escala.

Diferente in vitro ou in estratégias prevascularization vivo foram develvolvido para estabelecer uma microvasculatura funcional em construções antes da implantação ^22. A implantação de uma estrutura de suporte com capilares in vitro engenharia pré-formados sobre a pele dorsal de ratos levou a um rápido anastomose da vasculatura ratinhos dentro de um dia ^23. Em contraste, uma co-cultura de esferóides que consiste em células estaminais mesenquimais humanas e células endoteliais da veia umbilical humana montados numa rede tridimensional prevascular desenvolvido após implantação in vivo. No entanto, a anastomose com a vasculatura de acolhimento ²⁴ foi limitado. Acima de tudo, em defeitos mal vascularizados, tais como áreas de necrose ou irradiados, este assim chamado vascularização extrínsecos - o crescimento de vasos da área circundante para o andaime - muitas vezes falha. Vascularização intrínseca, por outro lado, baseia-se num eixo vascular como fonte de novos capilares brotam para o andaime ^25. Usando a abordagem vascularização axial, A engenharia de tecidos podem ser transplantadas com o seu eixo vasculares e ligado aos navios locais no local destinatário. Imediatamente após o transplante, o tecido está adequadamente apoiado pelos oxigênio e nutrientes, o que cria as condições adequadas para a melhor integração possível.

Devido à disponibilidade limitada de modelos para investigar a angiogênese in vivo e em reconhecimento da importância crescente de geração de tecido vascularizado axial, desenvolvemos a abordagem microcirúrgica de Erol e Spira ainda mais para gerar um loop arteriovenosa (AV) no modelo animal ^26. A utilização de uma câmara de implante completamente fechado torna este método muito bem adaptado para estudar a formação de vasos sanguíneos sob "controlado", bem caracterizadas as condições in vivo (Figura 1). Este modelo não só é útil para a investigação de angiogênese, mas também é perfeitamente adaptado para a vascularização axial de andaimes para Engin tecidofins nharia.