Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks

Resumo

O dano direcionado ao DNA pode ser alcançado amarrando um agente prejudicial ao DNA a um oligonucleotídeo formador de triplex (TFO). O uso de TFOs modificados, a associação de proteínas específicas de danos ao DNA e a modificação da topologia do DNA podem ser estudadas em células humanas pela utilização de ensaios de imunoprecipitação de cromatina modificada e ensaios de superenrolamento de DNA aqui descritos.

Resumo

caixa de grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1) a proteína é uma proteína não-histona arquitectónico que está envolvido na regulação de muitas funções importantes no genoma, tais como transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN. HMGB1 se liga ao DNA estruturalmente distorcida com maior afinidade do que a B-ADN canónica. Por exemplo, descobrimos que HMGB1 se liga ao DNA intercadeias ligações cruzadas (CIET), que covalentemente ligam as duas cadeias do DNA, causar distorção da hélice e, se deixada sem conserto pode causar morte celular. Devido ao seu potencial citotóxico, vários agentes indutores de ICL são actualmente utilizados como agentes quimioterapêuticos em clínica. Enquanto os agentes ICL-formando mostrar preferências por certas sequências de bases (por exemplo, 5'-TA-3 'é o local de reticulação preferido para psoraleno), que em grande parte induz danos no ADN de uma forma indiscriminada. No entanto, por acoplamento covalente do agente de indução de ICL a um oligonucleótido de formação de triplex (TFO), que se liga a DNA de uma sequência-específicaforma, o dano ao DNA alvo pode ser alcançado. Aqui, nós utilizamos um TFO covalentemente conjugado no "fim a um 4'-hidroximetil-4,5 'a 5 (HMT) psoraleno, 8-trimetilpsoraleno para gerar um ICL específica do local num plasmídeo repórter-mutação a ser usado como uma ferramenta para estudar a modificação de arquitectura, processamento, e reparação das lesões do ADN complexas por HMGB1 em células humanas. Descrevemos técnicas experimentais para preparar ICLs TFO dirigidos em plasmídeos repórter, e para interrogar a associação de HMGB1 com os ICLs TFO dirigidos em um contexto celular usando ensaios cromatina imunoprecipitação. Além disso, descreve-se ensaios de super-enrolamento de ADN para avaliar a alteração de arquitectura específica do ADN danificado por medição da quantidade de voltas superhelical introduzidas no plasmídeo psoraleno-reticulada por HMGB1. Estas técnicas podem ser usadas para estudar os papéis de outras proteínas envolvidas no processamento e reparação de ICLs TFO-dirigida ou outro dano do DNA alvo em qualquer linha celular de interesse.

Introdução

Triplex-formando oligonucleotídeos (TFO) DNA ligam duplex de uma forma específica de sequência por meio de ligação de Hoogsteen-hidrogênio para formar estruturas ^1-5 triple-helicoidais. Tecnologia triplex foi utilizado para interrogar uma variedade de mecanismos biomoleculares, tais como a transcrição, reparação de danos do ADN, e o gene de segmentação (revisto em referências ^6-8). TFO têm sido amplamente utilizados para induzir dano local específico em plasmídeos repórter ^9,10. O nosso laboratório e outros já anteriormente utilizado um TFO, AG30, presa a uma molécula de psoraleno para induzir reticulações intercadeias de ADN específicas do local (ICLs) no gene supF no plasmídeo pSupFG1 ^5,10-12. ICLs são altamente citotóxica como estas lesões covalente reticular as duas cadeias de ADN e, se deixada sem conserto, pode bloquear a transcrição de genes e impedem a maquinaria de replicação do DNA ^13,14. Devido ao seu potencial citotóxico, agentes indutores de ICL foram usados ​​como drogas quimioterapêuticas no tratamentode câncer e outras doenças ^15. No entanto, o processamento e reparação de ICLs nas células humanas não é bem compreendido. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no processamento de ICLs em células humanas pode ajudar a melhorar a eficácia dos regimes quimioterapêuticos baseados em ICL. ICLs-induzidas TFO e seus intermediários reparação têm o potencial de causar distorções estruturais importantes para a hélice do ADN. Tais distorções são alvos prováveis para proteínas de arquitectura, que se ligam ao ADN distorcido com maior afinidade do que a B-forma canónica de ADN duplex ^16-20. Aqui, estudou-se a associação de uma proteína de arquitectura altamente abundante, HMGB1 com ICLs em células humanas por meio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios em plasmídeos de psoraleno-reticulado e identificado um papel para HMGB1 na modulação da topologia do ADN plasmídeo psoraleno-reticulado em humanos Os lisados ​​celulares de cancro.

HMGB1 é altamente abundante e ubiquamente expresso não-Hisproteína arquitectónico tom que se liga ao DNA danificado e substratos de DNA, alternativamente, estruturados com maior afinidade do que o DNA-forma canónica B ^17-20. HMGB1 está envolvido em vários processos metabólicos de ADN, tais como a transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN ^16,21-23. Demonstrámos previamente que se liga a HMGB1 ICLs TFO-dirigida in vitro com alta afinidade ^20. Além disso, demonstrámos que a falta de HMGB1 aumentou o processamento mutagénico de ICLs TFO-HMGB1 dirigidos e identificado como uma reparação de excisão de nucleótidos (ILM) de co-factor de ^23,24. Recentemente, verificou-se que está associado com HMGB1 ICLs TFO-dirigidas em células humanas e o seu recrutamento de tais lesões é dependente da proteína NER, XPA ^16. Superenrolamento negativo do ADN tem mostrado promover a remoção eficiente das lesões do ADN por NER ^25, e verificou-se que a HMGB1 induz superenrolamento negativo preferencialmente em TFO dirigidos Plas-ICL contendomeados substratos (em relação a substratos não danificado, plasmídeos) ^16, proporcionando uma melhor compreensão do papel potencial (s) de HMGB1 como um co-factor NER. O processamento de ICLs não é totalmente compreendido, em células humanas; Assim, as técnicas e ensaios desenvolvidos com base em ferramentas moleculares aqui descritos podem levar à identificação de proteínas adicionais envolvidos na reparação de ICL, que por sua vez podem servir como alvos farmacológicos que podem ser exploradas para melhorar a eficácia dos regimes de quimioterapia do cancro.

Aqui, uma abordagem eficaz para avaliar a eficiência de formação de TFO-dirigida ICL em DNA de plasmídeo por electroforese em gel desnaturante de agarose foi discutido. Além disso, utilizando os plasmídeos que contêm os ICLs TFO-dirigidas, técnicas para determinar a associação de HMGB1 com os plasmídeos de ICL-danificados num contexto celular utilizando ensaios ChIP modificados foram descritos. Além disso, um método fácil para estudar as modificações introduzidas por Th topológicose HMGB1 proteína de arquitectura, especificamente sobre substratos plasmídeo ICL-danificadas em lisados ​​de células humanas foi determinada realizando ensaios de super-enrolamento através de electroforese em gel de agarose bidimensional. As técnicas descritas podem ser usadas para ajudar a compreender o envolvimento da reparação do ADN e proteínas de arquitectura no tratamento de danos no ADN alvo em plasmídeos em células humanas.

Descrevemos protocolos pormenorizados para a formação de ICLs psoraleno específicas do local dirigidas no TFO-DNA do plasmídeo e subsequente ChIP plasmídeo super-enrolamento e ensaios para identificar proteínas que se associam com as lesões, e proteínas que alteram a topologia do ADN, respectivamente. Estes ensaios podem ser modificados para realizar com outros agentes prejudiciais de ADN, TFO, substratos de plasmídeos, e as linhas de células de mamífero de interesse. Na verdade, temos mostrado que há pelo menos um potencial de afinidade única e alta local TFO de ligação dentro de cada gene anotada no genoma humano ^26. Comocada vez, para maior clareza, que estas técnicas descritas para a utilização específica de um TFO psoraleno-conjugado (pAG30) num plasmídeo repórter-mutação específica (pSupFG1) em células humanas U2OS que temos utilizado em Mukherjee & Vasquez, 2016 ^16.

Protocolo

1. Preparação de ICLs TFO-dirigidas no plasmídeo Substratos

1. Incubar quantidades equimolares de pSupFG1 ^10,11 plasmídeo de DNA (DNA de plasmídeo de 5 ug é um bom ponto de partida) com psoraleno-AG30 conjugado TFO em 8 mL de tampão de ligação triplex [50% de glicerol, Tris 10 mM (pH 7,6), 10 mM de MgCl _2] e dH ₂ o para um volume final de 40 ul num tubo de âmbar. Misture bem, pipetando para cima e para baixo. Incubar a reacção a 37 ° C banho de água durante 12 h.
2. Aquecer a lâmpada UVA para garantir a saída de potência total. Coloque a reação triplex em filme de parafina, e coloque o filme de parafina no gelo sob a (nM 365) lâmpada UVA. Colocar um filtro de Mylar entre a lâmpada e a reação.
3. UVA irradiar para uma dose total de 1,8 J / cm ^2. Armazenar as amostras a 4 ° C para posterior utilização.
   Cuidado: Usar óculos de protecção adequado e roupas com irradiação UVA.
4. Linearizar 200 ng do plasmídeo preparado acima com a restriction enzima Eco R1 em um volume total de 20 ul usando tampão fornecido pelo fabricante de 10x. Calor desnaturar a enzima durante 20 min a 65 ° C. Rodar as amostras durante 10 min a 10000 xg e armazenar a 4 ° C.
5. Prepare 50x tampão alcalino [1,5 M de NaOH, 50 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)]. Adicionar 0,5 mg de agarose com 50 ml de dH ₂ O. Ebulição para dissolver a agarose e colocá-lo em um banho de água a 50 ° C.
6. Depois de a temperatura da agarose é dissolvido até 50 ° C, adicionar 1 ml de tampão 50x alcalina, e misturá-lo em seguida, verter o gel em placa de gel. Permitir que o tempo para o gel solidificar à temperatura ambiente antes de usar.
7. Adicionar 4 ul de EDTA 0,5 M para os 20 ul de amostra de ADN linearizado e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
8. Adicionar tampão de carregamento de gel alcalino 6x (NaOH a 300 mM, EDTA 6 mM, 18% (w / v) de polissacárido de elevado peso molecular, 0,06% de verde de bromocresol em _dH2O) para as amostras e para uma escada de DNA de 1 kb.
   NOTA: É importante usar tampão de carregamento de gel alcalino 6x, por favor veja a discussão.
9. amostras carregar no gel na câmara fria e executado durante a noite em tampão alcalino 1x (12-16 h) em 3,2 volts por cm. Depois de as amostras terem entrado no gel, colocar uma placa de vidro no topo do gel para evitar que ele flutua.
10. Neutraliza-se a amostras embebendo o gel em tampão de neutralização [1 M de Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 1,5 M, acetato de sódio 3 M (pH 5,2)] durante 45 minutos à temperatura ambiente.
11. Corar o gel para o ADN com 4 ul de 1% de brometo de etídio (EtBr) em 50 ml de água durante 1 h à temperatura ambiente. Destain com água durante 15 min. Visualizar o DNA utilizando um sistema de imagem.
    Cuidado: EtBr é um potente agente mutagénico e pode ser absorvida através da pele. Evitar o contacto directo com EtBr.

2. Transfecção e imunoprecipitação de TFO dirigidos ICL-contendo plasmídeos em células humanas

1. Placa de 400.000 células de mamífero (por exemplo, S U2OScélulas steosarcoma) por milímetro prato 60 em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) sem antibióticos 24 h antes da transfecção. Incubar as células durante a noite a 37 ° C com 5% de CO _2.
2. Antes da transfecção, o meio de crescimento quente e salino tamponado com fosfato (PBS) a 37 ° C num banho de água. Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente.
3. Incubar 30 ul de reagente de transfecção com 500 ul de meio de crescimento 1x (mix 1) e 2 ug de TFO dirigidos ICL contendo plasmídeos em 500 ul de 1x meio de crescimento (mistura 2), em separado 14 mL de tubos de fundo redondo durante 10 min a temperatura do quarto.
4. Adicionar mix 1 para misturar 2, misture bem por pipetagem cima e para baixo. Incubar durante 25-30 minutos à temperatura ambiente.
5. Lave as células duas vezes com PBS quente. Adicionar a mistura de transfecção de uma forma gota a gota, distribuindo uniformemente por toda a placa de células. Adicionar 1 ml de meio de crescimento para a placa e levar o volume final de 2 ml. misture nósll. Colocar as placas de cultura na incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 4 horas.
6. Substituir os meios de comunicação com os meios 3 mL de crescimento suplementado com 10% de FBS, e incubar ainda mais durante 16 horas. Não use antibióticos.
7. Tratar as células com 80 uL de 37% de formaldeído por placa fresca para uma concentração final de aproximadamente 1% e incubar durante 10 min à temperatura ambiente na ausência de luz.
   Atenção: O formaldeído é tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. exposição ao formaldeído pode causar danos à pele, olhos e trato respiratório.
8. Extingue-se a reticulação de formaldeído por adição de 300 ul de glicina arrefecida (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) por placa e incubar durante 5 min. Remover os meios e lava-se duas vezes com PBS arrefecido, e em seguida, recolher as células por raspagem em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) em PBS num tubo de microcentrífuga. Manter as amostras em gelo em todos os momentos.
9. Prepare os sedimentos celulares por centrifugação a 4 ° C durante 5 minutos, umat 13.400 xg utilizando uma mesa refrigerada centrífuga. Pipete para fora o sobrenadante e colocar o agregado de células em gelo.
10. Homogeneamente ressuspender o pellet em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) de tampão A (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar em gelo durante 10 min. Misture ocasionalmente invertendo o tubo. células de pellets como antes (veja o passo 2.9 acima).
11. Homogeneamente ressuspender o pellet em 1 ml de solução arrefecida (4 ° C) Tampão B (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar em gelo durante 10 min, com mistura ocasional por inversão. células por centrifugação como anteriormente (veja o passo 2.9 acima).
12. Ressuspender as células de novo em 200 ul de tampão B. refrigeradas Adicionar 2 mL de Micrococo nuclease (MNase) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Misture reacção, ocasionalmente, sacudindo o tubo. Parar a reacção de MNase colocando o tubo em gelo e adicionando EDTA 40 mM. células de pellets como antes (veja o passo 2.9 acima).
13. Ressuspender as células em 100 immunopr cromatina ul 1xecipitation tampão (ChIP) tampão (fornecidos em kits disponíveis comercialmente), suplementado com um cocktail inibidor de protease.
14. Colocar as células ressuspensas em um tubo de microcentrífuga de parede fina. Sonicar as amostras por flutuante-los no banho sonicador de água durante 20 segundos seguido por 20 segundos de incubação sobre gelo. Repita os passos sonicação 9 vezes para gerar ~ 800-1200 fragmentos pb.
    1. A 20 ul das amostras sonicadas adicionar 3 mL de NaCl 5 M e 1 ul de ARNase A: misturar bem por agitação em vórtex e incubar a 37 ° C durante 30 min. Subsequentemente, adiciona-se 2 ul de proteinase K e incubar durante 2 horas a 65 ° C. Purifica-se as amostras utilizando um kit de purificação de PCR. Executar amostras em 1% de gel de agarose e visualização com EtBr.
       NOTA: A intensidade máxima do DNA resultante deve ser igual ou abaixo de 1.000 pb.
15. Em três tubos separados, adicionar 30 ul de lisado num tubo siliconizado pré-refrigerada e, em seguida, adicionar 70 ul de tampão 1x ChIP gelada com inibidores da protease adicionada. Adicione 1 μg de anti-imunoglobulina G (IgG), anti-histona H3 (como um controlo positivo), ou anticorpos anti-HMGB1 para os respectivos tubos. Incubar durante a noite em uma sala fria com rotação contínua.
16. grânulos Ressuspenda proteína G homogeneamente na sala fria. Adicione 4 mL de esferas de proteína G por tubo e incubar por mais 2-4 horas na sala fria com rotação.
17. Usando uma cremalheira magnética, sedimentar as pérolas e remover o sobrenadante. Adicionar 200 ul de tampão 1x ChIP misturado com cocktail de inibidores de protease para o sedimento e lava-se durante 5 min na câmara fria com rotação. Repita duas vezes lavar.
18. Execute uma lavagem adicional com elevado teor de sal tampão 1x chip (contendo NaCl 70 mM).
19. Ressuspender as peletes com tampão de eluição de 160 ul (fornecidos em kits disponíveis comercialmente) e incubar a 37 ° C com rotação durante 30 min.
20. Sedimentar as pérolas e recolher o sobrenadante num tubo fresco. Adicionar 6 ul de NaCl 5 M e 2 ul de proteinase K, e incubar durante a noite a 65° C.
21. Purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de produto de PCR e elui-se o ADN utilizando 50 uL de dH ₂ O.
22. Executar PCR ¹⁶ reações que utilizam conjuntos de primers para a região (s) de interesse, e resolver os produtos em um gel de agarose a 1% corado com EtBr.

3. supercoiling Ensaio e 2-dimensional Agarose Gel Eletroforese

1. Preparar DNA de tampão de síntese de reparação (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; KCl 70 mM; mM de MgCl 7,4 _2; DTT 0,9 mM; EDTA 0,4 mM; ATP 2 mM, 20 ^ M de dNTP, 3,4% de glicerol e 18 albumina de soro ug bovina) . Armazenar a -80 ° C. Thaw no gelo e antes da utilização adicionar fosfato 40 mM e 2,5 g de creatina fosfoquinase.
2. Prepare 10x tampão supercoiling [Tris 500 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM, MgCl 25 mM _2, EDTA 1 mM], e armazenar a temperatura ambiente.
3. Linearizar 300 ng de ADN de plasmídeo super-enrolado pSupFG1 utilizando completamente um ul Vaccinia topoisomerase I (5-15 U / ul) com 1xtampão de super-enrolamento numa reacção de 10 ul. Incubar a mistura a 37 ° C durante 1 h.
4. Descongelar extrato livre de células HeLa ²⁴ no gelo. Para os plasmídeos completamente relaxado, adicionar 25 ul extrato livre de células HeLa e tampão de síntese de reparação do ADN. Misture bem. Adicionar 1 ml adicionais de Vaccinia topoisomerase I à mistura, e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
5. Terminar as reacções através da adição de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (1% de concentração final) e proteinase K (0,25 mg / ml de concentração final). Incubar a 65 ° C durante 2 h.
6. Transmitir um gel de agarose a 1% com 1x Tris Borato EDTA tampão (TBE). Adicionar ADN corante de carga e carregar as reacções directamente no gel, pelo menos, 4 pistas separadas. Executar o gel durante 8-10 h a 2 V / cm em TBE 1x (dimensão 1) à temperatura ambiente para resolver os topoisomers.
   NOTA: Prepara-se uma solução de reserva 5x TBE em 1 L de _dH2O, adicionando 54 g de base Tris. 27,5 g de ácido bórico e 20 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8,0).
7. Prepare 2 L de 1xTBE com 3 ug / ml de cloroquina-fosfato. Embeber o gel em 200 ml desta solução durante 20 min. Cubra a bandeja de gel com papel alumínio.
8. Para o gel à electroforese na segunda dimensão, transformar o gel de 90 ° no sentido horário e executá-lo por 4-6 h a 2 V / cm em cloroquina contendo 1 x TBE para resolver os supercoils positivos e negativos.
9. Manchar o gel com EtBr por 1 hora em uma cadeira de balanço. Destain o gel com dH ₂ O durante 15 min e subsequentemente visualizar a distribuição térmica dos topoisomers usando um gerador de imagens.

Resultados

Formação do ICL TFO-dirigida é crítico para os ensaios de plasmídeo baseado, que são utilizados para interrogar as funções das proteínas de arquitectura do processamento de ICL, em células humanas. Electroforese em gel desnaturante de agarose é uma maneira fácil para determinar a eficiência da formação de ICL TFO-dirigida. Os plasmídeos que albergam ICLs TFO dirigidos migram com uma mobilidade mais lenta através da matriz de gel de agarose (Figura 1A, pista 3) quando com...

Discussão

A formação eficiente de ICLs TFO-dirigida é dependente de dois factores fundamentais: Em primeiro lugar, os componentes do tampão adequado (por exemplo, MgCl ₂₎ e o tempo de incubação do TFO com o seu substrato de ADN alvo (dependente da afinidade de ligação do TFO ao seu alvo duplex, e as concentrações utilizadas); e segundo, a irradiação a dose apropriada de radiação UVA (365 nm) para formar reticulações de psoraleno eficientemente. formação de triplex ideal pode ser conseguido através da utilizaçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Pedido personalizado	HPLC (ou gel) purificado
Kit IP de cromatina enzimática simples ChIP	Cell signaling Inc.	9003	O protocolo sugerido pelo fabricante é otimizado para IP de cromatina e não para IP de plasmídeo. Os anticorpos IgG e H3 de controle, bem como as esferas de proteína G e a nuclease microcócica, são fornecidos pelo fabricante.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 anticorpo	Abcam	Ab18256
Wizard Gel e kit de limpeza de PCR	Promega	A9281
Sal de cloroquina-difosfato	Sigma	C6628-50G	Para eletroforese em gel de agarose bidimensional
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
Reagente de transfecção GenePORTER	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Lâmpada ultravioleta de onda longa Blak-Ray	Upland, CA	B 100 AP	Lâmpada UVA
Bioprocessador multifuncional EpiSonic 1100	Epigentek	EQC-1100	Sonicador de banho-maria
Filtro Mylar	GE Healthcare Life Sciences
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ sistema	de imagem de DNA
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Usado para reticulação
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Meios de cultura celular
PBS	ThermoFisher	70013073	Cultura celular
Tripsina-EDTA	ThermoFisher	25200056	Cultura celular
Bromocresol verde	Sigma-Aldrich	114-359	Corante de carregamento de DNA
Tubos siliconizados	Fisher Scientific	02-681-320	Tubo de microfuga de baixa retenção
Base Tris Fisher	Scientific	BP152-1
Ácido bórico	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Fotômetro	InternationalLight Technologies	ILT1400-A Medição de	dose UVA
Linhas celulares
Osteossarcoma U2OS humano	ATCC	ATCC HTB-96	Cultivado de acordo com o fornecedor recomendação do
Adenocarcinoma cervical humano HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultivado de acordo com o fornecedor s recomendação
Primer direto proximal	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Primer reverso proximal	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Primer direto distal	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Primer reverso distal	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc