Ferramentas para estudar o papel da HMGB1 Protein Architectural no processamento de Helix distorcendo, DNA Site-specific intercadeias Crosslinks

Resumo

O dano direcionado ao DNA pode ser alcançado amarrando um agente prejudicial ao DNA a um oligonucleotídeo formador de triplex (TFO). O uso de TFOs modificados, a associação de proteínas específicas de danos ao DNA e a modificação da topologia do DNA podem ser estudadas em células humanas pela utilização de ensaios de imunoprecipitação de cromatina modificada e ensaios de superenrolamento de DNA aqui descritos.

Resumo

caixa de grupo de alta mobilidade 1 (HMGB1) a proteína é uma proteína não-histona arquitectónico que está envolvido na regulação de muitas funções importantes no genoma, tais como transcrição, replicação de ADN, e a reparação do ADN. HMGB1 se liga ao DNA estruturalmente distorcida com maior afinidade do que a B-ADN canónica. Por exemplo, descobrimos que HMGB1 se liga ao DNA intercadeias ligações cruzadas (CIET), que covalentemente ligam as duas cadeias do DNA, causar distorção da hélice e, se deixada sem conserto pode causar morte celular. Devido ao seu potencial citotóxico, vários agentes indutores de ICL são actualmente utilizados como agentes quimioterapêuticos em clínica. Enquanto os agentes ICL-formando mostrar preferências por certas sequências de bases (por exemplo, 5'-TA-3 'é o local de reticulação preferido para psoraleno), que em grande parte induz danos no ADN de uma forma indiscriminada. No entanto, por acoplamento covalente do agente de indução de ICL a um oligonucleótido de formação de triplex (TFO), que se liga a DNA de uma sequência-específicaforma, o dano ao DNA alvo pode ser alcançado. Aqui, nós utilizamos um TFO covalentemente conjugado no "fim a um 4'-hidroximetil-4,5 'a 5 (HMT) psoraleno, 8-trimetilpsoraleno para gerar um ICL específica do local num plasmídeo repórter-mutação a ser usado como uma ferramenta para estudar a modificação de arquitectura, processamento, e reparação das lesões do ADN complexas por HMGB1 em células humanas. Descrevemos técnicas experimentais para preparar ICLs TFO dirigidos em plasmídeos repórter, e para interrogar a associação de HMGB1 com os ICLs TFO dirigidos em um contexto celular usando ensaios cromatina imunoprecipitação. Além disso, descreve-se ensaios de super-enrolamento de ADN para avaliar a alteração de arquitectura específica do ADN danificado por medição da quantidade de voltas superhelical introduzidas no plasmídeo psoraleno-reticulada por HMGB1. Estas técnicas podem ser usadas para estudar os papéis de outras proteínas envolvidas no processamento e reparação de ICLs TFO-dirigida ou outro dano do DNA alvo em qualquer linha celular de interesse.

Introdução

Triplex-formando oligonucleotídeos (TFO) DNA ligam duplex de uma forma específica de sequência por meio de ligação de Hoogsteen-hidrogênio para formar estruturas ^1-5 triple-helicoidais. Tecnologia triplex foi utilizado para interrogar uma variedade de mecanismos biomoleculares, tais como a transcrição, reparação de danos do ADN, e o gene de segmentação (revisto em referências ^6-8). TFO têm sido amplamente utilizados para induzir dano local específico em plasmídeos repórter ^9,10. O nosso laboratório e outros já anteriormente utilizado um TFO, AG30, presa a uma molécula de psoraleno para induzir reticulações intercadeias de ADN específi....

Protocolo

1. Preparação de ICLs TFO-dirigidas no plasmídeo Substratos

1. Incubar quantidades equimolares de pSupFG1 ^10,11 plasmídeo de DNA (DNA de plasmídeo de 5 ug é um bom ponto de partida) com psoraleno-AG30 conjugado TFO em 8 mL de tampão de ligação triplex [50% de glicerol, Tris 10 mM (pH 7,6), 10 mM de MgCl _2] e dH ₂ o para um volume final de 40 ul num tubo de âmbar. Misture bem, pipetando para cima e para baixo. Incubar a reacção a 37 ° C banho de água durante 12 h.
2. Aquecer a lâmpada UVA para garantir a saída de potência total. Coloque a reação triplex em filme de parafina, e coloque o filme de parafina no gelo sob a (n....

Resultados

Formação do ICL TFO-dirigida é crítico para os ensaios de plasmídeo baseado, que são utilizados para interrogar as funções das proteínas de arquitectura do processamento de ICL, em células humanas. Electroforese em gel desnaturante de agarose é uma maneira fácil para determinar a eficiência da formação de ICL TFO-dirigida. Os plasmídeos que albergam ICLs TFO dirigidos migram com uma mobilidade mais lenta através da matriz de gel de agarose (Figura 1A, pista 3) quando com.......

Discussão

A formação eficiente de ICLs TFO-dirigida é dependente de dois factores fundamentais: Em primeiro lugar, os componentes do tampão adequado (por exemplo, MgCl ₂₎ e o tempo de incubação do TFO com o seu substrato de ADN alvo (dependente da afinidade de ligação do TFO ao seu alvo duplex, e as concentrações utilizadas); e segundo, a irradiação a dose apropriada de radiação UVA (365 nm) para formar reticulações de psoraleno eficientemente. formação de triplex ideal pode ser conseguido através da utilizaçã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Pedido personalizado	HPLC (ou gel) purificado
Kit IP de cromatina enzimática simples ChIP	Cell signaling Inc.	9003	O protocolo sugerido pelo fabricante é otimizado para IP de cromatina e não para IP de plasmídeo. Os anticorpos IgG e H3 de controle, bem como as esferas de proteína G e a nuclease microcócica, são fornecidos pelo fabricante.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 anticorpo	Abcam	Ab18256
Wizard Gel e kit de limpeza de PCR	Promega	A9281
Sal de cloroquina-difosfato	Sigma	C6628-50G	Para eletroforese em gel de agarose bidimensional
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
Reagente de transfecção GenePORTER	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Lâmpada ultravioleta de onda longa Blak-Ray	Upland, CA	B 100 AP	Lâmpada UVA
Bioprocessador multifuncional EpiSonic 1100	Epigentek	EQC-1100	Sonicador de banho-maria
Filtro Mylar	GE Healthcare Life Sciences
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ sistema	de imagem de DNA
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Usado para reticulação
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Meios de cultura celular
PBS	ThermoFisher	70013073	Cultura celular
Tripsina-EDTA	ThermoFisher	25200056	Cultura celular
Bromocresol verde	Sigma-Aldrich	114-359	Corante de carregamento de DNA
Tubos siliconizados	Fisher Scientific	02-681-320	Tubo de microfuga de baixa retenção
Base Tris Fisher	Scientific	BP152-1
Ácido bórico	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Fotômetro	InternationalLight Technologies	ILT1400-A Medição de	dose UVA
Linhas celulares
Osteossarcoma U2OS humano	ATCC	ATCC HTB-96	Cultivado de acordo com o fornecedor recomendação do
Adenocarcinoma cervical humano HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultivado de acordo com o fornecedor s recomendação
Primer direto proximal	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Primer reverso proximal	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Primer direto distal	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Primer reverso distal	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

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