Artigo de método

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

DOI:

10.3791/54690

⸱

14 de dezembro de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Microbiology & Immunology, Weill Cornell Medical College, 2Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O charcoal agar resazurin assay (CARA) é um método semiquantitativo de médio rendimento para avaliar a atividade de agentes de teste contra micobactérias que são replicantes, não replicantes ou ambas. O CARA permite uma avaliação rápida da atividade dependente do tempo e da concentração e identifica os parâmetros a serem seguidos pelos ensaios de unidade formadora de colônias (UFC).

Resumo

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Há uma necessidade urgente de descobrir e progredir anti-infecciosos que encurtam a duração do tratamento da tuberculose (TB). Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, é refractário à quimioterapia rápida e duradoura, devido à presença de bacilos que exibem resistência a drogas fenotípica. O c harcoal um gar r esazurin um ssay (CARA) foi desenvolvido como uma ferramenta para caracterizar moléculas ativas descobertos por campanhas de rastreio de alto rendimento contra replicar e não replicante M. tuberculosis. Inclusão de carvão activado em meio agar bacteriologic ajuda a atenuar o impacto do composto carry-over, e elimina a exigência de células antes da mancha em CARA microplacas pré-diluir. Após um período de incubação de 7-10 dias a 37 ° C, a redução da resazurina por microcolônias micobacterianas que crescem na superfície de poços CARA permite semi-quantitativa assessment do número de bactérias através de fluorometria. O CARA detecta aproximadamente 2-3 log 10 diferença no número de bactérias e prevê uma concentração bactericida mínima levando a ≥99% a morte bacteriana (MBC ≥99). A CARA ajuda a determinar se uma molécula está activa em bacilos que estão a replicar, não replicantes, ou ambos. experiências piloto utilizando o CARA facilitar a identificação de qual a concentração de agente de teste e o tempo de exposição ao composto requerem avaliação adicional por meio de ensaios de formação de colónias (CFU) da unidade. Além disso, o CARA pode prever se replicar são activos bactericida ou bacteriostático.

Introdução

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Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, podem sobreviver em um host em um estado latente que é refractário à erradicação antibiótico. Fenotípica (não-genética) resistência da M. tuberculosis durante a infecção se acredita ser devido, em parte, às populações de bacilos não replicantes 1,2. Classe persistentes I exibem resistência aos medicamentos fenotípica surgem através de mecanismos estocásticos rara entre grandes populações de células sensíveis a drogas 3,4. persistentes de classe II são tornados não-replicante por fatores de imunidade do hospedeiro, incluindo tensões externas em microambientes encontrados durante a infecção. Desenvolvemos recentemente um modelo in vitro de Classe II não replicante persistência para imitar as condições confrontados por M. tuberculosis em macrófagos activados e granulomas. O modelo multi-stress de Classe II persistência inclui condições que o crescimento lento, tal como uma fonte de carbono do ácido gordo, e completamente Halcrescimento T, tal como acidez suave (pH 5,0), hipoxia (1% de O2), e o óxido nítrico e outros intermediários reactivos de azoto 5-9. Triagem em larga escala empregando este modelo multi-stress de não-replicação, e outros modelos não-replicantes Classe II, rendeu diversas moléculas cuja actividade é dirigida contra o Estado não replicante 5-7,9-18. As mesmas telas não replicantes também revelou uma categoria de moléculas que possuem atividade contra bacilos de multiplicação e não replicantes, denominado "dual ativos" 7,10,12,19,20.

Descoberta de drogas anti-bacteriana na fase de hit-to-lead implica extensa caracterização de moléculas candidatas para escolher leads para a expansão hit, caracterização farmacológica preliminar, a identificação do alvo, e estudos preliminares de eficácia in vivo. Como passo inicial, anti-infecciosos são classificados por seu mecanismo bacteriostático ou bactericida de ação e, se bactericida, wmorte bacteriana hether é tempo e / ou dependente da concentração. O ensaio de formação de colónias unidade (CFU) é o método padrão clássico, ouro para abordar estas questões. No ensaio de CFU, as bactérias são expostas a um agente de teste, após o que se alíquotas são removidas, diluídas em série, e aliquotas de diluições são espalhadas em meio bacteriológico sólida e incubados para permitir o crescimento de células sobreviventes. Finalmente, as colónias bacterianas são enumerados. O ensaio de CFU requer um grande número de placas de microtitulação para diluir as células de petri e placas contendo agar para enumerar colónias sobreviventes. O ensaio CFU para lenta micobactérias de crescimento é prejudicado por seu tempo lento geração (18-24 h), o que requer cerca de 3 semanas para que as colónias a aparecer em placas. Além disso, o espaço da incubadora é muitas vezes limitada em especializados biossegurança de nível-3 instalações.

Enquanto pesado, ensaios de CFU são o padrão de ouro para caracterizar o impacto das moléculas não-replicantes e dual-ativos na mycobacterI a. Ensaios não replicantes são sujeitos a altas taxas de falso-positivos como muitos são acoplados a replicação de ensaios para avaliar a viabilidade celular 6-8. Por exemplo, um composto que tem uma actividade potente contra a replicação de M. tuberculosis (um "replicar activo") pode falhar para matar durante o ensaio não replicante, e ainda assim pode matar em virtude da transição a partir da fase de não reprodução do ensaio para a fase de recuperação do ensaio, que é conduzida em condições que suportam a replicação ( "replicar condições"). Composto transitar complica ainda mais a análise de moléculas ativas dupla, tornando-se difícil distinguir se a atividade foi replicar, não replicantes, ou duplo.

Para resolver os problemas descritos acima, foi desenvolvido o c harcoal um gar r esazurin um ssay (CARA) para uma rápida contagem, semi-quantitativa de espécies de micobactérias tais como M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. smegmatis e 7 (Figuras 1 e 2). Em soluções tampão in vitro, carvão activado sequestra rapidamente a maioria das drogas convencionais utilizadas no tratamento da tuberculose 7. O carvão ativado em CARA microplacas liga compostos que podem transportar mais de uma microplaca de ensaio, e esta característica da CARA elimina a necessidade de diluir em série conteúdos ensaio bem antes de enumeração 7,21,22. O número de microcolónias micobacterianos sobre a superfície de agar de CARA microplacas é estimada pela adição de resazurina, um corante azul, cuja forma reduzida, resorufina, é uma molécula de rosa, cuja fluorescência é medida por espectrofotometria de um 23. CARA microplacas são incubadas durante 1-2 dias de M. smegmatis e de 7-10 dias para as micobactérias de crescimento lento, tais como M. tuberculosis e M. bovis BCG. O CARA tem uma faixa dinâmica estreita do ~ 2-3 log 10 diferência em CFU. Quando usado em vez de um ensaio CFU, uma única microplaca CARA substitui cerca de cinco placas de 96 poços utilizados para diluições em série e as placas de agar 120 tri-estilo utilizados para o chapeamento. Interpretação dos dados CARA ajuda a orientar estudos posteriores, determinando que a incubação tempos e concentrações de compostos para testar em ensaios baseados em CFU mais trabalhoso.

Protocolo

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1. Preparação de microplacas CARA

  1. Autoclave a 900 ml de agar Middlebrook 7H11 contendo 0,2% de glicerol e 0,4% de carvão activado em um balão de 2 L de Erlenmeyer, ou, alternativamente, em 450 ml de 1 L proveta de vidro. Incluem uma grande barra de agitação autoclavable no frasco ou copo. Cobrir a abertura do frasco ou copo com folha de alumínio e anexar ao vidro com fita autoclave.
  2. Arrefece-se até tocar (aproximadamente 55-65 ° C) numa placa de agitação magnética regulada para uma velocidade baixa para manter o carvão vegetal em suspensão.
  3. Execute todas as etapas subsequentes de forma asséptica em uma capa de biossegurança que tem uma placa de agitação magnética.
  4. Retire o papel alumínio. Adicionam-se 100 ml OADC suplemento (suplemento OADC, quando utilizado a 10%, produz concentrações médias finais de 0,2% de dextrose, 0,5% de albumina, 0,085% de NaCl, 0,0005% de ácido oleico, e 0,4 mg / ml de catalase) ao balão de 2 L de Erlenmeyer , ou 50 ml OADC a uma proveta de L, e continuar a misturar.
  5. Se estiver usando uma garrafa de Erlenmeyer, despeje cerca de 25-40 ml de 7H11-OADC carvão em um reservatório de reagente estéril. Se usando o copo, o que não é necessária a utilização de um reservatório de reagente.
  6. Encha uma microplaca de 96 poços com 200 ul / poço de 7H11-OADC-carvão a partir do recipiente de reagente ou copo. Trabalhar rapidamente para evitar a solidificação ágar e introdução de bolhas. Evitar salpicos fora meio sólido dos poços, como que podem ser uma fonte de contaminação por fungos. Usando uma pipeta de canais múltiplos, utilizar um conjunto de 12 pontas de filtro para a transferência de 7H11-OADC-carvão para as 8 linhas (AH) da placa de 96 poços.
    NOTA: O meio solidifica rapidamente. Para evitar o entupimento pontas de pipeta, alterá-los com freqüência.
  7. Alternativamente, despeje CARA microplacas utilizando uma pipeta multicanal electrónica P1000 com pontas com filtro para ajudar na preparação de vários pratos.
    NOTA: Devido ao baixo volume de poços, o agar em CARA microplacas solidifica a poucos minutos do vazamento.
  8. pilhas local de CARA microplacas em ba plástico hermeticamente fechadogs para evitar que sequem.
  9. Loja CARA microplacas a 4 ° C.

2. Configurar Replicar e Não-replicante MIC 90 Assays

  1. Inocular M. tuberculosis, M. bovis BCG ou M. smegmatis a uma DO 580 de 0,01-0,1 e expandir até à fase mid-log (OD 580 ~ 0,5) em meio Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 0,2% de dextrose , 0,5% de albumina, e 0,085% de NaCl) ou 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol e 10% de suplemento OADC).
  2. Crescer M. tuberculosis e M. bovis BCG como ~ 20 ml de pé culturas em frascos de cultura celular e M. smegmatis com agitação em polipropileno de fundo redondo (4 ml de cultura) ou 50 ml tubos de centrífuga cónico (10-20 ml de cultura). Incubar micobactérias patogénicas, a 37 ° C com 20% de O 2 e CO 2 a 5%, e M. smegmatis, a 37 ° C com 20% de O 2.
  3. Configurar uma mínima inibitóriaconcentração (MIC 90) experimento de estilo sob replicante e não replicar condições (Figura 2).
    Nota: Os agentes de teste são geralmente ensaiados em duplicado ou quadruplicado para permitir o teste 4, 2 ou compostos, respectivamente, por 96 poços de microplacas. Por exemplo, em uma placa de 96 poços, um agente de teste pode ser ensaiado nas linhas AD e outras em fiadas EH. O DMSO (veículo) é nas colunas 1, 2 e 12, e a série de diluição do agente de teste é executado a partir da coluna 3 (concentração mais baixa) a coluna 11 (concentração máxima). MIC 90 ensaios -estilo tipicamente empregam uma série de diluição de 2 vezes. Existem inúmeros modelos não-replicante disponíveis para micobactérias 14-16,18,24,25 e para fins ilustrativos, estamos usando um modelo multi-stress de não-replicação 6,8,9.
    1. Para o ensaio de replicação, distribuir 200 ul em células 7H9-ADN a uma DO 580 de 0,01 em todos os poços de uma placa de 96 poços clara de fundo, de cultura de tecidos tratados.
    2. Para o ensaio não replicante, lavar as células duas vezes em fosfato tamponado salino (PBS) contendo 0,02% de tiloxapol, e Ressuspender as células em meio não-replicantes (0,05% KH 2 PO 4, 0,05% de MgSO4, 0,005% de citrato de amónio férrico , 0,0001% de ZnCl2, 0,1% de NH 4 Cl, 0,5% de BSA, NaCl a 0,085%, 0,02% tiloxapol, 0,05% de butirato; pH ajustado para 5,0 com NaOH a 2 N).
      1. Dilui-se as células até uma OD 580 de 0,1 em meio não-replicantes e adicionar NaNO2 a partir de um estoque 1 M preparada de fresco para uma concentração final de 0,5 mM.
      2. Distribuir 200 ul de células a uma DO 580 de 0,1 em todos os poços de uma placa de 96 poços clara de fundo, de cultura de tecidos tratados.
        NOTA: Preparar diluições dos compostos como soluções de reserva de 100 vezes em DMSO. Assim, uma placa de MIC típico testar o impacto de uma molécula numa concentração final 0,4-100 ug / ml exigiria soluções de reserva de 0,04-10 mg / mL em DMSO.
    3. Adicionar 2 mL de diluções de agente de teste 1 em linhas AE e 2 ul de diluições do agente de teste 2 em linhas EH. Homogeneizar.
    4. Adicionar 2 controle do veículo ul (normalmente DMSO) em poços de controlo, colunas 1, 2, 12 (linhas AH). Homogeneizar.
    5. Para cada experiência, incluem, pelo menos, um controlo positivo, tal como a rifampicina de 0,004 a 1 ug / mL (ensaio de replicação) e / ou 0,08 a 20 ug / mL (ensaio de não reprodução).
      NOTA: A utilização de 6-bromo-1H-indazol-3-amina 9 a 0,1 a 25 ug / ml é recomendado como um composto de controlo que tem selectiva, a actividade dependente de NaNO2 no modelo multi-stress de não-replicação.
    6. Para replicar ensaios, incubar microplacas a 37 ° C em 20% de O2 e 5% de CO 2 durante 7 dias (M. tuberculosis e M. bovis BCG) ou (1-48 hr M. smegmatis). Para o modelo de multi-stress de não replicação, incubar microplacas durante 7 dias a 37 ° C em 1% de O2 e 5% de CO 2 ( M. tuberculosis e M. bovis BCG).

3. A inoculação de CARA Microplates

  1. Em pontos de tempo em que o CARA serão utilizados como um-para ler, cuidadosamente ressuspender bem o conteúdo da placa de ensaio de estilo MIC 90 utilizando uma pipeta multicanal P200 fixada em 50-75 ul. Pipeta cima e para baixo pelo menos 5-10 vezes e rode suavemente o conteúdo do poço em um movimento circular usando as pontas de pipeta.
  2. Transferência de 10 ml de conteúdos ensaio bem para a microplaca CARA. Assegure-se que a ordem dos conteúdos dos poços na placa de ensaio corresponde à ordem dos conteúdos dos poços da microplaca Cara. Evitar respingos durante as transferências e certifique-se os 10 ml são vistos no meio dos poços CARA microplacas. Confirme as 10 jul absorve na microplaca CARA.
    NOTA: Não há diluições necessárias antes de células na CARA microplacas manchas.
  3. pilhas de vinculação de CARA microplacas com fita placa eem seguida, coloque em um saco de plástico hermeticamente fechado. Incubar CARA microplacas a 37 ° C com 20% de O2 (M. smegmatis) ou 1% de O2 e 5% de CO 2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG).
  4. Para o M. tuberculosis e M. bovis BCG, replicando ensaios: incubar durante 7 dias; para o M. tuberculosis e M. bovis BCG não replicante ensaios, incubar durante 10 dias; M. smegmatis, replicando ensaios, incubar durante 1-2 dias; M. smegmatis, ensaios não-replicantes, incubar 2-3 dias.
    NOTA: Os tempos são estimativas e podem ser alteradas em conformidade para replicar diferente, não replicantes, e condições de estresse.

4. Desenvolver CARA Microplates

  1. Desenvolver o CARA microplacas quando um filme de crescimento bacteriano, ou maior, de colónias macroscópicas, são visíveis nos poços (veículo) de controlo negativo.
    NOTA: Após a incubação prolongada, cara poços, muitas vezesparecer seca e nós recomendamos a pré umectantes poços conteúdos com PBS estéril. Isto serve para impedir que o carvão de absorver resazurina, o que pode levar a baixa fluorescência ou variação poço-a-poço.
  2. Usando um conjunto único de 12 P200 dicas com uma pipeta de canais múltiplos, dispensar 40 ul de PBS estéril ao longo do lado dos poços e deixar o PBS para distribuir através da parte superior das microcolônias agar / bacterianos.
  3. Prepare CARA desenvolvimento de reagente através da mistura de 5 mg de resazurina (0,01% final) e 50 ml de 5% Tween 80 em PBS. Vortex e o filtro esterilizado.
    NOTA: Uma alternativa CARA reagente revelador pode ser preparado por mistura de preparados comercialmente resazurina solução líquida a 1: 1 (vol / vol) com 10% de Tween 80 em PBS.
  4. Adicionar 50 ul de reagente recentemente preparado desenvolvimento CARA a cada poço da microplaca CARA utilizando uma pipeta de 12 canais. placas de rock e para trás algumas vezes para ajudar a distribuir o reagente em todo o tapete de agar e bacteriana em cada poço.
  5. Coloque as placas ind saco selado plástico e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 30 min para M. smegmatis e de 45-60 min para o M. tuberculosis ou M. bovis BCG.
    NOTA: Se os poços de controlo de veículo deixar de ficar rosa dentro da primeira hora, as placas podem ser re-ensacado e incubou-se durante longos períodos de tempo.
  6. Antes da leitura da fluorescência, colocar CARA microplacas em uma capa biosegurança durante 15 min à temperatura ambiente com as tampas removidas. Ao usar espectrofotômetros BSL3 fora de uma cabine de segurança biológica, aderir um adesivo PCR qualidade óptica através da placa e lacre firmemente pressionando suavemente na superfície da etiqueta com uma toalha de papel macio.
  7. Determinar a fluorescência através de topo ler com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Não é necessário para inibir a placa.

Análise 5. Os dados

  1. Lote concentração de inibidor no eixo-X numa escala de log de fluorescência 10 e no eixo dos Y em uma escala linear. Use uma dispersãotrama empregando um ajuste de curva, como "log de inibidor versus inclinação variável-resposta (4 parâmetros)". pontos de dados trama como meio ± erro padrão.

Resultados

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CARA resultados antecipados estão descritos na Figura 2 e resumidos na Tabela 1. Para as células replicar, o CARA é executado em paralelo com um padrão de MIC 90 ensaios, e para ensaios não-replicante, o CARA é executado em paralelo com um ensaio MIC 90 adaptada que é acoplado a uma fase conseqüência. A concentração de agente de teste que resulta em falha de Cara-de fluorescência a subir acima dos níveis de fundo é a cara-MBC ≥99 (Figura 3a). O "≥99" subscrito indica que a cara-MBC proporciona uma concentração estimada de agente de teste que dá origem a ≥2 log10 morte bacteriana (≥99% de mortes).

O ensaio líquido caldo MIC 90 é incapaz de distinguir entre atividade bactericida e bacteriostática e esta distinção tem de ser resolvido por um ensaio CFU. Deconvenção, o limite que distingue bactericida da atividade bacteriostática para slow-micobactérias de crescimento é de cerca de 2-3 log 10 mortes causadas por 7 dias 7,26. Uma vez que a faixa dinâmica da CARA também é 2-3 log de 10 mortes, o CARA pode fornecer uma estimativa da atividade bactericida ou bacteriostático. A CARA facilmente identifica alguns agentes activos de replicação como bacteriostática devido a falha destes compostos para diminuir CARA fluorescência para os níveis de fundo (Figura 2). No entanto, alguns compostos com actividade bacteriostática contra M. tuberculosis replicar ter um efeito pós-antibiótico potente, o que significa que eles continuam a inibir novo crescimento de bactérias durante a fase de recuperação, mesmo na ausência do composto de reporte. Este efeito pode ser difícil reconhecer no ensaio CARA. Os compostos são suspeitos de exercer um efeito pós-antibiótico se eles exibem uma "janela estática", definida como uma mudança> 4 vezes para a direita entrn as curvas MIC e Cara (Figura 3b). A janela estático indica que uma molécula activa contra a replicação de M. tuberculosis podem ser bacteriostáticos em vez de bactericida. Em alguns casos, as janelas estáticas são aparentes apenas após a inspeção de um eixo Y expandida para CARA fluorescência (Figura 3c e 3d).

90 Cara e dados de MIC são geralmente representados graficamente em conjunto (Figura 4). Os dados representativos para moléculas replicating- e não replicantes-activos testados por MIC 90 e Cara são mostrados na Figura 4. Existem 4 grandes classes de actividade de moléculas: 1) replicando bactericida (demonstradas com isoniazida, Figura 4a); 2) replicação bacteriostático (demonstrado com linezolida, Figura 4b); 3) não replicar bactericida (demonstrado com oxifenbutazona, Figura 4c); e, 4) repbactericida licating-activo (bacteriostáticos ou bactericidas) e não replicante (demonstrado com PA-824, Figura 4D). Importante, as Figuras 4A e 4B demonstram que enquanto a isoniazida e linezolida parecem ter actividade contra bactérias não replicantes pelo ensaio MIC 90, o CARA sugere que eles são inactivos sob as condições não-replicante testados. Para testar a utilidade da CARA predizendo o impacto tempo e dependente da concentração de uma molécula, replicando M. smegmatis foi exposta a concentrações crescentes de rifampicina (Figuras 5a - d), e em vários momentos entre 1-24 horas, as alíquotas foram manchados em placas de Cara. Estes dados indicaram que a rifampicina exercido um impacto tão cedo quanto de 1 hora (figura 5a), apresentado o aumento da actividade bactericida entre 3 e 24 horas (figuras 5B-d), e matou ≥2-3 log 10 em ~ 10 ug / ml, por dois4 h (Figura 5D). Uma experiência semelhante testando quadruplicado de um veículo de controlo e 9 as concentrações de droga, e em 4 pontos de tempo, seriam proibitivos por um ensaio padrão baseado em CFU.

Assim, o CARA tem um papel na descoberta de drogas como um meio-débito, mecanismo rápido para identificar um perfil de actividade da molécula. previsões CARA devem ser rigorosamente avaliados utilizando um ensaio CFU padrão. A adição de 0,4% de carvão activado para placas de Petri para a análise de CFU pode ajudar a melhorar a correlação de dados de cara, e pode resultar em contagens de CFU mais precisos, a magnitude da correcção sendo geralmente proporcional à potência do composto 21,22.

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Figura 1: O CARA é uma ferramenta preditiva na descoberta de medicamentos. Este diagrama resume a utilidade do CARA como umestágio intermediário entre a seleção da droga (screening ponto único, cherry-picking e ensaios de dose-resposta) e ensaios demoradas hit-to-lead (ensaios de UFC ea identificação do alvo). [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Representação esquemática do ensaio em caldo MIC 90 e Cara com os resultados esperados. Ambos os MIC 90 e Cara resultados são apresentados para 8 actividades possíveis. A codificação de cores para MIC 90 poços é branco (sem crescimento) e marrom (crescimento), e para CARA microplacas é preto (ausência de fluorescência) e rosa (fluorescência resorufina). Os dados são hipotéticas. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Especializada termos Cara e definições. A concentração bactericida mínima de uma molécula que resulta em níveis de fluorescência de fundo CARA é a cara-MBC ≥99 (a). Sob condições de replicação, um deslocamento ≥4 vezes da cara-≥99 MBC para a direita da MIC 90 geralmente indica actividade bacteriostática e é chamada uma "janela estática" (b). Para moléculas com um efeito pós-antibiótico potente, janelas estáticos podem ser difíceis de observar, (c) e requeremexpansão do eixo Y (CARA fluorescência) para visualizar (d). Os dados são hipotéticas. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: MIC ilustrativa 90 e CARA resultados para selecionar compostos. Dados para o MIC 90 (vermelho) e Cara (azul) são demonstradas por (uma) isoniazida (INH), (b) linezolida, (c), oxifenbutazona, e (d) PA-824. De tipo selvagem de M. tuberculosis H37Rv foi exposta aos compostos durante 7 dias sob condições de replicação padrão ou o modelo multi-stress de não replicação 7-9. MIC 90 e Cara ensaios foram realizados como se mostra na Figura 2. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: dose e actividade dependente do tempo de rifampicina. O não-patogénico, de crescimento rápido M. smegmatis foi exposta a concentrações crescentes de rifampicina sob condições de replicação e alíquotas foram amostrados para Cara em 1 (a), 3 (b), 6 (c) e 24 (d) h. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7].com / files / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Tabela 1: Resumo dos resultados esperados na Figura 2. [Adaptado com permissão de Gold et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2015 7] Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Discussão

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O CARA foi originalmente desenvolvido para aliviar um gargalo no progredindo não replicantes ou moléculas dual-ativo 7. A CARA serve como um passo intermédio entre a confirmação de concentração-resposta de visitas de rastreio primário e ensaios de CFU (Figura 1). Uma vez que uma única placa CARA pode substituir inúmeras placas de microtitulação necessárias para preparar diluições em série e placas de Petri contendo ágar utilizado para enumerar bactérias sobreviventes, o CARA fornece um meio simples de avaliar rapidamente a atividade de um molécula e testar múltiplas variáveis ​​de uma só vez, incluindo concentração de composto e tempo de exposição ao composto.

Num ensaio de CFU, além de diluições em série, que muitas vezes variam até 10 vezes de 6, a placa de agar tipicamente dilui moléculas por um ~ 800 vezes adicional (10 ul Onto 8 ml numa placa de Petri de estilo de tri). Nosso em duas fases, ensaio de triagem multi-stress para compostos ativos na não-replicante M. tuberculosis tem um factor de transição de 5 vezes, isto é, um composto presente no estágio de não reprodução do ensaio está presente a um quinto da concentração original no (replicação) da fase de ensaio 6-9 excrescência. Os atenua CARA carry-over efeitos sequestrando moléculas pequenas com carvão ativado. A maioria dos medicamentos contra a tuberculose e candidatos clínicos ligam carvão activado rapidamente e completamente, com a excepção do aminoglicósido estreptomicina 7. Inclusão de carvão ativado em placas de agar para ensaios CFU impedido inibição do crescimento bacteriano, ou morte bacteriana, por realizadas-over TMC207 e PA-824 7,21,22. Assim, em virtude de incorporação de carvão activado no ágar bacteriológico, o CARA não é dependente de diluições em série de células e agente de teste.

O CARA pode ajudar a prever o impacto bacteriostático ou bactericida de replicar ativos e impacto bactericida de ativos não-replicante. em geral, o CARA é usado em paralelo com o MIC padrão 90 ensaios. O poder preditivo da CARA vem comparando MIC 90 e os resultados CARA (Figura 2 e Tabela 1). Quando usadas para estudar agentes anti-micobacterianos, a CARA pode prever com precisão a actividade bactericida que está a replicar (Figura 4a), replicando bacteriostático (Figura 4b), bactericida não replicante (Figura 4C), ou dupla activa (Figura 4d). O CARA também permite avaliação simples da actividade de um composto através tanto da dose e do tempo. Os ensaios de CFU por si só requerem uma grande quantidade de esforço e de material para avaliar a actividade de um composto sobre uma ampla gama de doses e tempos, mas a tarefa torna-se controlável quando resultados CARA limitar a gama de condições para aquelas em que o composto é demonstravelmente activa (Figura 5 ).

Enquanto o CARA tem utilidade no estudo da acção de umNTI-infecciosos em micobactérias, o ensaio tem limitações. A CARA tem uma gama dinâmica estreita (3/2 log 10) e pode não ser apropriado para as condições em que se antecipa que não pode ser mais do que 2 a 3 log 10 morte bacteriana. previsões CARA requerem estudos adicionais utilizando um método mais rigoroso e preciso para enumerar os números bacterianos, tais como um ensaio de CFU. O efeito pós-antibiótico de alguns anti-infecciosos, tais como PAS, pode confundir o CARA como uma ferramenta preditiva para distinguir entre compostos com actividade bactericida e bacteriostática contra M. tuberculosis replicar 7.

Há duas recomendações para melhorar a qualidade da CARA. Primeiro, é preciso derramar CARA microplacas rapidamente antes que os solidifica de ágar, mantendo a precisão volumétrica e evitar espirrar fora de micropoços. Independentemente do número de placas necessárias, recomendamos que 0,5 a 1 L de meio de lotes para ajudar a manter o médio na forma líquida para a duração do tempo requerido para placas de verter. Trocando as pontas com frequência durante o preenchimento microplacas com meio evita usar dicas parcialmente obstruídas. Em segundo lugar, deve-se minimizar a variabilidade artifactual na fluorescência entre repetições. Microcolônias micobacterianas, em particular para micobactérias patogénicas, tais como M. tuberculosis, muitas vezes crescem de forma irregular. Por exemplo, microcolônias que crescem na superfície de agar podem variar em tamanho, a forma, a altura, ou pode estender-se para as paredes interiores dos poços das microplacas. Um desafio é cobrir todos os bacilos uniformemente com o reagente em desenvolvimento. Outro obstáculo é que após incubação prolongada a 37 ° C, o meio bacteriológico sólido da CARA microplacas pode tornar-se seca e propenso a absorção do reagente revelador. Desde carvão activado pode ligar-se resazurina e extinguir a fluorescência 7, pode haver uma variação poço-a-poço devido a poços secos absorvem a resazurina e a solução de revelação Charcoa activadal têmpera resazurina fluorescência. Pré-molhar a superfície de todos os poços da microplaca CARA com PBS imediatamente antes de adicionar o reagente de desenvolvimento de mitiga ambos estes problemas - o reagente de desenvolvimento vai chegar a todas as colónias de micobactérias da mesma forma, e a resazurina permanece segura acima do carvão activado. O CARA pode ter aplicações na identificação e caracterização de fenótipos dos mutantes de micobactérias, ou de médio rendimento ensaios de descoberta de drogas para outras espécies bacterianas.

Divulgações

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Não há conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

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Somos gratos a Kristin Burns-Huang para análise de peritos do manuscrito e J. David Warren (Weill Cornell Medical College) para obter ajuda química durante o desenvolvimento da CARA. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Accelerator TB Drogas da Fundação Bill e Melinda, a Abby e Howard Programa P. Milstein em Translational Medicine, e um TB Unidade de Investigação NIH (U19 AI111143). O Departamento de Microbiologia e Imunologia é suportado pelo Randolph Hearst Fundação William. SSK foi apoiada por K08AI108799 concessão NIH.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Middlebrook 7H9Beckton Dickinson271310
Middlebrook 7H11Beckton Dickinson298810
Middlebrook OADCBeckton Dickinson212351
BSA, choque térmicoRoche3118958001
carvão ativadoSigmaC5510
PBS, Ca2+ e Mg2+ de Dulbecco FreeLife Technologies / Invitrogen14190-144
entre 80SigmaP8074
tiloxapol
2252
rifampicinaSigmaR3501
6-bromo-1H-indazol-3-aminaAlfa AesarH34095
fosfato de potássio monobásico   Sulfato de magnésio SigmaP0662
, heptahidratado CitratoM1880
SulfatoF5879
, heptahidratadoSigmaZ0251
cloreto de amônio SigmaA9434
ácido butírico, líquidoSigmaB103500
resazurina em póSigmaR7017
cloreto de sódio J.T. Baker4058-01 
solução preparada de resazurinaInvitrogenDAL1100
Espectrofotômetro DenvilleB1212-5
Molecular DevicesM5
96 poços, microplacas tratadas com cultura de tecidosReservatórios de reagentes Corning3595
VWR 89094-678
sacos de plástico reutilizáveisVWR 395-94602
Tubos de fundo redondo de polipropileno de 14 mlCorning 
Tubo de centrífuga cônico de 50 mlCorning352070
75 cm2 Frasco de cultura de célulasCorning431464U
microplaca de 96 poços tratada com cultura de tecidos de fundo plano e transparente Microplaca de 96 poçosCostar3595
Prism 6 para OS XGraphPadhttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Nitrito de sódio Sigma de amônio férrico Sigma de zinco Sigma Adesivos de PCR 352059

Referências

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  1. Nathan, C. Fresh approaches to anti-infective therapies. Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).
  2. Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance. Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).
  3. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  4. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. Lancet. , 497-500 (1944).
  5. Bryk, R., et al. Selective killing of nonreplicating mycobacteria. Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).
  6. Gold, B., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).
  7. Gold, B., et al. Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).
  8. Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).
  9. Warrier, T., et al. Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).
  10. Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. Chem, J. .M. ed. , (2014).
  11. Darby, C. M., et al. Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 8, e68942(2013).
  12. Darby, C. M., Nathan, C. F. Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).
  13. de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. ACS Med. Chem. Lett. 2, 849-854 (2011).
  14. Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).
  15. Grant, S. S., et al. Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model. ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).
  16. Zhang, M., et al. Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).
  17. Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).
  18. Cho, S. H., et al. Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).
  19. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).
  20. Rebollo-Lopez, M. J., et al. Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery. PLoS One. 10, e0142293(2015).
  21. Tasneen, R., et al. Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).
  22. Grosset, J. H., et al. Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).
  23. Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).
  24. Wang, F., et al. Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).
  25. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).
  26. Barry, A. L., et al. Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).

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