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Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

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DOI:

10.3791/54693

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30 de novembro de 2016

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1Digestive Disorders Unit, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health, DHHS, 2National Institutes of Health Research Scholar, Howard Hughes Medical Institute, 3Internal Medicine, Medical School, University of Michigan

Neste artigo

Resumo

Descrevemos o uso de uma plataforma de expressão gênica multiplexada de alto rendimento que quantifica a expressão gênica por código de barras e contagem de moléculas em substratos biológicos sem a necessidade de amplificação. Usamos a plataforma para quantificar a expressão de microRNA (miRNA) no sangue total em indivíduos com e sem síndrome do intestino irritável.

Resumo

O ensaio de plataforma de expressão do gene permite a quantificação e altamente reprodutível robusto da expressão de até 800 transcritos de ARNm (ou miARNs) numa única reacção. O ensaio miRNA conta transcrições por imagem direta e digital contando moléculas miRNA que são rotulados com conjuntos com códigos de cores fluorescentes com código de barras sonda (uma sonda repórter e uma sonda de captura). Os códigos de barras são hibridizados directamente para amadurecer miARNs que foram alongados por ligação de uma marcação de oligonucleótido original (miRtag) à extremidade 3 '. A transcrição reversa e a amplificação dos transcritos não são necessários. sondas repórter contém uma sequência de seis posições de cor preenchida usando uma combinação de quatro cores fluorescentes. As quatro cores com mais de seis posições são usados ​​para construir uma sequência de cores de código de barras específico para o gene. processamento pós-hibridação é automatizado em uma estação de preparação de robótica. Após a hibridação, as sondas em excesso são lavados, e as estruturas tripartidas (pro capturaser-miARN-repórter sonda) são fixados a uma lâmina revestida de estreptavidina através da sonda de captura marcada com biotina. Imagem e código de barras contagem é feita usando um analisador digital. Os miRNAs com código de barras imobilizados são visualizados e fotografada usando um microscópio e câmera, e os códigos de barras único são decodificados e contadas. controle de qualidade de dados (QC), normalização e análise são facilitados por um software de processamento de dados e análise de design personalizado que acompanha o software de ensaio. O ensaio demonstra elevada linearidade ao longo de um amplo intervalo de expressão, bem como uma elevada sensibilidade. Exemplo de preparação e ensaio não envolve reacções enzimáticas, de transcrição reversa ou de amplificação; tem poucas etapas; e é amplamente automatizadas, reduzindo os efeitos investigador e resultando em alta consistência e reprodutibilidade técnica. Aqui, descrevemos a aplicação desta tecnologia para identificar circulam perturbações miRNA na síndrome do intestino irritável.

Introdução

Síndrome do Cólon Irritável (SII) é o diagnóstico ambulatorial mais comum em Gastroenterologia, que atinge 10 - 15% da população em geral e representando um encargo significativo para os serviços de saúde. Biomarcadores diagnósticos atualmente, não há geralmente aceites para IBS (ou seja, o diagnóstico é baseado em sintomas clínicos e excluir outros distúrbios orgânicos, tais como malignidade GI, doenças inflamatórias do intestino, e gastrointestinal (GI) infecções). Ao estudar perfis de expressão gênica em doenças comuns com histopatologia subclínica, como IBS, alta sensibilidade e precisão (reprodutibilidade) são necessários, como perturbações nos perfis de expressão gênica são muitas vezes sutis 1-3. miRNAs foram identificados como os dois alvos diagnósticos e funcionais em IBS 4,5, e estamos particularmente interessados em avaliar a sua utilização como biomarcadores de 3,4,6,7 perturbações biológicas IBS-associados circulação. A utilização clínica de circulabiomarcadores ting é de interesse atual, devido à facilidade e à natureza minimamente invasiva da coleção de fonte dos biomarcadores (por exemplo, sangue periférico) de pacientes.

Gene ensaios de expressão de plataforma, por causa da sua química única e simplificada, na maior parte do fluxo de trabalho automatizado, proporcionar uma plataforma de microarray que fornece largura personalizada cobertura (800 alvos numa única reacção) do transcriptoma para a descoberta de alvo. Eles também produzir alta precisão e linearidade ao longo de um amplo espectro de níveis de expressão na quantificação dos objectivos transcriptomic. O ensaio não requer a transcrição inversa do ARN, a amplificação do ADNc resultante, ou quaisquer outras reacções enzimáticas. Assim, os potenciais erros introduzidos pelos números altos ciclos de amplificação a partir de espécies de RNA com baixa abundância ou variantes de splicing raras são reduzidos pelo processo de contagem digital. Isto significa que uma grande variedade de tipos de amostras, tais como o total de purificadoARN (isto é, ARNm + miARN), RNA de amostras fixadas com formalina e embebidos em parafina (FFPE), assim como o tecido de células em bruto e lisados, podem ser utilizados com os ensaios.

ARN de interesse são detectados utilizando um par de sondas de captura e sondas (repórter), cada uma contendo uma sequência especifica de alvo que reconhece uma região correspondente no ARN alvo. A fim de assegurar a detecção de RNAs de curta duração (isto é, miARNs), a sequência de miARN madura é alongada por emparelhamento uma marcação de oligonucleótido original (miRtag) à extremidade 3 'da molécula. Um oligonucleótido de ponte, que é complementar a uma porção tanto da miARN alvo maduro e o miRtag específicos de miARN, é usado para assegurar a especificidade da sequência. As sondas de captura e reporter ligar-se a 3 'e 5' do complexo madura miARN-miRtag, respectivamente. As sondas de captura possuem um marcador de biotina na extremidade 3 ', o que lhes permite fixar à superfície de uma lâmina de vidro revestida com estreptavidina, Fixing a captura sonda-miRNA-miRtag-repórter complexo sonda ao slide. Uma corrente eléctrica é então usada para orientar o complexo sobre a superfície da corrediça, permitindo que os códigos de barras fluorescentes realizadas pela sonda repórter na extremidade 5 'para ser visualizado utilizando um microscópio e dispositivo de carga acoplado da câmara (CCD). Os códigos de barras são contadas e descodificado, obtendo-se uma contagem dos miARN alvo específicos. O código de barras fluorescente consiste de seis posições, que pode ser ocupada por um de quatro cores fluorescentes, as quais podem ser utilizadas para a construção de mais de 4000 combinações de cor-de código de barras, cada codificante para um ARN específico.

A preparação da amostra (isto é, a purificação ou preparação de ARN lisado de células / tecido), bem como a hibridação das sondas de captura e repórter, são feitas na bancada. Doze espécimes podem ser multiplexados em um único slide. Após a hibridação durante a noite, toda a preparação adicional amostra é realizado por uma estação de preparação robótico. As lâminas carregadas são depois transferidos para o ADanalisador igital para geração de imagens, contando, decodificação e processamento de dados. Os dados resultantes são importados para o software que o acompanha, onde são tratados posteriormente com um alto grau de controle do usuário. A única química, preparação simples, natureza automatizada, tipo de dados simples (contagem), e fluxo de trabalho simplificado geral do ensaio facilitar de alta precisão a expressão do gene quantificação, tornando-se uma ferramenta útil no estudo que circulam perfis de expressão de miRNA e assinaturas em condições funcionais, tais como SII.

Protocolo

A pesquisa descrita aqui foi aprovado pelo Institutional Review Board do National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).

1. Recolha de amostras de sangue total

  1. Recolha de amostras de sangue total (2,5 ml) a partir de participantes de estudo por via punção venosa em tubos de colheita de sangue contendo uma solução de estabilização de ARN (que permite o armazenamento a longo prazo), e armazená-las a -80 ° C até à purificação do ARN.

2. O ARN total Purificação

  1. Descongelar e incubar os tubos de sangue durante 2 horas, e em seguida, centrifuga-los utilizando um rotor basculante para fora durante 10 min a 5000 x g. Retire o sobrenadante por cuidadosamente derramar ou pipetando-o para um tubo de resíduos, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
  2. Lava-se a pelete por adição de 4 ml de água livre de RNase, substituir a tampa de segurança, e agitar com vortex até que o sedimento é visivelmente dissolvido. Centrifugar usando um rotor oscilante balde a 5000 xg durante 10 min e remover-se o sobrenadante, como descrito na etapa 2.1.
  3. Adicionar 350 ul de tampão BM1 (fornecida) ao sedimento. Vortex o sedimento até estar visivelmente dissolvido e transferi-lo para um tubo de processamento de 2 ml para extracção de ARN total automatizado.
  4. Realizar purificação automatizada de ARN intracelular, incluindo miARN, a partir de todo o sangue usando um kit de extração de RNA comercialmente disponível, que pode ser automatizado em um sistema de extracção de ARN robótico.
    NOTA: O sistema robotizado e automatizado que utilizado pode processar doze amostras de cada vez, e leva três horas para o protocolo de purificação de RNA para se completar.
    1. Carregar os pré-carregados pontas de pipetas, tubos de centrífuga, tampões e reagentes fornecidos no kit de purificação de RNA para o sistema de extracção de ARN robótico.
    2. Selecione o protocolo "Blood miRNA Parte A" a partir do menu de seleção de protocolo e iniciar a execução.
      NOTA: Consulte Materiais suplementares para obter uma descrição dos procedimentos automatizados.
    3. Uma vez que o robô tem completed parte A do protocolo de purificação miRNA automatizado, esvaziar o recipiente de resíduos e remover os plásticos usados ​​e contentores de reagentes a partir do sistema robótico.
    4. Fechar as tampas em todos os tubos de micro-centrífuga contendo ARN eluído e colocá-los na placa de agitador. Selecione "Blood miRNA Parte B" do menu de seleção de protocolo para incubar as amostras a 65 ° C durante 5 min.
    5. Uma vez que o robô foi concluída em execução Parte B do protocolo de purificação miRNA, retire imediatamente as amostras e chill-los no gelo.
  5. Quantificar e avaliar a qualidade do RNA purificado utilizando um espectrofotómetro.
    NOTA: De acordo com as recomendações do protocolo para o ensaio de miRNA, uma concentração mínima de 33 ng / mL é necessária, e todas as amostras devem atender ou exceder um rácio 280/260 de 1,9 e uma 260/230 rácio mínimo de 1,8 para garantir a ausência de contaminação orgânica significativa, o que pode afetar o desempenho do ensaio (ver referência 17).
  6. Armazenar as amostras à temperatura de -80 o C.

3. miRNA Preparação de Amostras

  1. Normalizar a 12 amostras de RNA a 33 ng / mL usando água livre de nuclease.
  2. Prepara-se uma diluição 1: 500 dos controlos de miARN fornecidos no kit de ensaio que utiliza a água isenta de nuclease. Manter em gelo.
  3. Preparar a mistura de mestre de recozimento: combinar 13 ul de tampão de emparelhamento (fornecida), 26 ul de reagente de miRtag (fornecida) e 6,5 ul de controlos de miARN (preparado no passo 3.2), utilizando pipetas 10 e 20-ul.
  4. Utilizando uma pipeta de 10 ml, adicionar 3,5 mL da mistura principal de recozimento e 3 ul da amostra de RNA (isto é, 100 ng) de cada um dos doze 0,2 ml tubos de tira. Flick para misturar, spin para baixo, usando uma bancada mini-microcentrifuge (2.000 xg), e coloque no termociclador (94 o C durante 1 min, 65 ° C durante 2 min e 45 ° C durante 10 min; segure a 48 o C) .
  5. Prepare a mistura principal ligação através da combinação de 3 μl do tampão de ligação (fornecida) e 19,5 uL de polietilenoglicol (PEG; fornecido) utilizando uma pipeta de 20 uL. Adicionar 2,5 mL da mistura principal de ligação a cada um dos tubos de tira a partir do passo 3.4, utilizando uma pipeta de 10 uL.
    1. Misture delicadamente, spin para baixo, usando um mini microcentrífuga de bancada (2.000 xg), e voltar para o termociclador a 48 ° C durante 5 min. Depois de 5 minutos, utilizando uma pipeta de 10 ml, adicionar 1 ul de ligase directamente a cada tubo no termociclador e incubar a 48 ° C durante 3 min, 47 ° C durante 3 min, 46 ° C durante 3 min, 45 ° C, durante 5 min, e 65 ° C 10 min; segure a 4 o C.
  6. Retirar os tubos do termociclador, misturá-los com cuidado, spin-los para baixo, usando uma bancada mini-microcentrifuge (2.000 xg), e adicionar 1 ml de ligação enzimática de limpeza (fornecido). Incubar os tubos no termociclador (37 ° C durante 1 hora e 70 ° C durante 10 min; mantenha a 4 o C). Usar uma pipeta de 10 uL.
  7. Retirar os tubos e, com uma pipeta de 100 mL, adicionar 40 mL de água livre de nuclease, misturar e girar para baixo, usando um mini microcentrífuga de bancada (2000 xg).

4. miRNA Hibridização

  1. Descongelar o repórter e conjuntos de sondas de captura (fornecidas) no gelo e colocá-los para baixo, usando um mini microcentrífuga de bancada (2000 xg).
  2. Usando uma pipeta de 200 uL, adicionar 130 ul de tampão de hibridação para o tubo de conjunto de códigos repórter (130 uL) para criar a mistura principal de hibridação. Misture e girar para baixo, usando um mini microcentrífuga de bancada (2000 xg).
    NOTA: Repórter e captura sondas são específicos e padrão para cada miRNA incluído no painel. painéis personalizados e de captura e sonda conjuntos desenhado pelo usuário podem ser projetados.
  3. Em 12 novos 0,2 ml tubos de tiras, adicionar 20 ul da mistura principal hibridação utilizando uma pipeta de 20 mL.
  4. Desnaturar as amostras de miRNA a partir do passo 3.7 em 85 o C for 5 min e resfriá-los no gelo. Adicionar 5 uL de cada um dos tubos a partir do passo 4.3, utilizando uma pipeta de 10 uL.
  5. Programe o termociclador a 65 ° C em um 30-ul temperatura e tampa aquecida no sempre ajuste de tempo (não programá-lo para rampa até 4 ° C no final da corrida) calculado pelo volume.
  6. Com uma pipeta de 10 mL, adicione 5 mL da sonda de captura definido para cada tubo, misturar, spin para baixo, usando uma bancada mini-microcentrifuge (2.000 xg), e imediatamente colocar no termociclador a 65 o C. Incubar durante pelo menos 12 horas e não mais de 30 horas.

Estação Prep 5. e analisador digital

  1. Coloque a estação de preparação.
    1. Abra a porta da estação e carregar as placas de reagentes (fornecido), cartucho (fornecido), pontas de pipeta (fornecidas), amostras preparadas em doze 0,2 ml tubos de tira, e doze vazios tubos de tiras de 0,2 ml (fornecido). Retire as tampas de tubos de tiras e cobertura da placa reagente. Feche a prep-stationporta e executar o ensaio apropriado a partir do painel de controlo.
      Nota: O processamento pós-hibridação é a mesma, independentemente de o ensaio ser executado. Todos os reagentes e de produtos de plástico são pré-embalados e não requerem nenhuma preparação, com excepção trazê-los à temperatura ambiente e centrifugando as placas de 96 poços contendo reagente a 2000 xg durante 2 min. Todos os componentes são carregados em posições claramente definidas na estação prep. Veja Materiais suplementares para obter uma descrição dos procedimentos automatizados.
  2. Visualizar e contar os códigos de barras dos complexos tripartidos imobilizadas e orientados.
    1. Remova o cartucho da estação de preparação, selá-lo com as lamelas fornecidos, e colocá-lo no analisador digital no compartimento acima da óptica câmera.
    2. Selecione o ensaio apropriado (ensaio painel miRNA) ea versão de ensaio indicada no kit de ensaio e executar o programa.
      NOTA: O analisador digital, então toma campo da visualização de imagens para cada posição da amostra at quatro comprimentos de onda de excitação, permitindo que os códigos de barras fluorescentes para ser lido e decodificado. códigos de barras específicos, correspondendo a um miARN específico, são contados.
    3. Exportar os arquivos de dados para uma porta USB ou diretamente no servidor através de uma ligação à Internet.

6. Tratamento e Análise de Dados

  1. Clique na aba "dados brutos" e selecione "Importar RCC Files". Selecione a pasta que contém arquivos de RCC (arquivos de dados brutos) a partir do USB.
  2. Clique em "Next", selecione todas as caixas de QC, e clique em "Importar".
  3. Clique na aba "New Study". Nomear e descrever o estudo e salvar.
  4. No novo estudo, selecione a guia "New Experiment" e nomear e descrever a nova experiência. Clique em "Next" e selecione a pasta RLF no painel esquerdo que contém os arquivos de dados brutos relevantes que foram enviados. Uma vez que tenha sido selecionado, clique em "Manter Selecionados" e clique em "Next".
  5. Adicionaranotações se desejado e clique em "Next".
  6. Selecione o método de subtracção do fundo; quer controle negativo, em branco subtração pista, ou uma subtração definida pelo usuário pode ser selecionado. Uma vez selecionado, clique em "Next".
    NOTA: Determinar a abordagem de correcção de fundo mais adequado com base nos parâmetros técnicos e contexto biológico do estudo.
    NOTA: As contagens são menos precisas para alvos de baixa abundância. Para os propósitos do estudo, descrevemos aqui, os dados foram processados ​​em primeiro lugar, sem correcção de fundo, a fim de examinar os parâmetros QC e para examinar variação em contagens para miARN de diferentes abundâncias nas repetições técnicas. Os dados foram então reprocessado usando um limiar de fundo 25-contagem.
  7. Selecione a opção "Top 100" normalização e clique em "Next".
  8. Para obter os dados de relação, selecionar os parâmetros de relação e clique em "Next".
  9. Clique em "Concluído".
  10. Clique na ex nomeadoperiment no painel esquerdo para revelar um menu suspenso contendo "Raw", "normalizado", "Rácio de dados" "Agrupados" e "Análise de Dados".
  11. Clique em "dados brutos" e observar um relatório QC no painel da direita. Observar uma bandeira ao lado das amostras que não passam os parâmetros de CQ padrão. Construir um novo "Estudo", que não inclui as amostras sinalizadas e reprocessar como descrito, ou simplesmente excluir amostras sinalizadas QC da etapa de análise de dados, selecionando "Excluir amostras de bandeira / normalização QC".
    1. Export "Raw", "normalizado", ou arquivos de dados "agrupados" em CVS ou outro formato de arquivo compatível para análise em outro software estatístico ou microarray.
  12. Selecione "dados normalizados" no painel à esquerda e selecione as amostras a serem incluídos na análise no painel da direita.
  13. Clique em "Análise" e selecione o tipo de análise pretendida (por exemplo, "Mapa de Calor & #34 ;, "Violino Plot", "Box Plot", "Dispersão", ou "Histograma Plot"). Marque as caixas de critérios de exclusão desejados (por exemplo, excluir as amostras discrepantes ou genes, excluir as amostras por bandeiras QC, excluir os genes de controle e / ou excluir as sondas de normalização de análise de dados).
  14. Seleccionar amostras individuais a serem excluídos da análise, como desejado.
  15. Selecione genes individuais a serem excluídas ou incluídas na análise se o desejar.
  16. Selecione os parâmetros para a manipulação estatística ou visualização de dados selecionado e clique em "Finish".

Resultados

perturbação transcriptomic em distúrbios funcionais podem ser subtis, e, a fim de detectar de forma fiável essas alterações subtis na expressão, a quantificação de expressão de gene deve ser mais preciso. O sistema de ensaio plataforma de expressão do gene reduz o ruído técnico através de sua natureza altamente automatizado, ea química única que utiliza produz dados de expressão gênica de alta precisão. Técnico repetições mostrado na Figura 1 demonstram a alta reprodutibilidade em ambos os endógenos (pontos azuis) e miRNA viral (pontos laranja; genes de limpeza são representados por pontos amarelos) quantificação de expressão que é possível utilizando este método. Usando este método, viral (Figura 2a) e endógena (Figura 2b) miARNs que mostram o desvio a partir da expressão esperado, tal como definido pelos participantes do estudo saudáveis, podem ser identificadas como alvos de interesse na IBS. Deve notar-se que não é claro se os miARNs viraisdetectado aqui derivar a partir de genes virais integrados no genoma humano ou de carga viral. Como o ensaio só conta miRNAs maduros com especificidade de nucleotídeo único, hibridação cruzada com miRNAs humanos endógenos similares é improvável. No entanto, diferenciais níveis de estado estacionário destas moléculas são de interesse como biomarcadores. A precisão do método permite a perturbações entre alvos baixa expressão a ser detectado, como a detecção precisa destes transcritos não são inundados por transcritos mais abundantes. Perturbações subtis também pode ser observado de forma fiável. As Figuras 3 e 4 mostram algumas destas perturbações na circulação miARNs em IBS e IBS-subtipos em comparação com controlos saudáveis, e as Figuras 5 e 6 (ambos adaptados a partir de 3) mostram os dois miARNs diferencialmente elevadas mais significativos (Figura 5: miARN 342-3p, Figura 6: miARN 150). participantes na IBS Figura 6 é um exemplo de saída gráfica dos resultados gerados pelo software associado.

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. Figura 1: Contagens normalizadas de duas repetições Técnicos repetições executado em dois cartuchos separados mostram elevada correlação linear (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) em toda a gama do normalizada (normalizados para o top 100 expressa miRNAs) miRNA contagens (contagens log2 no X e do eixo y). O gráfico de dispersão inclui dados para miRNAs humanos endógenos em azul (654 miRNAs), miRNAs virais endógenos em laranja (80 miRNAs) e genes de limpeza em amarelos (8 genes). miRNAs virais endógenos estavam disponíveis em versões anteriores do ensaio (versão 1.4 foi usada aqui), mas não estão incluídos no ensaio padrão, embora eles estão disponíveis como adições feitas sob encomenda./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2:. As contagens normalizadas de infecções virais ou endógenos miARNs humano em IBS-obstipação (IBS- C) em comparação com controlos saudáveis perturbações na (a) viral (alaranjado) e (b) miARNs endógenos humanos (azul) são evidentes no presente exemplo, onde contagens de miARN (log2) transformadas de participantes SII-C (eixo dos y) são correlacionados com as contagens de miARN (log2 transformadas) de controlos saudáveis ​​(eixo-X). A maioria dos miRNAs expressar de forma muito semelhante em ambas as populações, mas alguns nomeadamente desviar-se da correlação. Estes desvios são evidentes entre ambas as metas raras e abundantemente expressos. Por favor,clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3:. MiRNAs são significativamente e uniformemente diferencialmente expressos em IBS comparação com controles saudáveis diferencialmente expressos miRNAs em IBS são revelados utilizando o método de tamanho linear discriminante efeito de análise, que combina testes de significância estatística com verificações de consistência dentro das categorias. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4:. MiRNAs são significativamente e uniformemente diferencialmente expressos em IBS subtipos comparação com controles saudáveis miRNAs foram differentially expressa em IBS-subtipos (-D: diarreia, -C: prisão de ventre). comparação com controles saudáveis, utilizando o método de tamanho linear discriminante efeito de análise, que combina testes de significância estatística com verificações de consistência dentro das categorias Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

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Figura 5:. Expressão diferencial de miRNA-342-3p dor abdominal crônica de etiologia desconhecida, é o principal sintoma de IBS. O gráfico de caixa mostra que miR-342-3p (contagens normalizadas no eixo y), um miRNA associado com dor na bexiga crônica de etiologia desconhecida, foi encontrado para estar presente em circulação com contagens mais elevadas em todos os subtipos de IBS em comparação com controles saudáveis. As barras representam o intervalo não-outlier, a caixaes do intervalo inter-quartil e o quadrado azul a contagem mediana. Modificado de 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Expressão Diferencial de miARN-150 Uma trama violino demonstrando que IBS participantes tinham significativamente mais elevada que circula o miR-150 contagens em comparação com controlos saudáveis (contagens log2 transformadas no eixo dos Y).. As curvas indicam a frequência de contagem na categoria, as barras verticais representam o 1º e 3 quartis, eo quadrado vermelho indica a contagem média. Modificado de 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

Para o ensaio de miARN em particular, é crítica a não utilizar lisados ​​não purificados (estes podem ser utilizados em ensaios de proteína e ARNm), tal como os reagentes não foram optimizados para a utilização com lisados, e as reacções de preparação de amostras são susceptíveis de ser inibida. Além disso, os contaminantes transitar de passos de lise e purificação de ARN (por exemplo, compostos de guanidina, etanol, e fenóis) podem inibir reacções de ligação e de purificação da amostra. RNA de boa qualidade é, portanto, fundamental para a sensibilidade e precisão do ensaio miRNA.

Usando um termociclador com uma tampa aquecida é crítico para assegurar o controlo da temperatura apropriado para optimizar o desempenho de todos os passos de reacção. Durante o passo 3.5.1, é importante para não remover as tiras do termociclador, a fim de manter a temperatura durante a adição da ligase. A remoção das tiras para adicionar a ligaseirá comprometer a reação. Ao executar as etapas de hibridização, é fundamental para evitar a agitação vigorosa, pipetagem, ou tocar rapidamente quando a mistura de reagentes nos tubos, pois isso pode distorcer as sondas repórter. Para garantir o melhor desempenho e consistência, é importante para misturar reagentes nos tubos sacudindo suave. Sempre girar reações após a mistura, e usar uma nova pipeta de ponta cada vez que um reagente é dispensado para assegurar pipetagem precisa e para evitar a contaminação cruzada acidental.

Modificações e resolução de problemas

Os conjuntos de códigos pode ser personalizado para incluir apenas os alvos de interesse. Desta forma, os custos podem ser equilibrada para permitir o teste de grandes conjuntos de amostras quando se investiga mais ou validando um bio-assinatura. Sondas personalizadas podem ser projetados para genes ou não alvos disponíveis a partir do menu à la carte. Sensibilidade para alvos menos abundantes ou RNA baixa concentração pode sermanipulado por permitindo um tempo mais longo de hibridação e / ou por meio de contagem digital de resolução mais alta.

Em nosso estudo utilizamos o painel predefinido miRNA 800 alvo com RNA total a partir de sangue total; no entanto, os ensaios podem ser personalizados para incluir menos miRNAs se é necessária uma abordagem mais centrada. Um total de 24 amostras pode ser preparado num único dia, escalonados em dois conjuntos de 12, porque dois cartuchos pode confortavelmente ser passado através do processamento pós-hibridação na estação de preparação robótico e fotografada no analisador digital, o dia seguinte. processamento escalonado das amostras em lotes de 12 é importante padronizar o tempo de hibridação. Cartuchos que foram fotografadas podem ser salvos e armazenados a 4 ° C a ser digitalizado novamente caso de análises de dados sugerem que uma varredura de resolução mais alta pode melhorar a detecção de miRNAs mais raros. A detecção de moléculas mais raras podem também ser melhorada por hibridação de amostras durante mais tempo; No entanto, a hibridação pode prolongada Result em sobressaturação e só pode melhorar os resultados se as concentrações de ARN de partida são baixos (como em RNA derivado de vesículas extracelular). sensibilidade e precisão da plataforma permitem que relativamente miRNAs baixa abundância para ser contado de forma confiável.

Limitações da técnica

A plataforma de ensaio de expressão do gene descrito só acomoda até 800 alvos por matriz. Por conseguinte, não é adequado para toda miRNA-transcriptoma / estudos de transcriptoma inteiras. Apenas conhecido, descrito, e os alvos especificados podem ser detectados utilizando a plataforma, de modo que não é adequado para a descoberta de novas espécies moleculares. Outros métodos, como RNA-Seq ou outros métodos de microarray tradicionais, são mais adequados para estudos exploratórios toda transcriptoma.

Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos

O IBS é caracterizado por uma combinação de sintomas, principalmente incluindo dor abdominal; hipersensibilidade visceral; e alterações nos hábitos intestinais, tais como diarreia frequente, constipação, ou uma combinação de ambos 9,10. IBS sintomas não têm nenhuma causa orgânica conhecida, e os pacientes não apresentam com a inflamação clinicamente significativo, perturbações histopatológicas de tecidos gastrointestinais, ou marcadores sistêmicos 9-12. A pesquisa sugere que a desregulação biológica em IBS é sutil, subclínica e heterogêneo, com temas comuns emergentes em torno de inflamação e função imunológica 10. Portanto, é necessário para controlar variação introduzida-experimentador e usar uma plataforma que foi capaz de detectar com fiabilidade perturbações sutis na expressão do gene. Os atributos exclusivos do ensaio e sistema de padronizar o processamento da amostra e reduzir experimentador manipulação por meio da automação, reduzindo variância técnica para produzir dados altamente reproduzíveis. Estas características permitem investigações focadas e produzir altamente preciso e rdados eplicable. Isto permite a detecção de perturbações subtis e perturbações entre os alvos de baixo de expressão que pode ser negligenciado ou sobrecarregadas com os sinais de alvos mais abundantes ao usar intensity- ou amplificação baseada em métodos. microarrays baseados em PCR e métodos de RNA-Seq são alternativas viáveis ​​para o uso da plataforma descrito e pode ser atraente como alternativa quando débitos mais elevados são necessários ou quando o objetivo é caracterizar o transcriptoma completo ou procurar novas moléculas. No entanto, as alternativas podem não funcionar tão bem em precisão e sensibilidade detectar e quantificar metas raras e perturbações sutis.

Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica

Circulando expressão miRNA em participantes IBS mostrou uma série de perturbações que foram encontrados para ser significativa e consistente dentro das categorias. Os miARNs identificados foram associados com pathwa relevanteys e condições patológicas, incluindo uma condição funcional dor (miR-342-3p: dor crônica da bexiga) 8 e inflamação (miR-150) 13. O estudo exemplo foi baseado em uma coorte exploratória utilizada para definir metas e sistemas de interesse. Uma disposição mais específica, menor miRNA foi então construído, diminuindo o custo por amostra e permitindo a grupos muito maiores para serem analisados ​​de uma forma rentável, a fim de validar e refinar assinaturas e biomarcadores. O sistema de ensaio plataforma de expressão do gene estabelece um equilíbrio entre a natureza exploratória tradicional do microarray e mais orientada, a coleta de dados orientado a hipótese para refinar e testar assinaturas moleculares e biomarcadores 14-16. O método vai ser usado para examinar e perturbações moleculares de proteínas in vivo e em modelos in vitro, onde os miARN alvo descritos são experimentalmente sobre-expressos ou inibida. Novos ensaios de permitir a quantificação simultânea de ARNm e Proteins directamente a partir de lisados ​​celulares e de tecidos. Além disso, através da optimização da purificação de fracções específicas de sangue periférico e excrementos (por exemplo, urina) e por a personalização e optimização de certos parâmetros de ensaio, os perfis moleculares e assinaturas das fracções de concentração de baixo peso molecular (por exemplo, fracções exosomal) será examinada.

Divulgações

W.A.H., S.K.A, N.H.F. e R.M.P. detêm uma patente nos EUA (nº. PCT/US14/38638) para uma assinatura de miRNA circulante de SII emanada da pesquisa aqui descrita.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o financiamento do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, dos Institutos Nacionais de Saúde, do Instituto Nacional de Pesquisa em Enfermagem e da Divisão de Pesquisa Intramural para Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; os Prêmios de Treinamento em Pesquisa Intramural para Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey e Leeanne B. Sherwin; e apoio especial do Burroughs Wellcome Fund para Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.

As opiniões aqui expressas e a interpretação e relato desses dados são de responsabilidade do(s) autor(es) e não devem ser vistas como uma recomendação, interpretação ou política oficial dos Institutos Nacionais de Saúde ou do Governo dos Estados Unidos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
nCounter Prep-StationNanostringN/AAnalisador
Digital Essencial nCounterNanostringN/A
EspectrofotômetroNanoDropND-1000Pode usar
CentrífugaQualquerN/APode usar
MiniMicroCentrifugeQualquerN/APode usar
pipetas equivalentes adequadas (1.000, 100, 20, 10 µ l)QualquerN / APode usar o equivalente adequado
QiacubeQiagen9001292Pode usar
equivalente adequado PAXgene Blood miRNA KitQiagen763134Pode usar
tubos de sangue PAXgene equivalentesVWR77776-026Pode usar o equivalente adequado
nCounter Kit de ensaio de miRNA humanoNanostring150625Essential
nCounter Master KitNanostring100050Essential
nSolverNanostringN/AEssential
Essencial equivalente adequada equivalente adequado o adequados

Referências

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