Artigo de método

LED Thermo Flow - Combinando optogenética com Citometria de Fluxo

DOI:

10.3791/54707

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30 de dezembro de 2016

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1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

Neste artigo

Resumo

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Substâncias opticamente controladas são ferramentas poderosas para estudar as vias de sinalização. Para expandir o espectro de experimentos possíveis, desenvolvemos um dispositivo para estudar substâncias opticamente controladas em tempo real usando citometria de fluxo: o LED Thermo Flow.

Resumo

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As ferramentas optogenéticas permitem investigações funcionais isoladas de quase qualquer molécula de sinalização dentro de vias de sinalização complexas. Um grande obstáculo é a entrega controlada de luz à amostra de células e, portanto, as ferramentas mais populares para estudos optogenéticos são análises celulares baseadas em microscopia e experimentos in vitro. O citômetro de fluxo tem grandes vantagens sobre um microscópio, incluindo a capacidade de medir rapidamente milhares de células com resolução de célula única. No entanto, ainda não é amplamente utilizado em optogenética. Aqui, apresentamos um dispositivo que combina o poder da optogenética e da citometria de fluxo: o LED Thermo Flow. Este dispositivo ilumina células em comprimentos de onda, intensidades de luz e temperaturas específicas durante as medições de citometria de fluxo. Pode ser construído a baixo custo e ser usado com os citômetros de fluxo mais comuns. Para demonstrar sua utilidade, caracterizamos a cinética de fotoscomutação das proteínas Dronpa in vivo e em tempo real. Este protocolo pode ser adaptado a quase todas as substâncias opticamente controladas e expande substancialmente o conjunto de experimentos possíveis. Mais importante, simplificará muito a descoberta e o desenvolvimento de novas ferramentas optogenéticas.

Introdução

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Optogenetic ferramentas têm vindo a ganhar popularidade, em parte, porque podem ser usadas para decifrar a fiação das vias de sinalização 1-4. Eles baseiam-se na capacidade das proteínas fotoactiváveis ​​para alterar a sua conformação e ligação de afinidade quando iluminada com luz. Combinando estas proteínas de elementos de sinalização permite a regulação específica de um único jogador dentro de complexas vias de sinalização intracelular 5-12. Consequentemente, uma via de sinalização pode ser estudada com alta resolução temporal e espacial.

A maioria dos estudos optogenetic baseados em células utilizam métodos baseados em microscopia combinados com a cultura na presença de luz, seguido por análise bioquímica 11,12. Em contraste, um citómetro de fluxo singulariza células ao longo de um capilar e mede o tamanho da célula, granularidade e intensidades de fluorescência. Este método tem grandes vantagens em relação a microscopia ou bioquímicos métodos, incluindo a capacidade de analisar thousands de células na resolução de uma única célula vivendo em um tempo muito curto. Por isso, é desejável combinar Optogenetics com a citometria de fluxo.

Para nosso conhecimento, não existe um protocolo estabelecido para citometria de fluxo optogenética. Um procedimento amplamente aceito é iluminar manualmente células de fora do tubo de reacção com dispositivos lanterna. No entanto, a iluminação manual no fluxo requer citómetro que a luz passe através do tubo de reacção e, para a imagem de células vivas, uma forma cilíndrica, da câmara de água aquecida. Isto faz com que a dispersão de luz substancial e perda de luz. Além disso, a intensidade da luz fornecida pela iluminação manual não é reprodutível entre experiências (ângulo, a distância, etc.) e não há um limite prático para o número de comprimentos de onda em um experimento.

Ao construir o dispositivo LED Thermo Flow, fomos capazes de superar essas limitações. Com este dispositivo, as células podem ser iluminados com determinados comprimentos de onda em um tempforma durante as medições de citometria de fluxo controlado-ratura. Isto permite a quantidades precisas e reprodutíveis de luz dentro e entre experimentos.

Para demonstrar a utilidade do nosso dispositivo in vivo, nós gravado o sinal de fluorescência de Dronpa em células B Ramos durante photoswitching. células B Ramos são derivados a partir de um linfoma de Burkitt humano. Dronpa é uma proteína fluorescente que existe como um monómero, dímero ou tetrâmero. Na sua forma monomérica, é não fluorescente. Iluminação com 400 nm de luz induz dimerização e tetramerização e torna a Proteína Fluorescente Dronpa. Este processo pode ser invertido por iluminação com luz de 500 nm. A proteína Dronpa tem sido utilizado para controlar a função e localização de proteínas de sinalização 4,13.

Aqui, nós expressa uma proteína Dronpa-Linker-Dronpa em células B Ramos para estudar photoswitching de Dronpa em um citômetro de fluxo. Usando o nosso dispositivo, fomos capazes de forma eficiente ereproducibly PHOTOSWITCH Dronpa durante a gravação de sua intensidade de fluorescência em tempo real. Este método oferece vantagens substanciais através de protocolos de iluminação atuais com iluminação manual e amplia significativamente o repertório experimental para obter ferramentas optogenética e compostos gaiola. Usando o nosso dispositivo será significativamente simplificar e acelerar a descoberta e desenvolvimento de novas ferramentas optogenética.

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Protocolo

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1. Desenho e Construção do Dispositivo

  1. As experiências-piloto
    NOTA: A intensidade da luz necessária para uma ferramenta e célula do tipo optogenetic específico podem variar significativamente. experiências-piloto com protótipos são úteis para estimar a intensidade da luz mínimo necessário. A ferramenta optogenetic utilizado para as experiências seguintes é uma construção de fusão Dronpa-Ligante-Dronpa. A sequência Dronpa foi obtido comercialmente (Veja Lista de Materiais). Um longo ligante foi clonado entre duas sequências Dronpa para permitir a construção de expresso para formar dímeros intramoleculares (e intermoleculares). As etapas descritas abaixo pode ser adaptado a muitas outras ferramentas optogenetic ou substâncias opticamente controlados.
    1. Transduzir linfócitos B Ramos com uma construção contendo Dronpa-Ligante-Dronpa seguindo as instruções do fabricante para a transdução usando o sobrenadante retroviral contendo-a partir de células de empacotamento. Colheita e contagem de células de acordo com um prériormente publicada protocolo 13.
    2. Ressuspender as células a uma concentração de 1 x 10 6 / mL em meio (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM de L-glutamina inactivado pelo calor, 100 U / mL de penicilina, 100 U / mL de estreptomicina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol) e transferi-los para um tubo de FACS de vidro.
    3. Inserir o tubo num citómetro de fluxo e medir a intensidade de fluorescência de Dronpa (canal GFP) 14,15.
    4. Usar óculos de proteção para todas as novas medidas para proteger os olhos de comprimentos de onda, possivelmente prejudiciais.
    5. colocar manualmente uma luz LED 500 nm na parte exterior do tubo e continuar a medição da intensidade de fluorescência de Dronpa.
    6. Aumentar o número e / ou intensidade das luzes LED até Dronpa intensidade de fluorescência diminui.
    7. colocar manualmente uma luz LED 400 nm na parte exterior do tubo e continuar a medição da intensidade de fluorescência de Dronpa.
    8. Aumentar o número e / ou intensidade das luzes LED até o fluo Dronparescência intensidade aumenta.
    9. Use pelo menos tantas luzes LED para a construção do dispositivo, como previsto para ser necessário a partir do photoswitching nos passos 1.1.5 e 1.1.7.
  2. Construindo o dispositivo
    NOTA: O dispositivo foi construído por uma loja de usinagem profissional, o Technik Arbeitsgruppe da Universidade de Freiburg. A maioria das peças são feitos e não comercialmente disponíveis. As dimensões exactas de cada parte está representada nas Figuras 1 e 2. Para esclarecer a montagem deste dispositivo, Suplementar Video 1 é fornecido e os passos mais importantes são descritos abaixo.
    1. Um moinho peça a partir de cloreto de polivinilo (PVC) com as medidas exactas mostradas na Figura 1A.
    2. Insira luzes LED nos orifícios perfurados de peça A e selar cada buraco com cola de PVC para evitar fugas de água.
    3. Ligue LEDs a um transformador multicanal (cada comprimento de onda deve ocupar um elá separadael) com uma potência de saída ajustável de 0-29 mA.
    4. Anexar a bainha exterior (B) com 3 parafusos a peça A, tal como descrito para proteger os LEDs de danos físicos.
    5. Para ser capaz de ligar o dispositivo a uma bomba de água, cola, os grampos de tubo (C) nos orifícios perfurados da peça A (representada na Figura 1a, secção transversal Y: 9 mm e 61,5 milímetros) utilizando cola de PVC.
    6. Corte um tubo de Plexiglas longa 58,5 mm (D1).
    7. Fabricar peças D2 e D3 de vidro orgânico tal como representado na Figura 2.
    8. pedaço de cola D3 para a parte inferior de D1 com Plexiglas cola.
    9. Anexar uma borracha O-ring para peça D2 e ​​cola-lo para o topo da D1 com Plexiglas cola.
      NOTA: As peças de D1, D2 e ​​D3 em conjunto, formam parte D.
    10. Insira peça D na peça A com 3 parafusos.
    11. Teste o dispositivo de vazamento de água antes de aplicar energia ao transformador.

2. medição da cinética de uma ferramenta de optogenética

  1. Prepare células
    1. células B Ramos Cultura em meio RPMI-meio (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina inactivado pelo calor, 100 U / mL de penicilina, 100 U / mL de estreptomicina, e 50 uM de 2-mercaptoetanol) a uma densidade de 3- 10 x 10 6 células / ml a 37 ° C e 5% de CO 2.
    2. Colheita células B Ramos por centrifugação a 350 xg e 4 ° C durante 5 min.
    3. Contagem de células utilizando uma câmara de contagem Neubauer, seguindo as instruções do fabricante e ressuspender 1-5 x 10 6 células em 600 uL forma.
    4. Transferência das células para um tubo FACS vidro, colocá-los no gelo e protegê-los da luz até a medição.
  2. Prepara-se o citómetro de fluxo e o dispositivo.
    1. Ligue o dispositivo a uma bomba de água aquecida e ajustar a temperatura para 37 ° C.
    2. Ao usar tubos de FACS de vidro, trocar o anel em O preto do citómetro de fluxo com uma borracha O-ring e adicionalmente aplicar gr silíciofacilidade.
  3. Medição
    1. Insira cuidadosamente o tubo de FACS de vidro para dentro do dispositivo e conecte-o citômetro de fluxo (Figura 3).
    2. Inicie a medição e registro Dronpa intensidade de fluorescência (canal GFP).
    3. Iluminar a amostra de células com 400 nm ou 500 nm de luz, respectivamente, e registrar a intensidade de fluorescência Dronpa (canal GFP).
  4. Análise de dados
    1. Analisar os dados experimentais com fluxo adequado citômetro software. Gráfico de dispersão para a frente contra dispersão sideward e portão as células vivas. Traça-se a intensidade de fluorescência Dronpa ao longo do tempo.

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Resultados

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Usando o fluxo Thermo LED com um citômetro de fluxo

O núcleo funcional do dispositivo é uma câmara cilíndrica, em que as luzes LED estão dispostas de uma maneira circular, apontando para dentro. Esta câmara pode ser ligado a um abastecimento de água e a bomba, o que permite controlar a temperatura dos LEDs, bem como a amostra de células. Os LEDs são ligados a um transformador e, por conseguinte, a intensidade da luz de cada comp...

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Discussão

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A Thermo Fluxo de LED é um dispositivo inovador para estudar ferramentas optogenética em um citômetro de fluxo.

Até agora, as amostras optogenética foram iluminados apenas com lasers de microscopia ou dispositivos lanterna 11,12. Dependendo do ângulo e distância da lanterna para a amostra, uma variabilidade substancial na quantidade de iluminação está prevista entre experiências. Além disso, há um limite para o número de lanternas uma única pessoa pode operar em um experimento. Is...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos a J. Schmidt, da Universidade de Freiburg, por construir o dispositivo. Agradecemos a P. Nielsen e D. Medgyesi por seu apoio e leitura crítica deste manuscrito. Este estudo foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft através do SFB746 e pela Iniciativa de Excelência da Fundação Alemã de Pesquisa (GSC-4, Spemann Graduate School).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo FACS de vidroThermo Fisher Scientific; Waltham, EUA14-961-26 Tubos devidro borossilicato 12x75 mm
Citômetro de FluxoBD Bioscienceg; Heidelberg, AlemanhaFortessa II SpecialOrder
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Cambridge, EUA41645
PolyJetSignaGen, Rockville, EUASL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, AlemanhaHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, AlemanhaUV5TZ-400-15
Tubo de acrílico 15 mmMaertin; Freiburg, Alemanha76999
Plexiglas 3 mmMaertin; Freiburg, Alemanha692230
Plexiglas 2,5 mmMaertin; Freiburg, Alemanha692225
Plexiglas 1,5 mmMaertin; Freiburg, Alemanha692215
telha de PVC 5 mmMaertin; Freiburg, Alemanha690020.005
Telha de PVC 6 mmMaertin; Freiburg, Alemanha690020.006
Bloco de PVC 50 mmMaertin; Freiburg, Alemanha690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemanha61870-010
2-MercaptoetanolEMD; Alemanha805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, AlemanhaP30-3302
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Alemanha15140-122
Cola plexiglas AcrifixEvonic industries, Essen, Alemanha1R0192
Tangit Cola PVC-UHenkel, Dü sseldorf, Alemanha

Referências

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