Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Rocco Sciarrillo; Anna Wojtuszkiewicz; Irsan E. Kooi; Valentina E. Gómez; Ugo Boggi; Gerrit Jansen; Gert-Jan Kaspers; Jacqueline Cloos; Elisa Giovannetti

doi:10.3791/54714

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Artigo de método

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em

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DOI:

10.3791/54714

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9 de dezembro de 2016

Rocco Sciarrillo¹^,²^,³ , Anna Wojtuszkiewicz¹ , Irsan E. Kooi⁴ , Valentina E. Gómez³ , Ugo Boggi⁵ , Gerrit Jansen⁶ , Gert-Jan Kaspers¹^,⁷ , Jacqueline Cloos^*¹ , Elisa Giovannetti^*³^,⁸^,⁹

¹Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, ²Department of Hematology, VU University Medical Center, ³Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, ⁴Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, ⁵Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, ⁶Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, ⁷Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, ⁸Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, ⁹Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Resumo

A resistência aos medicamentos continua a ser um grande problema no tratamento de câncer, tanto para doenças malignas hematológicas e tumores sólidos. resistência intrínseca ou adquirida pode ser causada por uma variedade de mecanismos, incluindo aumento da eliminação da droga, diminuição da absorção da droga, a inactivação de drogas e alterações de alvos de drogas. Dados recentes mostraram que diferente de pelo conhecido genética (mutação, amplificação) e modificações epigenéticas (hipermetilação DNA, histonas pós-translacional modificação), mecanismos de resistência a drogas também pode ser regulada por aberrações splicing. Este é um campo de rápido crescimento de investigação que merece atenção futuro, a fim de planejar abordagens terapêuticas mais eficazes. O protocolo descrito no presente trabalho tem como objetivo investigar o impacto de splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de vários modelos in vitro através de RNA-seq e estabelecerEd um qRT-PCR baseado método para validar os genes candidatos. Em particular, foi avaliada a splicing diferencial da DDX5 e PKM transcrições. O splicing aberrante detectado pela ferramenta computacional PAD foi validado em células leucémicas, que mostra que diferentes variantes de splicing DDX5 são expressos nas células resistentes comparada parental. Nestas células, observaram-se também uma maior proporção PKM2 / PKM1, que não foi detectada na Panc-1 homólogo gemcitabina resistente em comparação com as células parentais Panc-1, sugerindo um mecanismo diferente de resistência à droga-induzida pela exposição a gemcitabina.

Introdução

Apesar dos avanços consideráveis no tratamento do cancro, a resistência de células malignas à quimioterapia, quer intrínseca ou adquirida após exposição prolongada da droga, é a principal razão para o insucesso do tratamento de uma vasta gama de leucemias e tumores sólidos ^1.

Para delinear os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos, em modelos de linhas celulares in vitro são desenvolvidos por selecção gradual de células cancerosas resistentes a agentes quimioterapêuticos. Este procedimento imita os regimes utilizados nos ambientes clínicos e, portanto, permite a investigação aprofundada dos meca....